Name: pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink for printing 3d cell-laden pancreatic tissue constructs
Uploaded: 2019-12-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de Desenvolvimento de Biotecnologia e Tecnologia Médica da National Research Foundation (NRF) financiado pelo governo coreano (MSIT) (2017M3A9C6032067) e "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) e "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) supervisionado pelo IITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation).

Tecidos pancreáticos suínos foram coletados de um matadouro local. Experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Asan Medical Center, Seul, Coréia.
1. Descelularização de tecidos
<ol><li>Prepare as soluções para a descelularização. NOTA: 1x fosfato-buffered soro lógico (PBS) usado em todos os preparativos de solução é diluído pela adição de água destilada para 10x PBS.<ol>
<li>Para a solução Triton-X 100 de 1%, diss...

<ol>
	<li>Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pancreatic+islet+transplantation.">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).</li><li>Venturini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique,+complications,+and+therapeutic+efficacy+of+percutaneous+transplantation+of+human+pancreatic+islet+cells+in+type+1+diabetes:+the+role+of+US.">Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US.</a> Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).</li><li>Xie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoprotection+of+PEG-modified+adult+porcine+pancreatic+islets+for+improved+xenotransplantation.">Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation.</a> Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).</li><li>Sackett, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffold+and+hydrogel+derived+from+decellularized+and+delipidized+human+pancreas.">Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+printing+of+islet-laden+pancreatic+tissue-derived+extracellular+matrix+bioink+constructs+for+enhancing+pancreatic+functions.">3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions.</a> Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).</li><li>Yi, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioprinted+human-glioblastoma-on-a-chip+for+the+identification+of+patient-specific+responses+to+chemoradiotherapy.">A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+extracellular+matrix+bioinks+and+the+external+stimuli+to+enhance+cardiac+tissue+development+in+vitro.">Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro.</a> Acta Biomaterialia. , (2019).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+alignment+of+collagen+fibrils+using+3D+cell+printing+for+corneal+stroma+tissue+engineering.">Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering.</a> Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).</li><li>Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+replacement+for+islet+equivalents+with+improved+reliability+and+validity.">A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity.</a> Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).</li><li>Pati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+three-dimensional+tissue+analogues+with+decellularized+extracellular+matrix+bioink.">Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink.</a> Nature Communications. 5, 3935 (2014).</li><li>Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-based+materials+for+regenerative+medicine.">Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 1, (2018).</li><li>Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+extracellular+matrix:+a+step+towards+the+next+generation+source+for+bioink+manufacturing.">Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing.</a> Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).</li><li>Gaetani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+different+decellularization+protocols+on+the+generation+of+pancreas-derived+hydrogels.">Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).</li><li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+bio-blood-vessels+constructed+using+a+tissue-specific+bioink+and+3D+coaxial+cell+printing+technique:+a+novel+therapy+for+ischemic+disease.">Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease.</a> Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).</li><li>La, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemically+replicated+organic+and+inorganic+bony+microenvironment+for+new+bone+formation+generated+by+a+3D+printing+technology.">Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology.</a> RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+liver+decellularized+extracellular+matrix+bioink+for+three-dimensional+cell+printing-based+liver+tissue+engineering.">Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering.</a> Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).</li><li>Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-derived+decellularized+extracellular+matrix:+a+game+changer+for+bioink+manufacturing?.">Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing?.</a> Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).</li><li>Kurpios, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direction+of+gut+looping+is+established+by+changes+in+the+extracellular+matrix+and+in+cell:+cell+adhesion.">The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423 (6942), 876 (2003).</li></ol>

Este protocolo descreveu o desenvolvimento de bioinks pdECM e a fabricação de construções de tecidopanpático 3D usando técnicas de impressão de células 3D. Para recapitular o microambiente do tecido alvo na construção de tecidos projetados em 3D, a escolha do bioink é fundamental. Em um estudo anterior, validamos que bioinks de dECM específicos do tecido são benéficos para promover a diferenciação de células-tronco e proliferação10. Em comparação com polímeros sintéticos, o ...

