Name: label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling
Uploaded: 2019-11-17T12:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

Bu çalışma, Linda Crnic Down sendromu Enstitüsü'nden W.M.O.'ya verilen Grand Challenge bursu ve DARPA işbirliği anlaşması 13-34-RTA-FP-007 ile desteklenmiştir. Jesse Kurland ve Kira Cozzolino'ya el yazmasının okunması ve yorumlanmasındaki katkılarından dolayı teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+interaction+landscape+of+the+human+CMGC+kinase+group.">The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group.</a> Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).</li><li>Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Affinity+Tags+for+Protein+Purification.">Overview of Affinity Tags for Protein Purification.</a> Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).</li><li>Mahmood, N., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+'nonspecific'+protein+detected+by+a+His-tag+antibody+is+human+transcription+regulator+YY1.">An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1.</a> Data in Brief. 2, 52 (2015).</li><li>Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+the+ends:+internal+epitope+tagging+of+proteins+using+transposon+Tn7.">Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7.</a> Genetics. 200, 47-59 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10, 715-721 (2013).</li><li>Bronicki, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+new+cases+further+delineate+the+syndromic+intellectual+disability+phenotype+caused+by+mutations+in+DYRK1A.">Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A.</a> European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).</li><li>Antonarakis, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+syndrome+and+the+complexity+of+genome+dosage+imbalance.">Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance.</a> Nature Reviews Genetics. , (2016).</li><li>Dowjat, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy-driven+overexpression+of+DYRK1A+kinase+in+the+brain+of+subjects+with+Down+syndrome.">Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome.</a> Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).</li><li>Fotaki, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyrk1A+haploinsufficiency+affects+viability+and+causes+developmental+delay+and+abnormal+brain+morphology+in+mice.">Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).</li><li>H&#228;mmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatio-temporal+and+subcellular+expression+of+the+candidate+Down+syndrome+gene+Mnb/Dyrk1A+in+the+developing+mouse+brain+suggests+distinct+sequential+roles+in+neuronal+development.">The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development.</a> European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).</li><li>Funakoshi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+human+MNB/DYRK1A+gene+induces+formation+of+multinucleate+cells+through+overduplication+of+the+centrosome.">Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).</li><li>Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+between+DYRK1A+and+DCAF7+phosphorylates+the+C-terminal+domain+of+RNA+polymerase+II+to+promote+myogenesis.">A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13, 731-740 (2016).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+A+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10, 730-736 (2013).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAINT:+Probabilistic+scoring+of+affinity+purificationg-mass+spectrometry+data.">SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 8, 70-73 (2011).</li><li>Shannon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoscape:+a+software+environment+for+integrated+models+of+biomolecular+interaction+networks.">Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks.</a> Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STRING+database+in+2017:+quality-controlled+protein-protein+association+networks,+made+broadly+accessible.">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).</li><li>Guard, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+interactome+of+DYRK1A+reveals+a+functional+role+in+DNA+damage+repair.">The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair.</a> Scientific Reports. 9, 6539 (2019).</li><li>Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iRefIndex:+A+consolidated+protein+interaction+database+with+provenance.">iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance.</a> BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).</li><li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal,+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells.">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11, 319-324 (2014).</li><li>Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Dependency+of+Cellular+Protein+Levels+on+mRNA+Abundance.">On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance.</a> Cell. 165, 535-550 (2016).</li><li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology.">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada özetlenen proteomik iş akışı ilgi bir protein için yüksek güven protein interaktörleri tanımlamak için etkili bir yöntem sağlar. Bu yaklaşım, hücre altı fraksiyonu ile örnek karmaşıklığını azaltır ve sağlam numune hazırlama, çevrimdışı numune temizleme ve LC-MS sisteminin sıkı kalite kontrolü yoluyla tanımlama etkileşim ilerleçiş ortaklarını artırmaya odaklanır. Burada açıklanan aşağı akım veri analizi yem ile copurifying olarak tanımlanan proteinlerin basit bir istatistiksel değerlendirme sağlar. Ancak, deneysel değişkenlerin (ölçek, hücre hattı, antikor seçimi) yüksek sayıda nedeniyle, her deney farklı cutoffs ve veri görselleştirme ve zenginleştirme ile ilgili hususlar gerektirir.
