Name: pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink for printing 3d cell-laden pancreatic tissue constructs
Uploaded: 2019-12-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch das Bio & Medical Technology Development Program der National Research Foundation (NRF) unterstützt, das von der koreanischen Regierung (MSIT) (2017M3A9C6032067) und dem "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) gefördert wurde. iITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation).

Schweine-Pankreasgewebe wurden aus einem örtlichen Schlachthof gesammelt. Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Asan Medical Center, Seoul, Korea, genehmigt.
1. Gewebedezellularisierung
<ol><li>Bereiten Sie die Lösungen für die Dezellularisierung vor. HINWEIS: 1x phosphatgepufferte Salzsäure (PBS), die in allen Lösungspräparaten verwendet wird, wird durch Zugabe von destilliertem Wasser zu 10x PBS verdünnt.<ol>
<li>Für die 1% Triton-X 100 ...

<ol>
	<li>Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pancreatic+islet+transplantation.">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).</li><li>Venturini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique,+complications,+and+therapeutic+efficacy+of+percutaneous+transplantation+of+human+pancreatic+islet+cells+in+type+1+diabetes:+the+role+of+US.">Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US.</a> Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).</li><li>Xie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoprotection+of+PEG-modified+adult+porcine+pancreatic+islets+for+improved+xenotransplantation.">Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation.</a> Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).</li><li>Sackett, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffold+and+hydrogel+derived+from+decellularized+and+delipidized+human+pancreas.">Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+printing+of+islet-laden+pancreatic+tissue-derived+extracellular+matrix+bioink+constructs+for+enhancing+pancreatic+functions.">3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions.</a> Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).</li><li>Yi, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioprinted+human-glioblastoma-on-a-chip+for+the+identification+of+patient-specific+responses+to+chemoradiotherapy.">A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+extracellular+matrix+bioinks+and+the+external+stimuli+to+enhance+cardiac+tissue+development+in+vitro.">Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro.</a> Acta Biomaterialia. , (2019).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+alignment+of+collagen+fibrils+using+3D+cell+printing+for+corneal+stroma+tissue+engineering.">Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering.</a> Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).</li><li>Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+replacement+for+islet+equivalents+with+improved+reliability+and+validity.">A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity.</a> Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).</li><li>Pati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+three-dimensional+tissue+analogues+with+decellularized+extracellular+matrix+bioink.">Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink.</a> Nature Communications. 5, 3935 (2014).</li><li>Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-based+materials+for+regenerative+medicine.">Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 1, (2018).</li><li>Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+extracellular+matrix:+a+step+towards+the+next+generation+source+for+bioink+manufacturing.">Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing.</a> Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).</li><li>Gaetani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+different+decellularization+protocols+on+the+generation+of+pancreas-derived+hydrogels.">Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).</li><li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+bio-blood-vessels+constructed+using+a+tissue-specific+bioink+and+3D+coaxial+cell+printing+technique:+a+novel+therapy+for+ischemic+disease.">Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease.</a> Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).</li><li>La, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemically+replicated+organic+and+inorganic+bony+microenvironment+for+new+bone+formation+generated+by+a+3D+printing+technology.">Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology.</a> RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+liver+decellularized+extracellular+matrix+bioink+for+three-dimensional+cell+printing-based+liver+tissue+engineering.">Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering.</a> Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).</li><li>Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-derived+decellularized+extracellular+matrix:+a+game+changer+for+bioink+manufacturing?.">Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing?.</a> Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).</li><li>Kurpios, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direction+of+gut+looping+is+established+by+changes+in+the+extracellular+matrix+and+in+cell:+cell+adhesion.">The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423 (6942), 876 (2003).</li></ol>

Dieses Protokoll beschrieb die Entwicklung von pdECM-Bioinks und die Herstellung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten unter Verwendung von 3D-Zelldrucktechniken. Um die Mikroumgebung des Zielgewebes im 3D-Technischen Gewebekonstrukt zu rekapitulieren, ist die Wahl des Bioinks entscheidend. In einer früheren Studie haben wir validiert, dass gewebespezifische dECM-Bioinks vorteilhaft sind, um die Stammzelldifferenzierung und Proliferation zu fördern10. Im Vergleich zu synthetischen Polymeren kann dECM...