Recentemente, o transplante de ilhotas pancreáticas tem sido considerado um tratamento promissor para pacientes com diabetes tipo 1. A segurança relativa e a invasidão mínima do procedimento são grandes vantagens deste tratamento1. No entanto, tem várias limitações, como a baixa taxa de sucesso de ilhotas isolante e os efeitos colaterais das drogas imunossupressoras. Além disso, o número de ilhotas enxertadas diminui de forma constante após o transplante devido ao ambiente hostil2. Vários materiais biocompatíveis, como alginato, colágeno, poli (ácido láctico-coglicólico) (PLGA) ou polietilenoglicol (PEG) foram aplicados ao transplante de ilhotas pancreáticas para superar essas dificuldades.
A tecnologia de impressão de células 3D está surgindo em engenharia de tecidos devido ao seu grande potencial e alto desempenho. Escusado será dizer que os bioinks são conhecidos como componentes importantes para fornecer um microambiente adequado e permitir a melhoria dos processos celulares em construções de tecidos impressos. Um número substancial de hidrogéis de afinamento de tesoura, como fibrina, alginato e colágeno são amplamente utilizados como bioinks. No entanto, esses materiais mostram falta de complexidade estrutural, química, biológica e mecânica em comparação com a matriz extracelular (ECM) no tecido nativo3. Pistas microambientais, como as interações entre ilhotas e ECM são sinais importantes para melhorar a função das ilhotas. ECM descelularizado (dECM) pode recriar a composição específica do tecido de vários componentes de ECM, incluindo colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs) e glicoproteínas. Por exemplo, ilhotas primárias que retêm seus ECMs periféricos (por exemplo, tipo I, III, IV, V e VI colágeno, laminina e fibronectina) exibem baixa apoptose e melhor sensibilidade à insulina, indicando assim que as interações de matriz celular específicas do tecido são importantes para melhorar sua capacidade de funcionar de forma semelhante ao tecido original4.
Neste artigo, elucidamos protocolos para a preparação de biotilidade sacarcelulares descelularizadas (pdECM) derivadas de tecidos pancreáticos (pdECM) para fornecer sugestões microambientais benéficas para impulsionar a atividade e as funções das ilhotas pancreáticas, seguidas pelos processos de geração de construções de tecidos pancreáticos 3D usando uma técnica de bioimpressão baseada em microextrusion (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinets</td>
			<td>CRYSTE</td>
			<td>PURICUBE 1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Freezer</td>
			<td>Thermo Scientific Forma</td>
			<td>957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital orbital shaker</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>DH.WSO04010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry oven</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>WON-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>7670540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>SANSUNG</td>
			<td>CRFD-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grater</td>
			<td>ABM</td>
			<td>1415605793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscopes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>CRYSTE</td>
			<td>PURISPIN 17R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Multiskan GO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>CF-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Hotplate Stirrers</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>SMHS-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE-PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH benchtop meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheometer</td>
			<td>TA Instrument</td>
			<td>Discovery HR-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>VM-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cirurgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>Hirose</td>
			<td>HC.13-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Korea Ace Scientific</td>
			<td>HC.203-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml glass vial</td>
			<td>Scilab</td>
			<td>SL.VI1243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L beaker</td>
			<td>Dong Sung Science</td>
			<td>SDS 2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL cornical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL beaker</td>
			<td>Korea Ace Scientific</td>
			<td>KA.23-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL bottle-top vacuum filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL plastic container</td>
			<td>LOCK&#38;LOCK</td>
			<td>INL301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>DAEKYO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bar</td>
			<td>Korea Ace Scientific</td>
			<td>BA.37110-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>SC.MG100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1095350001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve filter mesh</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decellularization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x pbs</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7% Peracetic acid</td>
			<td>Omegafarm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>SAMCHUN CHEMICALS</td>
			<td>E0220 SAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPA</td>
			<td>SAMCHUN CHEMICALS</td>
			<td>samchun I0348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>T1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 N NaOH</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>S2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramine T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitin sulfate A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>46933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Merok</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>SAMCHUN CHEMICALS</td>
			<td>S2097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-DAB</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>SX0607N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate(monobasic)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioink</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charicterized FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose bengal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink for printing 3d cell-laden pancreatic tissue constructs