Bir IP-MS deneyinde ilk tasarım konusu, etkileşen ortakları ile birlikte ilgi proteininin saflaştırılmasında kullanılacak antikorların seçimidir. Ticari antikorların kullanılabilirliği son birkaç on yıl içinde insan proteom büyük bölümlerini kapsayacak şekilde genişletilmiş olsa da, reaktifler sınırlı olduğu için hala birçok protein vardır. Ayrıca, batı leke tespiti gibi uygulamalar için doğrulanmış antikorlar immünopredibat deneyinde hedef proteinin selektif zenginleştirme yeteneğine sahip olmayabilir. Büyük ölçekli bir etkileşim proteomik deneyi gerçekleştirmeden önce, bir IP'nin %90'lık bir 10 cm'lik çanak tan veya eşdeğer hücre numarasından tamamlanması ve batı lekeleme ile ilgi çekici hedef protein için sonda lanması önerilmektedir. İmmünenyağış için birden fazla antikor mevcutsa, proteinin farklı kısımlarında epitopsları tanıyan birden fazla antikor seçilmesi önerilmektedir. Bir antikorbir yem proteinine bağlanması putatif etkileşimli ortaklar için gerekli bağlayıcı arabirimi tıkayabilir. Yem proteini için ikincil bir epitop seçimi, kütle spektrometresi tabanlı bir deneyle tanımlanan etkileşim profilinin kapsamını artıracaktır.
İkinci önemli husus, yüksek güven etkileşimlerini yemle işbirliği olarak tanımlananlardan düşük güven veya nonspesifik etkileşimlerden ayırmak için uygun kontrolün seçiminde yatsıdır. Bir IP-MS deneyi için en sıkı kontrol, bayem bir CRISPR KO hücre hattından immünoprepitasyon tamamlamaktır. Böyle bir kontrol, yem proteini yerine doğrudan antikora bağlanan spesifik olmayan proteinlerin tanımlanmasını ve filtrelanmasını sağlar. Her yem proteininin CRISPR KO hücre hattı nın üretilmesinin mümkün olmadığı durumlarda, yem antikorunun aynı izotipinin IgG-boncuk kontrolü kullanılabilir. Birden fazla türü temsil eden antikorlardan oluşan bir panel kullanan deneylerde, boncukların sadece kontrolü uygun olabilir, ancak yüksek güven interaktörler olarak tanımlanan yanlış pozitif lerin oranını artıracaktır.
BIR IP-MS denemesinde kullanılan hücre hattının seçimi birkaç önemli etkene bağlıdır. Protein ekspresyonu ve lokalizasyonu büyük ölçüde hücre tipine bağlıdır. RNA ekspresyonu tahminleri birçok yaygın olarak kullanılan hücre hatlarında çoğu gen için bulunabilir iken, protein ekspresyonu rna ekspresyonu ile kötü ilişkilidir ve deneysel olarak belirlenmelidir25. Bir yem proteininin çok düşük kopya numarasıyla ifade edildiği hücre çizgileri, gerekli olabilecek hücre kültürü ölçeğindeki ciddi artışlarla ilişkili sorunları atlatmak için kaçınılmalıdır. Ancak, örnek hazırlama çok düşük bolluk proteinlerinin tespiti için optimize edilebilir unutulmamalıdır. Filtre destekli numune hazırlama (FASP) yöntemi, sağlam olmakla birlikte, bir numunede %50'den fazla peptid kaybına neden olabilir. Tek Pot Katı Fazlı Gelişmiş Numune Hazırlama (SP3), numune kaybını en aza indiren kütle spektrometresi analizi için numune oluşturmanın etkili bir yöntemidir26. Numune hazırlama nın SP3 yöntemi yle etkin hale gelen artan geri kazanım, algılama sınırına yakın olan proteinlerin nicelleştirilmesi için bu iş akışında yararlı bir alternatif olabilir.
Bu proteomik iş akışı kinazlar, E3 ubiquitin ligases ve multisubunit komplekslerinin iskele üyeleri de dahil olmak üzere birçok nükleer yemler arasında uygulanmıştır. Antikor reaktiflerinin doğru doğruluğunu varsayarsak, bu iş akışının başarılı bir şekilde yürütülmesi, yüksek güven emüldomu proteini nükleer etkileşim ortaklarının ilgi çekici bir protein için saptanmasına neden olacaktır.

