Name: pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink for printing 3d cell-laden pancreatic tissue constructs
Uploaded: 2019-12-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta dal Bio & Medical Technology Development Program della National Research Foundation (NRF) finanziato dal governo coreano (MSIT) (2017M3A9C6032067) e da "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) supervisionato dall'IITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation).

Tessuti pancreatici porcini sono stati raccolti da un macello locale. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Asan Medical Center di Seoul, Corea.
1. Decellularizzazione dei tessuti
<ol><li>Preparare le soluzioni per la decellularizzazione. NOTA: 1x salina con buffer fosfato (PBS) utilizzata in tutti i preparati della soluzione viene diluita aggiungendo acqua distillata a 10 volte PBS.<ol>
<li>Per la soluzione 1% Tri...

<ol>
	<li>Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pancreatic+islet+transplantation.">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).</li><li>Venturini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique,+complications,+and+therapeutic+efficacy+of+percutaneous+transplantation+of+human+pancreatic+islet+cells+in+type+1+diabetes:+the+role+of+US.">Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US.</a> Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).</li><li>Xie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoprotection+of+PEG-modified+adult+porcine+pancreatic+islets+for+improved+xenotransplantation.">Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation.</a> Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).</li><li>Sackett, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffold+and+hydrogel+derived+from+decellularized+and+delipidized+human+pancreas.">Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+printing+of+islet-laden+pancreatic+tissue-derived+extracellular+matrix+bioink+constructs+for+enhancing+pancreatic+functions.">3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions.</a> Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).</li><li>Yi, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioprinted+human-glioblastoma-on-a-chip+for+the+identification+of+patient-specific+responses+to+chemoradiotherapy.">A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+extracellular+matrix+bioinks+and+the+external+stimuli+to+enhance+cardiac+tissue+development+in+vitro.">Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro.</a> Acta Biomaterialia. , (2019).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+alignment+of+collagen+fibrils+using+3D+cell+printing+for+corneal+stroma+tissue+engineering.">Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering.</a> Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).</li><li>Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+replacement+for+islet+equivalents+with+improved+reliability+and+validity.">A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity.</a> Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).</li><li>Pati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+three-dimensional+tissue+analogues+with+decellularized+extracellular+matrix+bioink.">Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink.</a> Nature Communications. 5, 3935 (2014).</li><li>Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-based+materials+for+regenerative+medicine.">Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 1, (2018).</li><li>Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+extracellular+matrix:+a+step+towards+the+next+generation+source+for+bioink+manufacturing.">Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing.</a> Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).</li><li>Gaetani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+different+decellularization+protocols+on+the+generation+of+pancreas-derived+hydrogels.">Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).</li><li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+bio-blood-vessels+constructed+using+a+tissue-specific+bioink+and+3D+coaxial+cell+printing+technique:+a+novel+therapy+for+ischemic+disease.">Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease.</a> Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).</li><li>La, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemically+replicated+organic+and+inorganic+bony+microenvironment+for+new+bone+formation+generated+by+a+3D+printing+technology.">Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology.</a> RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+liver+decellularized+extracellular+matrix+bioink+for+three-dimensional+cell+printing-based+liver+tissue+engineering.">Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering.</a> Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).</li><li>Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-derived+decellularized+extracellular+matrix:+a+game+changer+for+bioink+manufacturing?.">Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing?.</a> Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).</li><li>Kurpios, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direction+of+gut+looping+is+established+by+changes+in+the+extracellular+matrix+and+in+cell:+cell+adhesion.">The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423 (6942), 876 (2003).</li></ol>

Questo protocollo ha descritto lo sviluppo di bioinks pdECM e la fabbricazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando tecniche di stampa cellulare 3D. Per ricapitolare il microambiente del tessuto bersaglio nel costrutto di tessuto ingegnerizzato 3D, la scelta del bioink è fondamentale. In uno studio precedente, abbiamo convalidato che i bioink dECM specifici dei tessuti sono utili per promuovere la differenziazione delle cellule staminali e la proliferazione10. Rispetto ai polimeri s...

