Name: label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling
Uploaded: 2019-11-17T12:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

Detta arbete stöddes av en stor utmaning bidrag till W.M.O. från Linda Crnic Institute for Down syndrom och av en DARPA samarbetsavtal 13-34-RTA-FP-007. Vi skulle vilja tacka Jesse Kurland och Kira Cozzolino för deras bidrag i läsning och kommentera manuskriptet.

<ol>
	<li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+interaction+landscape+of+the+human+CMGC+kinase+group.">The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group.</a> Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).</li><li>Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Affinity+Tags+for+Protein+Purification.">Overview of Affinity Tags for Protein Purification.</a> Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).</li><li>Mahmood, N., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+'nonspecific'+protein+detected+by+a+His-tag+antibody+is+human+transcription+regulator+YY1.">An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1.</a> Data in Brief. 2, 52 (2015).</li><li>Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+the+ends:+internal+epitope+tagging+of+proteins+using+transposon+Tn7.">Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7.</a> Genetics. 200, 47-59 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10, 715-721 (2013).</li><li>Bronicki, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+new+cases+further+delineate+the+syndromic+intellectual+disability+phenotype+caused+by+mutations+in+DYRK1A.">Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A.</a> European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).</li><li>Antonarakis, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+syndrome+and+the+complexity+of+genome+dosage+imbalance.">Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance.</a> Nature Reviews Genetics. , (2016).</li><li>Dowjat, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy-driven+overexpression+of+DYRK1A+kinase+in+the+brain+of+subjects+with+Down+syndrome.">Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome.</a> Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).</li><li>Fotaki, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyrk1A+haploinsufficiency+affects+viability+and+causes+developmental+delay+and+abnormal+brain+morphology+in+mice.">Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).</li><li>H&#228;mmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatio-temporal+and+subcellular+expression+of+the+candidate+Down+syndrome+gene+Mnb/Dyrk1A+in+the+developing+mouse+brain+suggests+distinct+sequential+roles+in+neuronal+development.">The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development.</a> European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).</li><li>Funakoshi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+human+MNB/DYRK1A+gene+induces+formation+of+multinucleate+cells+through+overduplication+of+the+centrosome.">Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).</li><li>Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+between+DYRK1A+and+DCAF7+phosphorylates+the+C-terminal+domain+of+RNA+polymerase+II+to+promote+myogenesis.">A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13, 731-740 (2016).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+A+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10, 730-736 (2013).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAINT:+Probabilistic+scoring+of+affinity+purificationg-mass+spectrometry+data.">SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 8, 70-73 (2011).</li><li>Shannon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoscape:+a+software+environment+for+integrated+models+of+biomolecular+interaction+networks.">Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks.</a> Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STRING+database+in+2017:+quality-controlled+protein-protein+association+networks,+made+broadly+accessible.">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).</li><li>Guard, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+interactome+of+DYRK1A+reveals+a+functional+role+in+DNA+damage+repair.">The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair.</a> Scientific Reports. 9, 6539 (2019).</li><li>Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iRefIndex:+A+consolidated+protein+interaction+database+with+provenance.">iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance.</a> BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).</li><li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal,+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells.">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11, 319-324 (2014).</li><li>Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Dependency+of+Cellular+Protein+Levels+on+mRNA+Abundance.">On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance.</a> Cell. 165, 535-550 (2016).</li><li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology.">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Den proteomik arbetsflöde som beskrivs här ger en effektiv metod för att identifiera högt förtroende protein interactmedlemmar för ett protein av intresse. Den här metoden minskar urvalet komplexitet genom subcellulära fraktion och fokuserar på att öka identifiering interaktion partner genom robust provberedning, offline prov städa upp och strikt kvalitetskontroll av LC-MS-systemet. Nedströms dataanalys som beskrivs här möjliggör en enkel statistisk utvärdering av de proteiner som identifierats som copurifying med betet. Men på grund av ett stort antal experimentella variabler (skala, cellinje, antikropps val), varje experiment kräver olika cutoffs och överväganden när det gäller datavisualisering och berikning.
