Name: synthesis of information-bearing peptoids and their sequence-directed dynamic covalent self-assembly
Uploaded: 2020-02-06T13:00:00
Duration: 9 min 34 s
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Diese Arbeit wurde vom U.S. Department of Energy, Office of Science, Basic Energy Sciences, unter dem Award #DESC0012479 unterstützt. S.C.L. unterstützt das National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program und A.F.A. die Unterstützung der Abu Dhabi National Oil Company (ADNOC).

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die hierin enthaltene Technik beschreibt die dynamische kovalente Montage von informationstragenden Peptoidenoligomeren, bei der Informationen in der Reihenfolge ihrer Pendelgruppen kodiert werden. Die Verwendung eines Alloc-geschützten Aminmonomers in Verbindung mit einem Ethylen-Acetal-geschützten Aldehydmonomer ermöglicht einen orthogonalen Deprotection, der den Schutz von Alloc auf Perle und Acetal in situ während der Selbstmontagereaktion ermöglicht und somit sicherstellt, dass die synthetisierten Sequenzen nicht vor der Oligomerreinigung und -charakterisierung vorzeitig reagieren. Wichtig ist, dass die Festphasensynthese mit einem photolabilen Harz durchgeführt wird, um die Oligomerspaltung aus der Perle unter UV- oder violetter Lichtbestrahlung zu ermöglichen, was einen vorzeitigen Deprotection der säurelabilen, ethylenacetalbasierten Schutzgruppe ausschließt. Es könnten mehrere alternative Deschutzsysteme in Betracht gezogen werden. Zum Beispiel haben wir zunächst zwei säure-labile Schutzgruppen (Boc-Amin und Ethylenacetalaldehyd) mit der Absicht eingesetzt, in situ deprotection durch eine starke Säure gefolgt von Neutralisation, um die Selbstmontagereaktion zu ermöglichen; dieser Ansatz führte jedoch zur sofortigen Entstehung von Niederschlag bei Addition der Basis. Alternativ wurde ein Schutz des Amins mit einer photolabilen Schutzgruppe, 2-(2-Nitrophenyl)propoxycarbonyl (NPPOC), vorgesehen, da das Aldehyd bei der Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA) vor der Reinigung selektiv degeschützt werden konnte. Leider bot die In-situ-Photolyse der Schutzgruppe mit UV-Licht keinen quantitativen Deschutz, auch nicht in Gegenwart von Photosensitoren und nach längeren Bestrahlungsperioden25. Trimethylsilylethoxycarbonyl (d. h. Teoc) kann als Aminschutzgruppe eingesetzt werden und unterliegt bei der Behandlung mit Seltenerdmetalltriflates der Spaltung; Der quantitative Teoc-Deprotection erfordert jedoch wesentlich höhere Triflate-Belastungen aus Seltenerdmetall als die für den Thynastalabbau erforderlichen Belastungen. Für dieses Protokoll können Teoc-Amine verwendet werden, aber die Lewis-Säurekonzentration muss entsprechend angepasst werden, da sich der subquantitative Aminschutz für größere selbstzusammengesetzte Strukturen als problematisch erweisen könnte. Aliphatische funktionelle Gruppen wurden kurz in Betracht gezogen, aber der Deschutz aliphatischer Aldehyde erfordert harte Bedingungen, die Peptoidsequenzenabschneiden 32,33.
Die Einbindung von Neee und Nma als inerte Abstandsrückstände dient der Verbesserung der Oligomerlöslichkeit und ermöglicht eine einfache Massenmarkierung der Vorläufer-Oligomere, um eine fertige Identifizierung der erzeugten Arten durch Massenspektroskopie zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglichen Sequenzen mit abwechselnd englösendynamischen kovalenten und inerten Abstandsrückständen, bei denen benachbarte Backbone-Segmente entgegengesetzte Rotationszustände annehmen, ein lineares, drehfreies Oligomer34,35, Sequenzen mit abwechselnd dynamischen kovalenten und inerten Abstandsrückständen eine Struktur, in der reaktive Pendelgruppen in die gleiche Richtung ausgerichtet sind. Angesichts der Vielseitigkeit der Submonomermethode kann eine große und vielfältige Bibliothek von primären Aminen verwendet werden, um die Peptoidenoligomere weiter zu modifizieren, kann aber Anpassungen des Protokolls erfordern, um eine hohe Kopplungseffizienz zu gewährleisten.