O transplante de ilhotas pancreáticas é um tratamento promissor para pacientes que sofrem de diabetes tipo 1 acompanhado sofrem de hipoglicemia e complicações secundárias. No entanto, o transplante de ilhotas ainda tem várias limitações, como a baixa viabilidade das ilhotas transplantadas devido ao mau enxenxerto de ilhotas e ambientes hostis. Além disso, as células produtoras de insulina diferenciadas das células-tronco pluripotentes humanas têm capacidade limitada de secretar hormônios suficientes que podem regular o nível de glicose no sangue; Portanto, melhorar a maturação, cultivando células com pistas microambientais adequadas é fortemente necessária. Neste artigo, elucidamos protocolos para a preparação de um biotilétil de matriz extracelular descelular descelular (pdECM) derivado do tecido pancreático para fornecer um microambiente benéfico que pode aumentar a sensibilidade à glicose das ilhotas pancreáticas, seguida pela descrição os processos para a geração de tecidos pancreáticos 3D são construídos por meio de uma técnica de bioimpressão baseada em microextrusão.

Descelularização dos tecidos pancreáticos Desenvolvemos o processo de preparação de biotilidade pdECM para fornecer microambientes específicos de tecido pancreático para melhorar a funcionalidade das ilhotas em uma construção de tecido bioimpresso 3D (Figura 2A). Após o processo de descelularização, 97,3% do dsDNA foi removido e os componentes representativos da ECM, como colágeno e GAGs, permaneceram em 1278,...

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Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

A matriz extracelular descelularizada (dECM) pode fornecer pistas microambientais adequadas para recapitular as funções inerentes dos tecidos-alvo em uma construção projetada. Este artigo elucida os protocolos para a descelularização do tecido pancreático, avaliação do bioink dECM derivado do tecido pancreático e geração de construções de tecidopanpático 3D usando uma técnica de bioimpressão.