Den första utformningen övervägande i ett IP-MS-experiment är valet av antikroppar som kommer att användas för copurification av proteinet av intresse tillsammans med dess samverkande partners. Även om tillgängligheten av kommersiella antikroppar har expanderat för att täcka större delar av den mänskliga proteomen under de senaste decennierna, finns det fortfarande många proteiner som reagenser är begränsade. Dessutom kan antikroppar som har validerats för tillämpningar som västerländsk blot-detektion vara oförmögna att selektivt berika målproteinet i ett experiment med immunoprecipitation. Innan man genomför en storskalig interaktion proteomik experiment, det föreslås att slutföra en IP från en 90% konfluenta 10 cm skålen, eller motsvarande cell nummer, och sond för målet protein av intresse genom Western blotting. Om mer än en enda antikropp är tillgänglig för immunoprecipitation, det föreslås dessutom att välja flera antikroppar erkänna epitoper inom olika delar av proteinet. Bindningen av en antikropp till ett bete protein kan ockludera det nödvändiga bindnings gränssnittet för förmodade samverkande partners. Val av en sekundär epitop för bete protein kommer att öka täckningen av interaktionsprofilen identifierats av en masspektrometri-baserade experiment.
En andra viktig faktor ligger i valet av lämplig kontroll för att särskilja hög-förtroende interaktioner från lågt förtroende eller ospecifik interaktion från dem som identifierats som copurifying med betet. Den strängaste kontrollen för ett IP-MS-experiment är att slutföra immunoprecipitation från en CRISPR KO-celllinje i betet. En sådan kontroll möjliggör identifiering och filtrering av icke-specifika proteiner som binder direkt till antikroppen snarare än bete proteinet. I de fall där det inte är möjligt att generera en CRISPR KO-celllinje av varje bete protein, kan en IgG-pärlkontroll av samma isotyp av betes antikropp användas. I experiment som sysselsätter en panel av antikroppar som representerar flera arter, kan användningen av en pärlor endast kontroll vara lämpligt, men kommer att öka andelen falska positiva identifieringar som hög-förtroende interactors.
Valet av den cellrad som används i ett IP-MS-experiment är beroende av flera nyckelfaktorer. Protein uttryck och lokalisering är till stor del beroende av celltyp. Även om RNA uttrycks uppskattningar kan hittas för de flesta gener i många vanliga cellinjer, är protein uttrycket dåligt korrelerat med RNA-uttryck och måste bestämmas experimentellt25. Cellinjer där ett bete protein uttrycks i mycket låg kopienummer bör undvikas för att kringgå problem i samband med drastiska ökningar i cellkultur skala som kan krävas. Det bör dock noteras att provberedning kan optimeras för detektion av mycket låg förekomst proteiner. Den filterstödda prov prep-metoden (FASP), samtidigt som den är robust, kan orsaka mer än 50% förlust av peptid i ett prov. Single-Pot solid-fas-förstärkt Provberedning (SP3) är en effektiv metod för att generera prover för masspektrometri analys som minimerar prov förlust26. Den ökade återhämtningen som möjliggörs av SP3-metoden för provberedning kan vara ett användbart alternativ i detta arbetsflöde för kvantifiering av proteiner som faller nära detektionsgränsen.
Denna proteomik arbetsflöde har tillämpats på många nukleära beten, inklusive kinaser, E3 ubiquitin Ligaser och ställningar medlemmar av multisubunit komplex. Förutsatt korrekt validering av antikropp reagenser, framgångsrikt genomförande av detta arbetsflöde kommer att resultera i detektion av hög-förtroende protein kärn interaktion partners för ett protein av intresse.

Den mänskliga proteomen uppvisar stora strukturella och biokemiska mångfald genom bildandet av stabila multisubunit komplex och transienta protein-protein interaktioner. Följaktligen krävs identifiering av interaktions partner för ett protein av intresse ofta i utredningar för att riva upp molekylära mekanismen. Senaste framstegen inom affinitetsrenings protokoll och tillkomsten av högupplöst snabb skanning masspektrometri instrumentering har möjliggjort enkel kartläggning av protein interaktion landskap i en enda opartisk experiment.
Protein interaktions protokoll använder ofta ektopiska uttrycks system med affinitetsmärkta fusions konstruktioner för att identifiera proteininteraktioner utan att behöva högkvalitativa antikroppar som erkänner ett protein av intresse1,2. Emellertid, epitop tagg-baserade metoder har flera nackdelar. Fysiska interaktioner med epitopen kan leda till detektion av icke-specifika copurifying proteiner3. Dessutom, fusion av dessa epitop taggar till N-eller C-terminalen av ett protein kan blockera infödda protein-protein interaktioner, eller störa proteinveckning för att främja icke-fysiologiska konformationer4. Dessutom överuttrycker ektopiska uttrycks system vanligtvis bete proteinet vid suprafysiologiska koncentrationer, vilket kan resultera i identifiering av Artifakt proteininteraktioner, särskilt för dos känsliga gener5. För att kringgå dessa frågor, kan det endogena bete proteinet immunoprecipitated tillsammans med tillhörande samverkande bytes proteiner, förutsatt tillgången på en högkvalitativ antikropp som erkänner det inhemska proteinet.