Kürzlich wurde die Pankreas-Islet-Transplantation als vielversprechende Behandlung für Patienten mit Typ-1-Diabetes angesehen. Die relative Sicherheit und minimale Invasivität des Verfahrens sind große Vorteile dieser Behandlung1. Jedoch, Es hat mehrere Einschränkungen wie die geringe Erfolgsrate der isolierenden Inseln und die Nebenwirkungen von immunsuppressiven Medikamenten. Darüber hinaus nimmt die Zahl der eingepfropften Inselchen nach der Transplantation aufgrund der feindlichen Umgebung stetig ab2. Verschiedene biokompatible Materialien wie Alginat, Kollagen, Poly(Milch-Co-Glykolsäure) (PLGA) oder Polyethylenglykol (PEG) wurden bei der Pankreas-Islet-Transplantation angewendet, um diese Schwierigkeiten zu überwinden.
Die 3D-Zelldrucktechnologie entwickelt sich in der Tissue-Engineering aufgrund ihres großen Potenzials und ihrer hohen Leistung. Selbstverständlich sind Bioinks als wichtige Komponenten bekannt, um eine geeignete Mikroumgebung zu schaffen und die Verbesserung zellulärer Prozesse in gedruckten Gewebekonstrukten zu ermöglichen. Eine beträchtliche Anzahl von scherendünnenden Hydrogelen wie Fibrin, Alginat und Kollagen sind weit verbreitet als Bioinks verwendet. Diese Materialien weisen jedoch einen Mangel an struktureller, chemischer, biologischer und mechanischer Komplexität im Vergleich zur extrazellulären Matrix (ECM) im nativen Gewebe3auf. Mikroökologische Hinweise wie die Wechselwirkungen zwischen Inselchen und ECM sind wichtige Signale zur Verbesserung der Funktion von Inselchen. Dezellularisiertes ECM (dECM) kann die gewebespezifische Zusammensetzung verschiedener ECM-Komponenten wie Kollagen, Glycosaminoglycane (GAGs) und Glykoproteine nachbilden. Beispielsweise weisen primäre Inselchen, die ihre peripheren ECMs (z. B. Typ I, III, IV, V und VI Kollagen, Laminin und Fibronectin) behalten, eine geringe Apoptose und eine bessere Insulinempfindlichkeit auf, was darauf hindeutet, dass gewebespezifische Zellmatrix-Wechselwirkungen wichtig sind, um ihre Fähigkeit zu verbessern, ähnlich wie das ursprüngliche Gewebe zu funktionieren4.
In diesem Beitrag erläutern wir Protokolle zur Vorbereitung von Pankreasgewebe-abgeleiteten dezellularisierten extrazellulären Matrix (pdECM) Bioink, um vorteilhafte mikroökologische Hinweise zur Steigerung der Aktivität und Funktionen der Pankreasinseln zu bieten, gefolgt von den Prozessen zur Erzeugung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten mit einer mikroextrusionbasierten Bioprinting-Technik (Abbildung 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinets</td>
			<td>CRYSTE</td>
			<td>PURICUBE 1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Freezer</td>
			<td>Thermo Scientific Forma</td>
			<td>957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital orbital shaker</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>DH.WSO04010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry oven</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>WON-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>7670540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>SANSUNG</td>
			<td>CRFD-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grater</td>
			<td>ABM</td>
			<td>1415605793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscopes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>CRYSTE</td>
			<td>PURISPIN 17R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Multiskan GO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>CF-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Hotplate Stirrers</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>SMHS-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE-PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH benchtop meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheometer</td>
			<td>TA Instrument</td>
			<td>Discovery HR-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>VM-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cirurgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>Hirose</td>
			<td>HC.13-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Korea Ace Scientific</td>
			<td>HC.203-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml glass vial</td>
			<td>Scilab</td>
			<td>SL.VI1243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L beaker</td>
			<td>Dong Sung Science</td>
			<td>SDS 2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL cornical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL beaker</td>
			<td>Korea Ace Scientific</td>
			<td>KA.23-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL bottle-top vacuum filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL plastic container</td>
			<td>LOCK&#38;LOCK</td>
			<td>INL301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>DAEKYO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bar</td>
			<td>Korea Ace Scientific</td>
			<td>BA.37110-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>SC.MG100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1095350001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve filter mesh</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decellularization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x pbs</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7% Peracetic acid</td>
			<td>Omegafarm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>SAMCHUN CHEMICALS</td>
			<td>E0220 SAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPA</td>
			<td>SAMCHUN CHEMICALS</td>
			<td>samchun I0348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>T1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 N NaOH</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>S2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramine T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitin sulfate A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>46933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Merok</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>SAMCHUN CHEMICALS</td>
			<td>S2097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-DAB</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>SX0607N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate(monobasic)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioink</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charicterized FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose bengal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink for printing 3d cell-laden pancreatic tissue constructs