İnsan proteomu, kararlı çok alt birim kompleksleri ve geçici protein-protein etkileşimleri ile geniş yapısal ve biyokimyasal çeşitlilik sergiler. Buna göre, bir ilgi proteini için etkileşim ortaklarının belirlenmesi, moleküler mekanizmayı çözmek için yapılan araştırmalarda yaygın olarak gereklidir. Yakınlık arınma protokollerinde son gelişmeler ve yüksek çözünürlüklü hızlı tarama kütle spektrometresi enstrümantasyonunun ortaya çıkması, tek bir tarafsız deneyde protein etkileşimi manzaralarının kolay haritalanmasına olanak sağlamıştır.
Protein etkileşim protokolleri genellikle ilgi bir protein tanıma yüksek kaliteli antikorlar gerek kalmadan protein etkileşimlerini belirlemek için yakınlık etiketli füzyon yapıları ile ektopik ifade sistemleri istihdam1,2. Ancak, epitop etiket tabanlı yöntemlerin çeşitli dezavantajları vardır. Epitop ile fiziksel etkileşimler nonspesifik kopurifying proteinlerin tespitine yol açabilir3. Ayrıca, bir proteinin N- veya C-terminaline bu epitop etiketlerin füzyonu yerli protein-protein etkileşimlerini engelleyebilir veya fizyolojik olmayan konformasyonları teşvik etmek için protein katını bozabilir4. Ayrıca, ektopik ekspresyon sistemleri genellikle suprafizyolojik konsantrasyonlarda yem proteini aşırı ekspres, hangi artifactual protein etkileşimlerinin belirlenmesi ile neden olabilir, özellikle dozaj duyarlı genler için5. Bu sorunları aşmak için, endojen yem proteini ilişkili etkileşimli av proteinleri ile birlikte immünopprepititated olabilir, yerli protein tanıyan yüksek kaliteli bir antikor durumu varsayarak.
Burada bir örnek olarak CMGC protein kiaz DYRK1A kullanarak endojen bir proteinin nükleer etkileşimi tespit etmek için bir etkileşim proteomik iş akışı sağlanmaktadır. DYRK1A kopya numarası, aktivite düzeyi veya ifade bozulması insanlarda ciddi zihinsel özürlülük neden olabilir, ve farelerde embriyoniköldürücülük 6,7,8,9. DYRK1A, farklı hücre altı bölmelerine özgü düşük bolluk etkileşim ilerleçlerini tespit edebilen yaklaşımlar gerektiren dinamik spatiotemporal regülasyon10ve bölümlü protein etkileşimleri11,12,sergiler.
Bu protokol, insan HeLa hücrelerinin sitosol ve nükleoplazm fraksiyonlarına hücresel fraksiyonunu, immünopresidasyon, kütle spektrometresi için numune hazırlama ve veri kalitesini niçin değerlendirmek ve sonuçları görselleştirmek için biyoinformatik bir boru hattının genel görünümünü, analiz ve görselleştirme için sağlanan R komut dosyaları ile kullanır (Şekil 1). Bu iş akışında kullanılan Proteomics yazılım paketlerinin tümü ücretsiz olarak indirilebilir veya bir web arabirimi üzerinden erişilebilir. Yazılım ve hesaplama yöntemleri hakkında daha fazla bilgi için, ayrıntılı öğreticiler ve talimatlar sağlanan bağlantılarda mevcuttur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 0.1% EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone (HPLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closure</td>
			<td>Caroline Biological Supply Company</td>
			<td>684239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-47724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>887845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa QC tryptic digest</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KONTES Dounce homogenizer 7 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885301-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl endopeptidase C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin</td>
			<td>enzo life sciences</td>
			<td>ALX-350-012-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>98379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p84 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX70220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BSA Protein Digest, MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88341</td>
			<td>LCMS QC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 spin columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-89873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td>For mass spectrometry sample prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0780-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica emitter tip</td>
			<td>Pico TIP</td>