Här finns en interaktion proteomik arbetsflöde för att upptäcka den nukleära interactome av ett endogent protein med hjälp av CMGC proteinkinas DYRK1A som ett exempel. Störningar av DYRK1A kopierings nummer, aktivitetsnivå eller uttryck kan orsaka allvarliga intellektuella funktionshinder hos människor, och embryonal dödlighet hos möss6,7,8,9. DYRK1A uppvisar dynamisk spatiotemporal regulation10, och uppdelade proteininteraktioner11,12, som kräver metoder som kan upptäcka låg överflöd interaktion partner specifika för olika subcellulära fack.
Detta protokoll sysselsätter cellulär fraktionering av mänskliga HeLa celler i Cytosol och nukleoplasm fraktioner, immunoprecipitation, provberedning för masspektrometri, och en översikt av en bioinformatisk pipeline för att utvärdera datakvalitet och visualisera resultat, med R-skript som tillhandahålls för analys och visualisering (figur 1). Proteomik mjukvarupaket som används i detta arbetsflöde är alla fritt tillgängliga för nedladdning eller kan nås via ett webbgränssnitt. För ytterligare information om programvara och beräkningsmetoder finns djupgående handledningar och instruktioner tillgängliga på de länkar som tillhandahålls.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 0.1% EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone (HPLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closure</td>
			<td>Caroline Biological Supply Company</td>
			<td>684239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-47724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>887845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa QC tryptic digest</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KONTES Dounce homogenizer 7 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885301-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl endopeptidase C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin</td>
			<td>enzo life sciences</td>
			<td>ALX-350-012-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>98379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p84 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX70220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BSA Protein Digest, MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88341</td>
			<td>LCMS QC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 spin columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-89873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td>For mass spectrometry sample prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0780-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica emitter tip</td>
			<td>Pico TIP</td>
			<td>FS360-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885302-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3787K17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 150, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>Tissue culture dish for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY M-Class UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7&#181;m Spherical Hybrid (1.7 &#181;m, 75 &#181;m x 250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007484</td>
			<td>nanoflow C18 column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling

Immunoaffinity rening masspektrometri (IP-MS) har vuxit fram som en robust kvantitativ metod för att identifiera protein-protein interaktioner. Denna publikation presenterar en komplett interaktion proteomik arbetsflöde som utformats för att identifiera låg förekomst protein-protein interaktioner från kärnan som också kan tillämpas på andra subcellulära fack. Detta arbetsflöde innehåller subcellulär fraktionering, immunoprecipitation, provberedning, offline Cleanup, Single-Shot etikettfri masspektrometri, och nedströms beräknings analys och datavisualisering. Vårt protokoll är optimerat för att upptäcka compartmentalized, låg överflöd interaktioner som är svåra att identifiera från hela cellen celllysat (t. ex., transkription faktor interaktioner i kärnan) genom immunoprecipitation av endogena proteiner från fraktionerade subcellulära fack. Provet beredning pipeline beskrivs här innehåller detaljerade anvisningar för beredning av HeLa cell kärn extrakt, immunoaffinity rening av endogent bete protein, och kvantitativ masspektrometri analys. Vi diskuterar också metodologiska överväganden för att utföra storskaliga immunoprecipitation i masspektrometri-baserade interaktions profilering experiment och ge riktlinjer för att utvärdera datakvalitet för att skilja sant positivt protein interaktioner från icke-specifika interaktioner. Detta tillvägagångssätt demonstreras här genom att undersöka den nukleära interactome av CMGC Kinas, DYRK1A, en låg förekomst proteinkinas med dåligt definierade interaktioner inom kärnan.