Die Transplantation von Pankreasinseln ist eine vielversprechende Behandlung für Patienten, die an Typ-1-Diabetes leiden, begleitet von Hypoglykämie und sekundären Komplikationen. Die Inseltransplantation hat jedoch noch einige Einschränkungen, wie z. B. die geringe Lebensfähigkeit transplantierter Inselchen aufgrund schlechter Inselverordnung und feindlicher Umgebungen. Darüber hinaus haben die Insulin produzierenden Zellen, die sich von menschlichen pluripotenten Stammzellen unterscheiden, nur begrenzte Fähigkeit, ausreichende Hormone zu sezernieren, die den Blutzuckerspiegel regulieren können; Daher ist eine Verbesserung der Reifung durch die Kultivierung von Zellen mit geeigneten mikroökologischen Hinweisen dringend erforderlich. In diesem Artikel erläutern wir Protokolle zur Vorbereitung einer pankreasischen, dezellularisierten extrazellulären Matrix (pdECM)-Bioink, um eine vorteilhafte Mikroumgebung zu schaffen, die die Glukoseempfindlichkeit von Pankreasinseln erhöhen kann, die Prozesse zur Erzeugung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten mit einer Mikroextrusions-basierten Bioprinting-Technik.

Dezellularisierung von Bauchspeicheldrüsengewebe Wir haben das Verfahren zur Herstellung von pdECM-Bioink entwickelt, um pankreasgewebespezifische Mikroumgebungen zur Verbesserung der Funktionalität von Inselchen in einem 3D-Biodruckgewebekonstrukt bereitzustellen (Abbildung 2A). Nach dem Dezellularisierungsprozess wurden 97,3 % der dsDNA entfernt und repräsentative ECM-Komponenten wie Kollagen und GAGs blieben bei 1278...

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Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Dezelluläre extrazelluläre Matrix (dECM) kann geeignete mikroökologische Hinweise liefern, um die inhärenten Funktionen von Zielgeweben in einem konstruierten Konstrukt zu rekapitulieren. Dieser Artikel erläutert die Protokolle für die Dezellularisierung von Bauchspeicheldrüsengewebe, die Bewertung von DECM-Bioink aus Bauchspeicheldrüsengewebe und die Generierung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten mit einer Bioprinting-Technik.