			<td>FS360-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885302-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3787K17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 150, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>Tissue culture dish for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY M-Class UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7&#181;m Spherical Hybrid (1.7 &#181;m, 75 &#181;m x 250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007484</td>
			<td>nanoflow C18 column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling

İmmünafinitasyon kütle spektrometresi (IP-MS) protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için sağlam bir kantitatif yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu yayın, diğer hücre altı bölmelere de uygulanabilen çekirdekten düşük miktarda protein-protein etkileşimlerini belirlemek için tasarlanmış tam bir etkileşim proteomik iş akışı sunmaktadır. Bu iş akışı hücre altı fraksiyonları, immünopreksiyon, numune hazırlama, çevrimdışı temizleme, tek çekim etiketsiz kütle spektrometresi ve downstream hesaplamalı analiz ve veri görselleştirmeiçerir. Protokolümüz, endojen proteinlerin immünopresiyonu ile tüm hücre lisatlarından (örn. transkripsiyon faktörü etkileşimleri) saptanması zor olan kompartıraklaştırılmış, düşük bolluk etkileşimlerini tespit etmek için optimize edilmiştir. fraksiyona alilmiş hücre altı bölmeleri. Burada özetlenen örnek hazırlama boru hattı HeLa hücre nükleer ekstresi hazırlanması için ayrıntılı talimatlar sağlar, endojen yem proteinimmünaffinity arıtma, ve kantitatif kütle spektrometresi analizi. Ayrıca kütle spektrometresi tabanlı etkileşim profilleme deneylerinde büyük ölçekli immünoprepitasyon yapmak için metodolojik hususları tartışıyorve gerçek pozitif proteini ayırt etmek için veri kalitesinin değerlendirilmesi için kılavuzlar sağlıyoruz. nonspesifik etkileşimlerden etkileşimler. Bu yaklaşım burada CMGC kinaz, DYRK1A, çekirdek içinde kötü tanımlanmış etkileşimleri ile düşük bir bolluk protein kiaz ın nükleer etkileşimaraştırerek gösterilmiştir.

BIR IP-MS deneyinde tanımlanan protein kütlesinin büyük bir kısmı nonspesifik proteinlerden oluşur. Bu nedenle, bir IP-MS deneyinin en önemli zorluklarından biri proteinlerin yüksek güven interaktörleri ile nonspesifik interaktörler arasında yorumlanmasıdır. Veri kalitesinin değerlendirilmesinde kullanılan önemli parametreleri göstermek için çalışma, boncuk sadece kontrol kullanılarak 5 mg HeLa nükleer ekstresinden triplicate immünopreplitleri analiz etti. Bir IP-MS deneyinin güvenilir olduğundan emin olmak için ilk iç kontrol, yem proteininin hem kontrol hem de SAINT olasılığı üzerinde kat değişimi ile tanımlanan en yüksek zenginleştirilmiş proteinlerden biri olup olmadığıdır. Bu durumda, yem DYRK1A kontrol üzerinde ilk üç zenginleştirilmiş proteinler arasında yer aldı (Şekil 2A,B). DYRK1A bir nükleer etkileşimom çalışmada dört bağımsız antikorlar kullanarak, bir FC-A kesme >3.00 ve SAINT olasılık kesme >0.7 hem roman ve daha önce doğrulanmış interactors22belirlenmesi için sıkı bir kesme sağladı . Bu deneye uygulandığında, yüksek güven interaktörleri ile nonspesifik olarak tanımlanan saflaştırılmış proteinlerin %195'i arasında net bir ayrım görülebilir(Şekil 2A,B). Hem kat değişim zenginleştirme hem de olasılık eşiğinin uygulanması, biyolojik kopyalar arasında protein yetersizliklerinin sürekli olarak yüksek bir zenginleştirme gerektirmesi ile sıkılığı artırır.
Istatistiksel puanlama ek olarak, CRAPome analizi iş akışı da daha önce yem-av veri23üzerine bildirilen etkileşimleri haritalar . Bu haritalama yüksek ve düşük güven etkileşimleri eşik için yararlı olabilir, daha önce bildirilen etkileşimler FC-A ve SAINT olasılıkları tarafından kötü puan olabilir, potansiyel olarak belirli bir yem birçok bilinen etkileşimleri sadece belirli hücre türleri, bağlamlar veya organeller var olabileceğini gösteren. Örneğin DYRK1A veri seti, iREF etkileşimci FC-A değerleri 0,45 gibi düşük, kontrol üzerinde çok düşük bir zenginleştirme temsil eden(Şekil 2C). Yanlış pozitiflerin enflasyonunu önlemek için, istatistiksel eşik, yanlış negatiflerin azaltılmasına göre sıkılığa öncelik veren bir şekilde yapılmalıdır. Bu etkileşimlerin saptanması protein bolluğundan bağımsızdır (Şekil 2C). HeLa hücreleri içindeki her iREF etkileşiminin hesaplanan mutlak kopya sayısı, IP-MS24ile etkileşim ortağının algılama düzeyleriyle bir korelasyon göstermedi.