Majoriteten av proteinmassan som identifierats i ett IP-MS-experiment består av icke-specifika proteiner. Således är en av de viktigaste utmaningarna med ett IP-MS-experiment tolkningen av vilka proteiner är hög-förtroende interactmedlemmar kontra ospecifika interactmedlemmar. För att demonstrera de avgörande parametrarna som används i utvärderingen av datakvaliteten studien analyserade tre exemplar immunoprecipitations från 5 mg hela nukleärt extrakt utnyttjar en pärla endast kontroll. Den första interna kontrollen för att säkerställa att ett IP-MS-experiment är tillförlitligt är om bete proteinet rankas som en av de högsta anrikade proteiner som identifierats av både Fold-förändring över kontroll och SAINT sannolikhet. I detta fall, betet DYRK1A rankas bland de tre berikade proteiner över kontrollen (figur 2A,B). I en nukleär interactome studie av DYRK1A utnyttjar fyra oberoende antikroppar, en FC-a cutoff av > 3.00 och Saint sannolikhet cutoff > 0,7 förutsatt en strikt cutoff för identifiering av både nya och tidigare validerade interactmedlemmar22. När det tillämpas på detta experiment, en tydlig separation kan ses mellan hög-förtroendeinteractors och > 95% av copurified proteiner identifierats som icke-specifik (figur 2A,B). Tillämpa både en faldig förändring anrikning och sannolikhet tröskel ökar stränghet genom att kräva en genomgående hög berikning av protein-ID över biologiska replikat.
Förutom statistiska scoring, den CRAPome analys arbetsflödet också kartor tidigare rapporterade interaktioner på bete-Prey data23. Även om den här mappningen kan vara användbar för tröskelvärde för höga och låga förtroende interaktioner, tidigare rapporterade interaktioner kan få dåligt resultat av FC-A och SAINT sannolikheter, potentiellt tyder på att många kända interaktioner av ett visst bete kan existera endast i specifika celltyper, sammanhang eller organeller. För exempel DYRK1A dataset var iref interactkamrat FC-A-värden så låga som 0,45, vilket motsvarade en mycket låg anrikning över kontroll (figur 2C). För att undvika att inflationen av falska positiva identifieringar, statistiska tröskelvärde bör utföras på ett sätt som prioriterar stränghet över minskning av falska negativ. Det bör noteras att upptäckten av dessa interaktioner var oberoende av protein överflöd (figur 2C). Beräknat absolutkopieringsnummer för varje iREF-interaktion inom HeLa cells visade inget samband med detekterings nivåerna hos en interaktions partner med IP-MS24.
Cytoscape fungerar som ett effektivt verktyg för att visualisera flera lager av interaktionsdata19. I DYRK1A immunoprecipitation experiment som beskrivs här, kombinerade användningen av FC-A > 3,0 och SAINT > 0,9 minskat listan över hög-förtroendeinteractors till sex proteiner (figur 2D). Men vid tillämpningen av en FC-A cutoff av > 3,0 i isolering, åtta ytterligare proteiner lades till nätverket. Dessa ytterligare protein interactmedlemmar har hög anslutning med interactmedlemmar redan i nätverket, vilket tyder på att de är associerade i liknande komplex eller funktionella roller. För detta ändamål, bevis från STRÄNGEN-DB av protein-protein interaktioner integrerades i detta nätverk som blå streckad linjer20. Medan detta Single-Bait, tre exemplar experiment ger ett begränsat urval av hela DYRK1A interaktion nätverk, användning av ytterligare beten, replikat, och integration av stora offentliga datamängder kan användas för att utöka nätverket av hög-förtroende interaktioner. De statistiska cutoffs kommer därför att vara specifika för varje enskilt experiment och kommer att behöva utvärderas grundligt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig01.jpg"> Bild 1: representativ proteomik arbetsflöde för subcellulära IP-MS. Celler odlas i antingen 4 L runda botten kolvar eller 15 cm vävnad kultur rätter och skördas samtidigt för subcellulär fraktionering. Celler är fraktionerade till en cytosolic, kärnkraft, och en nukleär pellet, och immunoprecipitations görs från 1 − 10 mg av nukleärt lysat med hjälp av en eller flera antikroppar erkänner samma bete. Filter Aided prov prep (FASP) och offline prov rensning utförs före Single Shot masspektrometri. En nedströms beräkningspipeline används för att bearbeta data till tolkningsbara interaktionsdata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig02.jpg"> Figur 2: representativa data för ett enbetes-IP-MS-experiment med en enda antikropp. (A) FC-A och Saint sannolikhet utdata från CRAPome analys arbetsflöde för ett optimalt experiment med en enda antikropp för Kinas DYRK1A (n = 3). Pärlor-endast kontroller användes för jämförelse. Röda heldragna linjer representerar cutoffs i FC-A > 3,00 och SAINT > 0,7. (B) maxquant protein Abundance skattningar (iBAQ) output kontra log2 förhållande av protein överflöd i DYRK1A IP för att kontrollera, färgade av den justerade p värdeintervallet från empiriska Bayes analys av de märkfria intensiteter. C) FC-A och uppskattat antal kopior av proteiner som är förtecknade som interagerande proteiner i iref-databasen23,24. (D) Cytoscape nätverk visualisering av DYRK1A interactors. Blå noder = FC-A > 3,00, SAINT > 0,7. Orange noder = FC-A > 3,00. Svarta kanter = proteiner identifierade som interactmedlemmar i IPMS-experiment. Blå streckad kant = SAINT interaktion mellan bytes protein (konfidens >. 150). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig02large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Proteashämmare (PI) blandning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Slutliga koncentrationen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriummetabisulfit</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tillförordnade</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ditiothreitol (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fenylmetanesulfonylfluorid (PMSF)</td>
			<td>0,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Foshatashämmare (PhI) blandning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Slutliga koncentrationen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Microcystin LR</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natrium Orthovanadate</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumfluorid</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Subcellulära fraktioneringbuffertar:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Buffert ett pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Slutliga koncentrationen</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Buffert B pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Slutliga koncentrationen</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>420 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etylendiamintetraättiksyra (EDTA)</td>
			<td>0,4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
			<td>25% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Buffert C pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Slutliga koncentrationen</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etylendiamintetraättiksyra (EDTA)</td>
			<td>0,4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
			<td>20% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Buffertar för immunoprecipitation:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP-buffert 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Slutliga koncentrationen</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0,1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP-buffert 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Slutliga koncentrationen</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0,1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">SDS alkylering buffert pH 8,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Slutliga koncentrationen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sds</td>
			<td>4% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kloracetamid</td>
			<td>40 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>TCEP</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">UA pH 8,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Slutliga koncentrationen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Urea</td>
			<td>8 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>0,1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">* Använd HPLC-kvalitet H2O</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Buffertsammansättningar
Kompletterande Kodningsfiler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Beskrivs är ett proteomik arbetsflöde för att identifiera protein interaktion partner från en nukleär subcellulär fraktion med hjälp av immunoaffinity berikning av ett givet protein av intresse och etikettfri masspektrometri. Arbetsflödet omfattar subcellulär fraktionering, immunoprecipitation, filterstödd provberedning, offlinerensning, masspektrometri och en nedströms bioinformatik-pipeline.