Recentemente, il trapianto di islet pancreatico è stato considerato un trattamento promettente per i pazienti con diabete di tipo 1. La relativa sicurezza e la minima invasività della procedura sono grandi vantaggi di questo trattamento1. Tuttavia, ha diverse limitazioni come il basso tasso di successo delle isole isolare e gli effetti collaterali dei farmaci immunosoppressori. Inoltre, il numero di isolotti innevati diminuisce costantemente dopo il trapianto a causa dell'ambiente ostile2. Vari materiali biocompatibili come algerino, collagene, poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) o glicole di polietilene (PEG) sono stati applicati al trapianto di islet pancreatico per superare queste difficoltà.
La tecnologia di stampa cellulare 3D sta emergendo nell'ingegneria tissutale a causa del suo grande potenziale e delle sue alte prestazioni. Inutile dire che i bioinchi sono noti come componenti importanti per fornire un microambiente adatto e consentire il miglioramento dei processi cellulari nei costrutti di tessuto stampato. Un numero considerevole di idrogel che dilaniano la cesoia come fibrina, alginato e collagene sono ampiamente utilizzati come bioinks. Tuttavia, questi materiali mostrano una mancanza di complessità strutturale, chimica, biologica e meccanica rispetto alla matrice extracellulare (ECM) nel tessuto nativo3. I segnali microambientali come le interazioni tra isolotti ed ECM sono segnali importanti per migliorare la funzione delle isolotti. Decellularizzato ECM (dECM) può ricreare la composizione specifica del tessuto di vari componenti ECM tra cui collagene, glicosaminoglicani (GAG) e glicoproteine. Ad esempio, le isole primarie che mantengono le loro ECU periferiche (ad esempio, le interazioni di tipo I, III, IV, V e VI collagene, laminina e fibronectina) presentano una bassa apoptosi e una migliore sensibilità all'insulina, indicando così che le interazioni cellula-matrice specifiche del tessuto sono importanti per migliorare la loro capacità di funzionare in modo simile al tessuto originale4.
In questo articolo, chiariamo i protocolli per la preparazione di bioinchiostro a matrice extracellulare decellularizzata decellularizzata (pdECM) di tessuto pancreatico per fornire segnali microambientali benefici per aumentare l'attività e le funzioni delle isole pancreatiche, seguiti dai processi per la generazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando una tecnica di biostampabasatasu microestrusingne ( Figura 1 ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinets</td>
			<td>CRYSTE</td>
			<td>PURICUBE 1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Freezer</td>
			<td>Thermo Scientific Forma</td>
			<td>957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital orbital shaker</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>DH.WSO04010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry oven</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>WON-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>7670540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>SANSUNG</td>
			<td>CRFD-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grater</td>
			<td>ABM</td>
			<td>1415605793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscopes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>CRYSTE</td>
			<td>PURISPIN 17R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Multiskan GO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>CF-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Hotplate Stirrers</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>SMHS-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE-PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH benchtop meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheometer</td>
			<td>TA Instrument</td>
			<td>Discovery HR-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>VM-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cirurgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>Hirose</td>
			<td>HC.13-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Korea Ace Scientific</td>
			<td>HC.203-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml glass vial</td>
			<td>Scilab</td>
			<td>SL.VI1243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L beaker</td>
			<td>Dong Sung Science</td>
			<td>SDS 2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL cornical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL beaker</td>
			<td>Korea Ace Scientific</td>
			<td>KA.23-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL bottle-top vacuum filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL plastic container</td>
			<td>LOCK&#38;LOCK</td>
			<td>INL301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>DAEKYO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bar</td>
			<td>Korea Ace Scientific</td>
			<td>BA.37110-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>SC.MG100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1095350001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve filter mesh</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decellularization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x pbs</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7% Peracetic acid</td>
			<td>Omegafarm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>SAMCHUN CHEMICALS</td>
			<td>E0220 SAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPA</td>
			<td>SAMCHUN CHEMICALS</td>
			<td>samchun I0348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>T1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 N NaOH</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>S2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramine T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitin sulfate A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>46933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Merok</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>SAMCHUN CHEMICALS</td>
			<td>S2097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-DAB</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>SX0607N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate(monobasic)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioink</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charicterized FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose bengal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink for printing 3d cell-laden pancreatic tissue constructs