Cytoscape etkileşim verilerinin birden fazla katmanını görselleştirmek için etkili bir araç olarak hizmet vermektedir19. Burada açıklanan DYRK1A immünopresipite deneyinde, FC-A > 3.0 ve SAINT > 0.9'un kombine kullanımı yüksek güven interaktörlerin listesini altı proteine indirgedi(Şekil 2D). Ancak, > 3.0'ın FC-A kesimi izolasyonhalinde uygulandığında ağa sekiz protein daha eklendi. Bu ek protein interaktörler ağ zaten interaktörler ile yüksek bağlantı var, onlar benzer kompleksleri veya fonksiyonel rolleri ilişkili olduğunu düşündürmektedir. Bu amaçla, protein-protein etkileşimlerinin STRING-DB'sinden elde edilen kanıtlar bu ağa mavi kesik çizgiler20olarak entegre edilmiştir. Bu tek yem, triplicate deney tam DYRK1A etkileşim ağının sınırlı bir örnek sağlarken, ek yemler, çoğaltmalar ve büyük genel veri kümelerinin entegrasyonu yüksek güven etkileşimleri ağını genişletmek için kullanılabilir. Bu nedenle istatistiksel kesintiler her deneye özgü olacak ve iyice değerlendirilmesi gerekecektir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig01.jpg"> Şekil 1: Hücre altı IP-MS için temsili proteomik iş akışı. Hücreler ya 4 L yuvarlak alt şişelerde veya 15 cm doku kültürü tabaklarında yetiştirilir ve hücre altı fraksiyonu için aynı anda hasat edilir. Hücreler sitosolik, nükleer ve nükleer pelet içine fraksiyona alınır ve immünopreside 1−10 mg nükleer lysate ile aynı yemi tanıyan bir veya birden fazla antikor kullanılarak yapılır. Filtre destekli numune hazırlığı (FASP) ve çevrimdışı numune temizliği tek çekim kütle spektrometresi öncesinde gerçekleştirilir. Verileri yorumlanabilir etkileşim verilerine işlemek için bir akış aşağı hesaplama ardışık işlem akışı kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig02.jpg"> Şekil 2: Tek yemlik tek antikorLU IP-MS deneyi için temsili veriler. (A) FC-A ve SAINT olasılık çıktısı CRAPome analizi iş akışı ndan en iyi deney için kinaz DYRK1A için tek bir antikor kullanarak (n = 3). Karşılaştırma için yalnızca boncuk denetimleri kullanılmıştır. Kırmızı düz çizgiler FC-A > 3.00 ve SAINT > 0.7'de ayarlanan kesintileri temsil eder. (B) MaxQuant protein bolluğu tahminleri (iBAQ) çıkış ve dyrk1A IP protein bolluğu log2 oranı kontrol etmek için, etiket içermeyen yoğunlukları ampirik Bayes analizi nden ayarlanmış p değer aralığı ile renkli. (C) FC-A ve iRef veritabanında etkileşen proteinler olarak listelenen proteinlerin tahmini kopya sayısı23,24. (D) DYRK1A interaktörlerin Cytoscape ağ görselleştirme. Mavi düğümler = FC-A > 3.00, SAINT > 0.7. Turuncu düğümler = FC-A > 3.00. Siyah kenarlar = IPMS deneyinde interaktörler olarak tanımlanan proteinler. Mavi kesik kenar = av proteini arasındaki SAINT etkileşimi (güven > 0,150). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Proteaz inhibitörü (PI) karışımı</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sodyum Metabisülfit</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Benzamidin</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fenilmetansülfonil florür (PMSF)</td>
			<td>0,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Fosfataz Inhibitörü (PhI) karışımı</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrosistin LR</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sodyum Orthovanadate</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sodyum florür</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Hücre altı fraksiyonaraleri:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tampon A pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kartal</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tampon B pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>420 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etilendimintetraasetik asit (EDTA)</td>
			<td>0,4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gliserol</td>