Label-fri immunoprecipitation masspektrometri arbetsflöde för storskalig nukleär Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Detta proteomik arbetsflöde möjliggör opartisk identifiering och kartläggning av endogena protein-protein interaktioner med subcellulär upplösning. Denna teknik är särskilt fördelaktigt vid undersökning av bete proteiner som är dosering känslig, lågt överflöd, eller har flera subcellulära lokaliseringar. Denna metod kan tillämpas på kartläggning endogena protein interaktioner förutsatt att det finns en lämplig affinitet reagens tillgängliga.Detta är särskilt viktigt för många av de tusentals proteiner som har okänd funktion, av vilka många har kopplats till mänskliga sjukdomar. Denna metod kan anpassas till alla cellinje eller vävnad amenable till subcellulär fraktionering. Alla proteiner med en lämplig affinitetsreagens kan riktas.Ett vanligt resultat för affinitetsreningsexperiment är ofta inget resultat. Riktigt bra reagenser, samla QC data hela, och begränsa provhantering är alla riktigt viktiga. Vet att du har ett prov.Till att börja tina de beredda cellpelletsen i 15 minuter i 1X pelletvolym av kallbuffert A med proteashämmare eller fosfatashämmare. Placera röret som innehåller cellpelleten på en mutter vid fyra grader Celsius för att hjälpa till med återfpension i 30 minuter. Placera sedan röret i en centrifug på 2, 000 gånger g och fyra grader Celsius i 10 minuter till pellet.Dekantera supernatanten och resuspend cellerna med 5X den packade cellvolymen med buffert A.Inkubera på is i 20 minuter. Därefter pellet igen vid 2, 000 gånger g och fyra grader Celsius i 10 minuter. Dekantera bufferten och resuspend med 2X original packad cellvolymbuffert A med proteashämmare eller fosfatashämmare.Dounce ungefär sju gånger med den lösa mortelstöten A.Centrifug den lysate i 10 minuter vid 2, 000 gånger g och fyra grader Celsius. Överför försiktigt supernatanten till ett nytt rör och flash fryser den med flytande kväve. Förvara lysate på minus 80 grader Celsius.Resuspend pelleten med 0,9X pelletvolym av buffert B med proteashämmare eller fosfatashämmare och blanda på en mutterdator i fem minuter vid fyra grader Celsius. För att lysa kärnorna, dounce 20 gånger med titer mortelstöt B.Blanda kärnklart på en nutator i 30 minuter vid fyra grader Celsius så att den är homogen. Därefter centrifugera den kärn- lysateen för 30 noterar på 21, 000 tider g på fyra grader Celsiust.Pipett av supernatanten och spara som ett lösligt kärnproteinextrakt. För att dialysa det lösliga kärnextraktet, skär först en lämplig längd på 24 millimeters breddsdialyssrör med en åtta kilodaltons molekylviktsavskärning. Kläm fast ena sidan av slangen och ladda nukleoplasmen i slangen.Efter att lysaten har laddats, kläm fast den andra änden och dränka i en ren glasbehållare som innehåller buffert C med proteashämmare. Dialyze i tre timmar vid fyra grader Celsius. Därefter överför du det dialyserade kärnextraktet nukleoplasm till ett rör och centrifug vid 21 000 gånger g vid fyra grader Celsius i 30 minuter.Överför tre 20 mikroliter alikvoter av kärnextraktet till nya mikrocentrifugrör för fraktionering validering av västra blot. Med hjälp av pipettspetsar som har kapats i spetsen, bered en protein A/G-pärlblandning för varje replikat genom att kombinera 12,5 mikroliterpärlorvolym av Protein A Sepharose med 12,5 mikroliter protein G Sepharose i mikrocentrifugrör. Tvätta proteinet A/G-pärlblandningen två gånger med 300 mikroliter ip-buffert I.Snurra pärlorna vid 1, 500 gånger g vid fyra grader Celsius i en minut och dekantera bufferten.Därefter förbereder antikroppsproteinet A/G-pärlor. För att binda antikroppen till pärlorna, lägg till röret 300 mikroliter av IP-buffert I och 10 mikrogram av den önskade antikroppen. Låt pärlantikroppsblandningen rockas på en nötare vid fyra grader Celsius över natten.Nu alikvot lämpliga volymer av de nukleära lysates till låg retention microcentrifug rör för ett milligram protein ingång per replika. Snurra på lysate vid 16, 000 gånger g i 30 minuter och överför supernatanten till ett nytt rör. Lägg till en mikroliter av Benzonase på 250 enheter per mikroliter för varje milligram av kärnklaran och rock på en mutter vid fyra grader Celsius i 10 till 15 minuter.För att förbereda pärlor för pre-clearing av lysate, tillsätt 12,5 mikroliter av varje protein A och protein G pärlor till 1,5 milliliter låg retention rör. Tvätta två gånger med IP-tvättbuffert I med proteashämmare. Dekantera bufferten och lägg till ett milligram av den förberedda nukleära lysate till pärlorna.Inkubera medan du vaggar på en mutter i en timme vid fyra grader Celsius. Centrifugera de förklarade lysaterna vid 1, 500 gånger g och fyra grader Celsius i en minut. Tvätta sedan antikroppsproteinet A eller G pärlor två gånger med IP-buffert I med proteashämmare.Efter centrifugering vid 1, 500 gånger g och fyra grader Celsius i en minut, dekantera bufferten. Nu överföra den pre-cleared nukleära lysate på antikroppsprotein A eller G pärlor. Inkubera medan du gungar på en mutter vid fyra grader Celsius i fyra timmar.Efter inkubationen centrifug vid 1, 500 gånger g och fyra grader Celsius i en minut. Överför supernatanten i rör som är märkta som flödet igenom för varje replikat. Tvätta