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

o bioink pdECM pode fornecer um microambiente benéfico para ilhotas pancreáticas usando componentes e arquitetura específicos do tecido e tem propriedades neurológicas ideais que reduzem as mortes celulares e aumentam sua impressão. A principal vantagem dessa técnica é que a composição específica do tecido pode ser preservada dentro do bioink pdECM promovendo um crosstalk construtivo entre construções de tecido pancreático 3D e ilhotas encapsuladas. O desenvolvimento do encapsulamento de ilhotas no bioink pdECM pode ser aplicado à fabricação de construções transplantáveis de tecido pancreático para o tratamento de diabetes tipo um.Este bioink pode ser usado para ampliar a aplicação de construtos transplantáveis, bem como modelos de tecido in vitro para diabetes, complicações relacionadas ao diabetes e câncer de pâncreas. Para a descelularização de uma amostra de tecido de pâncreas suíno congelado, use um ralador para cortar o pâncreas congelado em pedaços de um milímetro de espessura e transfira 50 gramas do tecido fatiado em um recipiente plástico de 500 mililitros. Lave o tecido com 300 mililitros de água destilada a quatro graus Celsius em um agitador orbital digital a 150 rotações por minuto por aproximadamente 12 horas.Quando a água turva desaparecer, substitua a água por 400 mililitros de 1%Triton-X 100 na PBS por 84 horas. No final do tratamento do detergente, incubar o tecido com 400 mililitros de isopropanol por duas horas para remover a gordura restante do pâncreas, seguido por uma lavagem de 24 horas em 400 mililitros de PBS. No final da lavagem, esterilize o tecido descelularizado com 400 mililitros de ácido peracético de 0,1% em 4% de etanol por duas horas antes de lavar a amostra com 400 mililitros de PBS fresco por seis horas para remover qualquer detergente residual.No final da lavagem, use fórceps para transferir os pedaços de tecido em um tubo cônico de 50 mililitros e recongelar a amostra a menos 80 graus Celsius por uma hora. Em seguida, cubra o tubo cônico com um lenço sem fiapos fixado com um elástico e liofilize o tecido descelularizado a menos 50 graus Celsius por quatro dias. Para preparar o bioink, transfira 200 miligramas de pdECM seco congelado para um novo tubo cônico de 50 mililitros e adicione 20 miligramas de pepsina e 8,4 mililitros de ácido acético molar de 0,5 para a amostra de tecido.Em seguida, coloque uma barra de agitação magnética no tubo para uma incubação de 96 horas de agitação a 300 rotações por minuto. No final da incubação, use um coador de células de 40 micrômetros e uma pipeta de deslocamento positiva para filtrar a solução em um novo tubo no gelo para filtrar quaisquer partículas não digeridas e adicionar um mililitro de 10X PBS ao tubo. Após o vórtice, use hidróxido de sódio para ajustar o pH da solução para sete.Para preparar o bioink para a impressão de células 3D de uma construção pancreática com uma estrutura padronizada, colora uma alíquota de bioink pdECM com 0,4%Trypan Blue e uma alíquota com Rose Bengal Solution em uma proporção de um a 20. Em seguida, use uma pipeta de deslocamento positiva para misturar suavemente cada solução de bioink com uma solução de ilhota suspensa média em uma proporção de três para um para uma concentração final de 1,5% bioink e uma densidade celular de três vezes 10 para o equivalente de três ilhotas por mililitro. Para a impressão celular 3D de construções de tecido pancreático de base multimaterial, carregue cada mistura de ilhotas de bioink em seringas esterilizadas individuais equipadas com bicos de 25 bitolas e imprimam 3D cada bioink em condições otimizadas de impressão a 18 graus Celsius na forma de uma rede com linhas alternadas de azul e vermelho.Para cruzar o bioink, coloque a construção impressa em uma incubadora de cultura celular de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, mergulhe a construção impressa em RPMI 1640 médio suplementado com soro bovino 10% fetal e 100 unidades por mililitro de penicilina e estreptomicina. Após o processo de descelularização, 97,3% do DNA de dupla garuda é removido e os componentes da matriz extracelular representativa, como colágeno e glicosaminoglicanos permanecem em 1278,1% e 96,9% em comparação com o tecido pancreático nativo, respectivamente.Nesta análise representativa, o bioink pdECM apresentou um comportamento de afinamento de tesoura com um valor de aproximadamente 10 pascals por segundo na taxa de tesoura de um por segundo indicando que o bioink demonstrou as características reológicas apropriadas para extrusão através de um bocal. Além disso, o módulo complexo do bioink começou a aumentar quando a temperatura atingiu 15 graus Celsius e rapidamente aumentou quando a temperatura foi mantida a 37 graus Celsius indicando a transição sol-gel da solução. O dinâmico G prime e G duplo prime do bioink pdECM foram investigados a temperaturas fisiologicamente relevantes para garantir sua estabilidade após o processo de impressão resultando na obtenção de um módulo estável sob a condição de varredura de frequência.Usando um sistema de impressão multifacetado, vários tipos de construções 3D poderiam então ser fabricados como demonstrado usando o pdECM desenvolvido demonstrando a versatilidade do pdECM com o propósito de bioimpressão 3D para harmonizar dois ou mais tipos de tecidos vivos em um arranjo semelhante a tecido. Seja gentil ao misturar o bioink com as células para evitar a morte celular e a formação de bolhas, pois a presença de bolhas reduz a resolução de impressão e reduz a viabilidade celular. A funcionalidade das ilhotas pancreáticas encapsuladas dentro das construções de tecido pancreático 3D pode ser avaliada por coloração de imunofluorescência ou um teste de tolerância à glicose.Esta técnica de bioink pdECM e bioimpressora 3D pode potencialmente ser usada para o desenvolvimento de construções funcionais de tecido pancreático no campo da engenharia de tecidos. Os pesquisadores devem usar os equipamentos de proteção individual adequados para evitar lesões ao manusear o ralador afiado e os reagentes.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Bioengenharia

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