Il trapianto di isole pancreatiche è un trattamento promettente per i pazienti che soffrono di diabete di tipo 1 accompagnato da ipoglicemia e complicazioni secondarie. Tuttavia, il trapianto di isole presenta ancora diverse limitazioni, come la scarsa vitalità delle isole trapiantate a causa di un cattivo innesto di isole e di ambienti ostili. Inoltre, le cellule che producono insulina differenziata dalle cellule staminali pluripotenti umane hanno capacità limitate di secernere ormoni sufficienti che possono regolare il livello di glucosio nel sangue; pertanto, è fortemente necessario migliorare la maturazione colticce le cellule con adeguati segnali microambientali. In questo articolo, chiariamo i protocolli per la preparazione di un bioink a matrice extracellulare decellularizzata decellularizzata (pdECM) derivato dal tessuto pancreatico per fornire un microambiente benefico che può aumentare la sensibilità al glucosio delle isole pancreatiche, seguito da descrivere i processi per la generazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando una tecnica di biostampa basata sulla microestrusione.

Decellularizzazione dei tessuti pancreatici Abbiamo sviluppato il processo di preparazione del bioink pdECM per fornire microambienti specifici del tessuto pancreatico per migliorare la funzionalità delle isolotti in un costrutto di tessuto biostampato 3D (Figura 2A). Dopo il processo di decellularizzazione, il 97,3% del dsDNA è stato rimosso e componenti ECM rappresentativi come collagene e GAG sono rimasti rispettivame...

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Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

La matrice extracellulare decellularizzata (dECM) può fornire adeguati segnali microambientali per ricapitolare le funzioni intrinseche dei tessuti bersaglio in un costrutto ingegnerizzato. Questo articolo chiarisce i protocolli per la decellularizzazione del tessuto pancreatico, la valutazione del bioink dECM derivato dal tessuto pancreatico e la generazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando una tecnica di biostampa.

Bioinchiostro a matrice extracellulare derivato dal tessuto pancreatico per la stampa di costrutti di tessuto pancreatico 3D Cell-Laden