antikroppsproteinet A eller G pärlorna fyra gånger med en milliliter IP-buffert II med proteashämmare.Tvätta sedan pärlorna två gånger med en milliliter IP-buffert I med proteashämmare. Säkerställ att all buffert tas bort efter den senaste tvätten. Elute protein av pärlorna genom att inkubera med 20 mikroliter av 0,1 molar glycin vid pH 2,75 vardera i 30 minuter på en mutter.Snurra sedan på 750 gånger g och fyra grader Celsius i en minut och pipettera av supernatanten. Upprepa denna inkubation med elueringsbuffert en andra gång. Efter att ha förberett proteinpelleten, återanvänd den med 30 mikroliter av SDS alkylationsbuffert.Inkubera provet på en 95 grader Celsius värmeblock i fem minuter. Låt den sedan svalna i rumstemperatur i 15 minuter. Tillsätt 300 milliliter UA-lösning och 30 mikroliter på 100 millimolar TCEP till varje prov.Ladda lösningen på ett 30K-centrifugalfilter. Efter att ha snurrat centrifugalfiltret vid 21, 000 gånger g vid rumstemperatur i 10 minuter, håll flödet genom ifall det skulle vara problem med filtret. Efter tvätt av filtret enligt manuskriptet, tillsätt tre mikroliter av ett mikrogram per mikroliterlyse C återsuspenderade i 0,1 molar Tris pH 8.5.Fyll filtren upp till 100 mikrolitermärket med 0,1 molar Tris pH 8.5. Låt den smälta i en timme vid 37 grader Celsius medan gunga på en nutator. Därefter lägger du till en mikroliter av ett mikrogram per mikroliter MS grade trypsin.Blanda försiktigt och låt trypsin inkubera med provet över natten vid 37 grader Celsius medan gunga på en mutter. På morgonen, centrifug flera gånger vid 21, 000 gånger g i 20 minuter för att elute peptiderna från filtret till en ren låg retention mikrocentrifugrör. Efter att ha desaltat peptiderna med hjälp av C18-spinnkolonner, återanvänder de lyofilaptiderna i sju mikroliter av 0,1%TFA i 5%acetonitril.Sonikera provet i tre minuter för att säkerställa att peptiderna har återsuspade, sedan snurra ner på 14, 000 gånger g i 10 minuter. Lasta 15 till 30%av provet på vätskekromatografi masspektrometri systemet för analys. I denna studie, triplikat immunoprecipitations analyserades från fem milligram av HeLa kärnextrakt utnyttja en pärla-bara kontroll.Betet DYRK1A rankas bland de tre främsta berikade proteiner över kontrollen som indikerar att det utförda IP-MS-experimentet var tillförlitligt. En tydlig separation visades mellan de höga konfidenserna interactorer och större än 95% av copurified proteiner identifierades som ospecifika. För exemplet DYRK1A dataset, presenterade IREF interaktionspartner FC-A-värden så låga som 0,45 som representerar en mycket lågberikning över kontroll.Följaktligen är många av dessa tidigare rapporterade interaktioner falska negativ inom denna datauppsättning genom att falla under FC-A-tröskeln på tre. Det beräknade absoluta kopieringsnumret för varje IREF-interaktion visade ingen korrelation till detektionsnivåerna för en interaktionspartner per IP-MS. Den kombinerade användningen av FC-A större än tre och helgon större än 0,9 minskade listan över hög konfidenskonatörer till sex proteiner.Men när man tillämpar en FC-A cutoff på mer än tre i isolering, åtta ytterligare proteiner lades till nätverket. Den mest avgörande delen av detta protokoll är valet av antikroppsreagens för immunoprecipitation. Western blot eller Coomassie validering av selektivitet rekommenderas innan du slutför detta arbetsflöde.Stödjande bevis för protein-protein interaktioner kan fås från co-IP västra blotting av identifierade interactorer. Protein kemisk korskoppling, men mer komplexa, kan avslöja interaktion domäner av interactorer. Med denna metod har min forskargrupp avslöjat nya funktioner för DYRK1A, en proteinkinas som krävs för däggdjurs hjärnans utveckling och kopplade till Alzheimers sjukdom neuropatologi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless kapillärelektrofores-masspektrometri för Metabolic Profiling av biologiska prover

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation för Kvantitativ masspektrometri Analys

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Djupa proteomet profilering av isobariska märkning, omfattande vätskekromatografi, masspektrometri och programvara-assisted kvantifiering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal förberedelse av formalinbeständiga prover för peptid baserat Matrix assisterad Laser Desorption/jonisering masspektrometri Imaging arbetsflöden

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Provberedning för probe electrospray jonisering Masspektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Stegvis doseringsprotokoll för ökat dataflöde i etikettfria Impedansbaserade GPCR-analyser

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...