			<td>%25 (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tampon C pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kartal</td>
			<td>100mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etilendimintetraasetik asit (EDTA)</td>
			<td>0,4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gliserol</td>
			<td>%20 (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">İmmünopreprezan tamponlar:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP Arabellek 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kartal</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>%0,1 (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gliserol</td>
			<td>%10 (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP Arabellek 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kartal</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>%0,1 (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gliserol</td>
			<td>%10 (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">SDS Alkylation Tampon pH 8.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS</td>
			<td>%4 (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kloroasetamid</td>
			<td>40 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>TCEP</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>100mm</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">UA pH 8.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Üre</td>
			<td>8 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>0,1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">* HPLC sınıfı H2O kullanın</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Arabellek kompozisyonları
Ek Kodlama Dosyaları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Açıklanan ilgi ve etiket-free kütle spektrometresi belirli bir protein in immünafinite zenginleştirme kullanarak bir nükleer hücre altı fraksiyonu protein etkileşim ortakları tanımlamak için bir proteomik iş akışıdır. İş akışı hücre altı fraksiyonu, immünoprepitasyon, filtre destekli numune hazırlama, çevrimdışı temizleme, kütle spektrometresi ve aşağı akım biyoinformatik boru hattını içerir.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Bu proteomik iş akışı, endojen protein-protein etkileşimlerinin hücre altı çözünürlüğü ile tarafsız olarak tanımlanmasını ve haritalanmasını sağlar. Bu teknik, dozaj duyarlı yem proteinleri araştırırken özellikle avantajlıdır, düşük bolluk, ya da birden fazla hücre altı lokalizasyonu var. Bu yöntem, uygun bir yakınlık reaktifi mevcut olduğunu varsayarak endojen protein etkileşimleri haritalama uygulanabilir.Bu, özellikle işlevi bilinmeyen binlerce protein için özellikle önemlidir, bunların çoğu insan hastalığı ile bağlantılı olmuştur. Bu yöntem herhangi bir hücre hattı veya doku subcellular fraksiyonu için uygun adapte edilebilir. Uygun bir afinite reaktifi olan herhangi bir protein hedeflenebilir.Yakınlık arınma deneyleri için ortak bir sonuç genellikle sonuç değildir. Gerçekten iyi reaktifler, boyunca QC veri toplama ve örnek işleme sınırlayan tüm gerçekten önemlidir. Bir örneğin olduğunu bil.Başlamak için, proteaz inhibitörleri veya fosfataz inhibitörleri ile soğuk tampon A 1X pelet hacmi 15 dakika boyunca hazırlanan hücre peletleri eritin. Hücre peletini içeren tüpü, 30 dakika boyunca yeniden askıya alınmasına yardımcı olmak için dört derece bir besleyiciye yerleştirin. Sonra pelet için 10 dakika boyunca 2, 000 kez g ve dört derece santigrat bir santrifüj tüp yerleştirin.Supernatant decant ve 5X ile hücreleri yeniden askıya tampon A.Incubate ile 20 dakika buz üzerinde paketlenmiş hücre hacmi. Sonra, pelet tekrar 2, 000 kez g ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat. Tampon decant ve proteaz inhibitörleri veya fosfataz inhibitörleri ile 2X orijinal paketlenmiş hücre hacmi tampon A ile resuspend.Gevşek pestle A.Centrifuge 2, 000 