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Il bioinvecco pdECM può fornire un microambiente benefico per gli isolotti pancreatici utilizzando componenti e architettura specifici dei tessuti e ha proprietà neurologiche ottimali che riducono la morte cellulare e aumentano la loro stampabilità. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la composizione specifica del tessuto può essere preservata all'interno del bioink pdECM promuovendo un crosstalk costruttivo tra costrutti di tessuto pancreatico 3D e isolotti incapsulati. Lo sviluppo dell'incapsulamento dell'isolotto nel bioink pdECM può essere applicato alla fabbricazione di costrutti di tessuto pancreatico trapiantabili per il trattamento del diabete di tipo uno.Questo bioink può essere utilizzato per ampliare l'applicazione di costrutti trapiantabili e modelli di tessuti in vitro per diabete, complicanze legate al diabete e cancro al pancreas. Per la decellularizzazione di un campione di tessuto pan pancreas suino congelato, utilizzare una grattugia per affettare il pancreas congelato in pezzi spessi un millimetro e trasferire 50 grammi del tessuto affettato in un contenitore di plastica da 500 millilitri. Lavare il tessuto con 300 millilitri di acqua distillata a quattro gradi Celsius su uno shaker orbitale digitale a 150 rotazioni al minuto per circa 12 ore.Quando l'acqua torbosa scompare, sostituire l'acqua con 400 millilitri di 1%Triton-X 100 in PBS per 84 ore. Al termine del trattamento detergente, incubare il tessuto con 400 millilitri di isopropanolo per due ore per rimuovere il grasso rimanente dal pancreas, seguito da un lavaggio 24 ore su 24 in 400 millilitri di PBS. Al termine del lavaggio, sterilizzare il tessuto decellularizzato con 400 millilitri di acido peracetico allo 0,1% in etanolo al 4% per due ore prima di lavare il campione con 400 millilitri di PBS fresco per sei ore per rimuovere eventuali detergenti residui.Alla fine del lavaggio, utilizzare le forcelle per trasferire i pezzi di tessuto in un tubo conico da 50 millilitri e ricongelare il campione a meno 80 gradi Celsius per un'ora. Quindi coprire il tubo conico con una salvietta senza pelucchi fissata con un elastico e liofilizzare il tessuto decellularizzato a meno 50 gradi Celsius per quattro giorni. Per preparare il bioink, trasferire 200 milligrammi di pdECM liofilizzato in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e aggiungere 20 milligrammi di pepsina e 8,4 millilitri di acido acetico molare 0,5 al campione di tessuto.Quindi posizionare una barra di agitazione magnetica nel tubo per un'incubazione di agitazione di 96 ore a 300 rotazioni al minuto. Al termine dell'incubazione, utilizzare un filtro cellulare da 40 micrometri e una pipetta di spostamento positivo per filtrare la soluzione in un nuovo tubo sul ghiaccio per filtrare eventuali particelle non digerite e aggiungere un millilitro di 10X PBS al tubo. Dopo il vortice, utilizzare idrossido di sodio per regolare il pH della soluzione a sette.Per preparare il bioink per la stampa cellulare 3D di un costrutto pancreatico con una struttura a motivi geometrici, macchiare un'aliquota di bioink pdECM con 0,4%Trypan Blue e un'aliquota con soluzione bengalese rosa con un rapporto uno a 20. Quindi utilizzare una pipetta di spostamento positiva per mescolare delicatamente ogni soluzione di bioink con una soluzione di isolotto sospesa media a un rapporto tre a uno a una concentrazione finale di bioink dell'1,5% e una densità cellulare di tre volte 10 al tre isolotto equivalente per millilitro. Per la stampa cellulare 3D di costrutti di tessuto pancreatico a base multimateriale, caricare ogni miscela di isolotto bionk in singole siringhe sterilizzate dotate di ugelli calibro 25 e stampare in 3D ogni bioink in condizioni di stampa ottimizzate a 18 gradi Celsius a forma di reticolo con linee alternate di blu e rosso.Per collegare il bioink, posizionare il costrutto stampato in un incubatore di coltura di cellule di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% per 30 minuti. Immergere quindi il costrutto stampato nel mezzo RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale al 10% e 100 unità per millilitro di penicillina e streptomicina. Dopo il processo di decellularizzazione, il 97,3% del DNA a doppio filamento viene rimosso e i componenti rappresentativi della matrice extracellulare come collagene e glicosaminoglicani rimangono rispettivamente al 1278,1% e al 96,9% rispetto a quello del tessuto pancreatico nativo.In questa analisi rappresentativa, il bioink pdECM ha mostrato un comportamento di assottigliamento a taglio con un valore di circa 10 pascal al secondo alla velocità di taglio di uno al secondo indicando che il bioink ha dimostrato le caratteristiche reologiche appropriate per l'estrusione attraverso un ugello. Inoltre, il modulo complesso del bioink ha iniziato ad aumentare quando la temperatura ha raggiunto i 15 gradi Celsius e rapidamente è aumentato quando la temperatura è stata mantenuta a 37 gradi Celsius indicando la transizione sol-gel della soluzione. Il primo G dinamico e il doppio primo G del bioink pdECM sono stati studiati a temperature fisiologicamente rilevanti per garantirne la stabilità dopo il processo di stampa con conseguente raggiungimento di un modulo stabile nelle condizioni di sweep di frequenza.Utilizzando un sistema di stampa multihead, vari tipi di costrutti 3D potrebbero quindi essere fabbricati come dimostrato utilizzando il pdECM sviluppato dimostrando la versatilità di pdECM ai fini della biostammpa 3D per armonizzare due o più tipi di tessuti viventi in una disposizione tissutale. Sii delicato quando mescola il bioink con le cellule per evitare la morte cellulare e la formazione di bolle poiché la presenza di bolle abbassa la risoluzione di stampa e riduce la vitalità cellulare. La funzionalità degli isolotti pancreatici incapsulati all'interno dei costrutti del tessuto pancreatico 3D può essere valutata mediante colorazione ad immunofluorescenza o un test di tolleranza al glucosio.Questa tecnica di biovettiva pdECM e biostampa 3D può potenzialmente essere utilizzata per lo sviluppo di costrutti funzionali di tessuto pancreatico nel campo dell'ingegneria tissutale. I ricercatori devono indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati per prevenire lesioni durante la manipolazione della grattugia affilata e dei reagenti.

Research

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Bioengineering

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Ricerca

Bioingegneria

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