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

pdECM bioink kann eine vorteilhafte Mikroumgebung für Pankreasinseln mit gewebespezifischen Komponenten und Architektur bieten und hat optimale neurologische Eigenschaften, die zellabdeaths reduzieren und ihre Bedruckbarkeit erhöhen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die gewebespezifische Zusammensetzung innerhalb des pdECM-Bioinks erhalten werden kann, der einen konstruktiven Überlauf zwischen 3D-Pankreasgewebekonstrukten und verkapselten Inselchen fördert. Die Entwicklung der Isletverkapselung in pdECM-Bioink kann auf die Herstellung von transplantierbaren Pankreasgewebekonstrukten zur Behandlung von Typ-1-Diabetes angewendet werden.Dieser Bioink kann verwendet werden, um die Anwendung von transplantierbaren Konstrukten sowie In-vitro-Gewebemodellen für Diabetes, Diabetes-bedingte Komplikationen und Bauchspeicheldrüsenkrebs zu erweitern. Für die Dezellularisierung einer gefrorenen Pankreas-Gewebeprobe mit einem gefrorenen Schweinebauch verwenden, um die gefrorene Bauchspeicheldrüse in einen Millimeter dicke Stücke zu schneiden und 50 Gramm des in Scheiben geschnittenen Gewebes in einen 500-Milliliter-Kunststoffbehälter zu übertragen. Waschen Sie das Gewebe mit 300 Millilitern destilliertem Wasser bei vier Grad Celsius auf einem digitalen Orbital-Shaker mit 150 Umdrehungen pro Minute für etwa 12 Stunden.Wenn das trübe Wasser verschwindet, ersetzen Sie das Wasser 84 Stunden lang durch 400 Milliliter 1%Triton-X 100 in PBS. Am Ende der Waschmittelbehandlung das Gewebe mit 400 MilliliterIsopropanol für zwei Stunden inkubieren, um das restliche Fett aus der Bauchspeicheldrüse zu entfernen, gefolgt von einer 24-Stunden-Wäsche in 400 Milliliter PBS. Am Ende der Wäsche, sterilisieren Sie das dezellularisierte Gewebe mit 400 Milliliter 0,1%Peressigsäure in 4%Ethanol für zwei Stunden, bevor Sie die Probe mit 400 Milliliter frisches PBS für sechs Stunden waschen, um restliche Waschmittel zu entfernen.Am Ende der Wäsche, verwenden Sie Zange, um die Gewebeteile in ein 50 Milliliter konisches Rohr zu übertragen und die Probe bei minus 80 Grad Celsius für eine Stunde wieder einzufrieren. Dann bedecken Sie das konische Rohr mit einem fusselfreien Wisch, der mit einem Gummiband fixiert ist, und lyophilisieren Sie das dezellularisierte Gewebe vier Tage lang bei minus 50 Grad Celsius. Um den Bioink vorzubereiten, übertragen Sie 200 Milligramm gefriergetrocknetes pdECM in eine neue 50 Milliliter konische Röhre und fügen Sie 20 Milligramm Pepsin und 8,4 Milliliter 0,5 Molessigsäure in die Gewebeprobe.Dann legen Sie einen magnetischen Rührstab in die Röhre für eine 96-stündige Rühreninkubation bei 300 Umdrehungen pro Minute. Verwenden Sie am Ende der Inkubation ein 40-Mikrometer-Zellsieb und eine positive Verdrängungspipette, um die Lösung in ein neues Rohr auf Eis zu filtern, um unverdaute Partikel herauszufiltern und dem Rohr einen Milliliter 10X PBS hinzuzufügen. Verwenden Sie nach dem Wirbeln Natriumhydroxid, um den pH-Wert der Lösung auf sieben einzustellen.Um den Bioink für den 3D-Zelldruck eines Pankreaskonstrukts mit einer gemusterten Struktur vorzubereiten, färben Sie ein Aliquot von pdECM-Bioink mit 0,4%Trypan Blue und ein Aliquot mit Rose Bengal Solution im Verhältnis eins bis 20. Dann verwenden Sie eine positive VerschiebungPipetten, um jede Bioink-Lösung mit einer mittelschwebenden Islet-Lösung im Verhältnis von drei zu eins zu einer endgültigen Konzentration von 1,5 % und einer Zelldichte von dreimal 10 zu den drei Islet-Äquivalenten pro Milliliter vorsichtig zu mischen. Für den 3D-Zelldruck von multimaterialbasierten Pankreasgewebekonstrukten laden Sie jedes Bioink-Islet-Gemisch in einzelne sterilisierte Spritzen, die mit 25-Spur-Düsen ausgestattet sind, und drucken Sie jeden Bioink unter optimierten Druckbedingungen bei 18 Grad Celsius in Form eines Gitters mit abwechselnden Linien von Blau und Rot.Um den Bioink miteinander zu vernetzen, legen Sie das gedruckte Konstrukt 30 Minuten lang in einen 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Zellkultur-Inkubator. Dann tauchen Sie das gedruckte Konstrukt in RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10%fetalen Rinderserum und 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und Streptomycin. Nach dem Dezellularisierungsprozess werden 97,3% der doppelsträngigen DNA entfernt und die repräsentativen extrazellulären Matrixkomponenten wie Kollagen und Glycosaminoglykanen bleiben bei 1278,1% bzw. 96,9% im Vergleich zu dem des nativen Bauchspeicheldrüsengewebes.In dieser repräsentativen Analyse zeigte der pdECM-Bioink ein Scherverdünnungsverhalten mit einem Wert von etwa 10 Pascal pro Sekunde bei einer Scherrate von einem pro Sekunde, was darauf hindeutet, dass der Bioink die geeigneten rheologischen Eigenschaften für die Extrusion durch eine Düse aufweist. Darüber hinaus begann der komplexe Modul des Bioinks zu steigen, als die Temperatur 15 Grad Celsius erreichte und schnell anstieg, wenn die Temperatur bei 37 Grad Celsius gehalten wurde, was auf den Sol-Gel-Übergang der Lösung hindeutet. Die dynamische G-Prim- und G-Doppelprime des pdECM-Bioinks wurden bei physiologisch relevanten Temperaturen untersucht, um ihre Stabilität nach dem Druckprozess zu gewährleisten, was zu einem stabilen Modul unter der Frequenz-Sweep-Bedingung führte.Mit Hilfe eines Multihead-Drucksystems konnten dann verschiedene Arten von 3D-Konstrukten hergestellt werden, wie mit dem entwickelten pdECM demonstriert wurde, das die Vielseitigkeit von pdECM zum Zwecke des 3D-Bioprintings demonstriert, um zwei oder mehr Arten von lebenden Geweben in einer gewebeähnlichen Anordnung zu harmonisieren. Seien Sie sanft beim Mischen des Bioinks mit den Zellen, um Zelltod und Blasenbildung zu vermeiden, da das Vorhandensein von Blasen die Druckauflösung senkt und die Zelllebensfähigkeit verringert. Die Funktionalität der gekapselten Pankreasinseln innerhalb der 3D-Pankreasgewebekonstrukte kann durch Immunfluoreszenzfärbung oder einen Glukosetoleranztest beurteilt werden.Diese pdECM-Bioink- und 3D-Bioprinting-Technik kann potenziell für die Entwicklung funktioneller Pankreasgewebekonstrukte im Bereich der Gewebetechnik eingesetzt werden. Die Forscher sollten die geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen, um Verletzungen beim Umgang mit der scharfen Reibe und den Reagenzien zu verhindern.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

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Forschung

Biotechnik

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

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Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

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