kez g ve dört derece santigrat 10 dakika boyunca lysatge ile yaklaşık yedi kez dounce. Dikkatle yeni bir tüp ve flaş sıvı nitrojen ile dondurmak supernatant aktarın. Lysate eksi 80 santigrat derecede saklayın.Proteaz inhibitörleri veya fosfataz inhibitörleri ile tampon B 0.9X pelet hacmi ile pelet resuspend ve dört santigrat derece beş dakika boyunca bir nutator üzerinde karıştırın. Çekirdekleri lyse için, titrek pestle B.Mix bir nutator üzerinde 30 dakika boyunca 4 santigrat derece de böylece homojen olduğunu 20 kez dounce. Sonra 21, 000 kez g dört santigrat derece 30 dakika boyunca nükleer lysate santrifüj.Pipet supernatant kapalı ve çözünür bir nükleer protein özü olarak kaydedin. Çözünür nükleer ekstresi diyalize çekmek için, ilk olarak 24 milimetre genişliğinde diyaliz borusu ile sekiz kilodalton moleküler ağırlık kesme ile uygun bir uzunlukta kesti. Tüpün bir tarafını kenetle ve nükleoplazmı boruya yükleyin.Lysate yüklendikten sonra, diğer ucunu kelepçeleyin ve proteaz inhibitörleri ile tampon C içeren temiz bir cam kap içine batırın. Dört santigrat derecede üç saat diyaliz. Bundan sonra, 30 dakika boyunca 4 santigrat derece de 21, 000 kez g bir tüp ve santrifüj içine diyaliz nükleer özü nükleoplazm aktarın.Nükleer ekstresin üç 20 mikrolitrelik aliquot'unu batı lekesinin fraksiyonu için yeni mikrosantrifüj tüplere aktarın. Ucunda kesilmiş olan pipet uçlarını kullanarak, 12,5 mikrolitre boncuk hacmini 12,5 mikrolitrelik Protein A Sepharose'u mikrosantrifüj tüplerinde Protein G Sepharose mikrolitreleriyle birleştirerek her çoğaltma için bir protein A/G boncuk karışımı hazırlayın. A/G boncuk karışımını 300 mikrolitre IP tamponu i.Spin boncukları 1, 500 kez g'de dört santigrat derecede bir dakika boyunca iki kez yıkayın ve tamponu decant.Sonra, antikor proteinA / G boncuk hazırlamak. Antikor boncuklar bağlamak için, tüp 300 ip tampon I mikrolitre ve istenilen antikor 10 mikrogram ekleyin. Boncuk-antikor karışımı bir gecede dört derece santigrat bir nutator üzerinde rock izin verin.Şimdi nükleer lysates uygun hacimleri düşük tutma mikrosantrifüj tüpler iperatör başına protein girişi bir miligram için. 30 dakika boyunca 16,000 kez g lysate spin ve yeni bir tüp için supernatant aktarın. 10 ila 15 dakika boyunca dört santigrat derecede bir fındık üzerinde nükleer lysate ve kaya her miligram için mikrolitre başına 250 adet Benzonaz bir mikrolitre ekleyin.Lysate önceden temizlenmesi için boncuk hazırlamak için, 1,5 mililitre düşük tutma tüpleri için her protein A ve protein G boncuk 12,5 mikrolitre ekleyin. Proteaz inhibitörleri ile IP yıkama tampon I ile iki kez yıkayın. Tampon decant ve boncuk lar için hazırlanan nükleer lysate bir miligram ekleyin.Dört santigrat derecede bir saat boyunca bir nutator üzerinde sallanan iken kuluçka. Önceden temizlenmiş lysates 1, 500 kez g ve dört derece santigrat bir dakika için santrifüj. Daha sonra antikor proteini A veya G boncukları proteaz inhibitörleri ile IP tampon I ile iki kez yıkayın.1, 500 kez g ve dört santigrat derece bir dakika santrifüj sonra, tampon decant. Şimdi önceden temizlenmiş nükleer lysate antikor proteini A veya G boncuk üzerine aktarın. Dört saat boyunca dört santigrat derecede bir nutator üzerinde sallanan iken kuluçka.Kuluçkadan sonra, santrifüj 1, 500 kez g ve bir dakika için dört derece santigrat. Supernatant'ı her çoğaltma için akış olarak etiketlenmiş tüplere aktarın. Antikor proteini A veya G boncukları bir mililitre IP tampon II ile proteaz inhibitörleri ile dört kez yıkayın.Sonra proteaz inhibitörleri ile IP tampon I bir mililitre ile boncuk iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra tüm arabellek kaldırıldığından emin olun. PH 2.75 her bir nutator üzerinde 30 dakika boyunca 0.1 molar glisin 20 mikrolitre ile kuluçka yada tarafından boncuk kapalı elute protein.Sonra 750 kez g ve dört derece santigrat bir dakika ve pipet supernatant kapalı spin. Bu kuluçka yı ikinci kez elüsasyon tamponu ile tekrarlayın. Protein peletini hazırladıktan sonra, 30 mikrolitre SDS alkililasyon tamponu ile yeniden askıya alın.Örneği 95 derecelik bir ısı bloğunda beş dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika soğumaya bırakın. Her numuneye 300 mililitre UA çözeltisi ve 30 mikrolitre 100 milimolar TCEP ekleyin.Çözeltiyi 30K santrifüj filtresine yükleyin. Santrifüj filtreyi oda sıcaklığında 21,000 kez 10 dakika döndürdükten sonra, filtrede bir sorun olması durumunda akışı koruyun. Filtreyi el yazmasına göre yıkadıktan sonra, 0,1 molar Tris pH 8.5'te mikrolitre başına bir mikrogram ekleyin.100 mikrolitre işaretine kadar olan filtreleri 0,1 molar Tris pH 8,5 ile doldurun. Bir nutator üzerinde sallanan ise 37 santigrat derece bir saat sindirmek için izin verin. Daha sonra, mikrolitre MS sınıfı tripsin başına bir mikrogram ekleyin.Hafifçe karıştırın ve bir nutator üzerinde sallanan ise 37 santigrat derece bir gecede örnek ile inkübün için trypsin sağlar. Sabahları, 21,000 kez g 20 dakika boyunca temiz bir düşük tutma mikrosantrifüj tüp içine filtreden peptidler temizlemek için birden fazla kez santrifüj. C18 spin kolonları kullanarak peptidleri tuzdan arındırdıktan sonra, liyofilize peptidlerin yedi mikrolitrede %0.1 TFA'da %5 asetonitrilin istilâsı.Peptidlerin askıya alınmasından emin olmak için numuneyi üç dakika sonicate edin, sonra 10 dakika boyunca 14,000 kez g'de aşağı doğru döndürün. Numunenin %15-30'u analiz için sıvı kromatografi kütle spektrometresi sistemine yükleyin. Bu çalışmada, sadece boncuk kontrolü kullanılarak beş miligram HeLa nükleer ekstresinden triplicate immünoprepitasyonlar analiz edilmiştir.Yem DYRK1A, yapılan IP-MS deneyinin güvenilir olduğunu gösteren kontrol üzerinde zenginleştirilmiş ilk üç protein arasında yer aldı. Yüksek güven interaktörleri arasında net bir ayrım gösterilmiştir ve saflaştırılmış proteinlerin %95'inden fazlası nonspesifik olarak tanımlanmıştır. Örneğin DYRK1A veri seti için, IREF etkileşim ortakları fc-A değerlerini 0,45 gibi düşük bir değer sunarak kontrol üzerinde çok düşük bir zenginleştirme yi temsil eder.Buna göre, bu daha önce bildirilen etkileşimlerin çoğu üç FC-A eşiğinin altına düşerek bu veri kümesi içinde yanlış negatifler vardır. Her IREF etkileşiminin hesaplanan mutlak kopya sayısı, ip-MS tarafından bir etkileşim ortağının algılama düzeyleriyle hiçbir korelasyon göstermedi. FC-A'nın üçten büyük ve 0,9'dan büyük azizin kombine kullanımı yüksek güven interaktörlerlistesini altı proteine indirgedi.Ancak, izole olarak üçten fazla FC-A kesiği uygulanırken, ağa sekiz ek protein eklendi. Bu protokolün en önemli kısmı immünopresipitasyon için antikor reaktifseçimidir. Bu iş akışını tamamlamadan önce seçiciliğin Batı lekeveya Coomassie doğrulaması önerilir.Protein-protein etkileşimlerinin destekleyici kanıtları, tanımlanan interaktörlerin co-IP batı lekelenmesinden elde edilebilir. Protein kimyasal çapraz bağlama, daha karmaşık olsa da, interaktörlerin etkileşim etki alanlarını ortaya çıkarabilir. Bu yöntemi kullanarak, benim araştırma grubu DYRK1A, bir protein kimyaz memeli beyin gelişimi için gerekli ve Alzheimer hastalığı nöropatoloji ile bağlantılı için yeni fonksiyonlar ortaya çıkardı.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Örnekleri için matris peptit esaslı tamir Formalin en iyi hazırlık lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi iş akışlarını görüntüleme destekli

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probuelektrosprey Iyonizasyon Kütle Spektrometresi için Örnek Hazırlama

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Label-Free Empedans Tabanlı GPCR Denemelerinde Artırılmış İş İlerletme Protokolü

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...