Während Oligo(Peptoide) manuell in einem Glasreaktionsgefäß19synthetisiert werden können, verringert die Automatisierung des Prozesses die Zeit für jede Rückstandszugabe von mehreren Stunden auf eine halbe Stunde. Darüber hinaus verringert die Automatisierung die Menge an Monomer- und Waschlösungsmittelabfällen, besonders wünschenswert bei der Verwendung von primären Aminmonomeren, die nicht kommerziell erhältlich sind. Obwohl Die Alloc-Spaltung aus den geschützten Aminrückständen eine effiziente Reaktion ist, kann die Palladiumoxidation zu einem unvollständigen Deprotection führen. Daher wird vorgeschlagen, einen Teil des Harzes zu testen und das Ausmaß des Deschutzes mit ESI-MS zu charakterisieren. Bei Testspaltungen setzen 30 min unter 405 nm Bestrahlung ausreichend Peptoid für die Massenspektrometrie frei. Teilweiser Deschutz kann durch die Verwendung von anaeroben Bedingungen oder die Wiederholung der Deprotection-Reaktion eingeschränkt werden.
Während sich dieser Artikel auf Sc(OTf)3 als Multi-Rollen-Reagenz konzentriert, haben andere Seltenerdmetalltriflate, wie Ytterbium triflate, nachweislich erfolgreich die informationsgesteuerte Montage molekularer Leitern vermittelt. Bemerkenswert ist, dass Sc(OTf)3 die Lewis-Sauerste der Seltenerdmetalltriflates ist; Aufgrund der reduzierten katalytischen Fähigkeit anderer Seltenerdmetalltriflates24,36können daher größere Äquivalente erforderlich sein, um eine vollständige Ethylen-Acetal-Deprotection- und Strangdissoziation zu bewirken. Die Anzahl der benötigten Äquivalente kann mit der MALDI-Massenspektrometrie ermittelt werden, indem der Punkt beobachtet wird, an dem sich die Stränge vollständig trennen. Die Dissoziation ist im Selbstmontageprozess entscheidend und entspricht dem Schmelzen von Nukleinsäuresträngen bei erhöhter Temperatur. Die anschließende Extraktion des Katalysators ermöglicht die Bildung und Störung dynamischer kovalenter Paarungen, die die Montage sequenzspezifischer Duplexe antreiben. Dieses allmähliche Glühen der oligomeren Stränge umgeht das kinetische Fallen (das bei molekularen Leitern zu nicht registerfreien Arten führen kann oder fälschlicherweise Sequenzen paart), die durch andere Methoden erfahren werden.
Chloroform ist ein ausgezeichnetes Lösungsmittel, da die Phasentrennung im hier verwendeten Chloroform/Acetonitril/Wasserseesystem die partielle Extraktion von Lewis-Säure fördert, ohne dass selbst zusammengesetzte Strukturen ausgefällt werden37. Darüber hinaus ist Chloroform eines der wenigen Lösungsmittel, das die Iminbildung fördert und gleichzeitig die molekulare Leiterlöslichkeit aufrechterhält. Aufgrund der dynamischen Natur des Systems können oft Rückverfolgungsmengen von out-of-Registry und falsch gekoppelten Duplexen beobachtet werden. Obwohl dieses System durch geringe Schwankungen der Triflate-Konzentrationen von Seltenermetallen bei der Extraktion weitgehend unbeeinflusst bleibt, erzeugt eine unzureichende Katalysatorextraktion gelegentlich einen erheblichen Teil der unvollständigen Hybridisierung und unspezifischen Oligomerkupplungen. In diesem Fall ist es in der Regel vorzuziehen, zuerst mit weiteren 1,5 Äquivalenten des Katalysators wieder zu dissoziieren und dann ein zweites Mal zu extrahieren, anstatt sofort wieder zu extrahieren, da die vollständige Dissoziation einzelner Stränge für den Prozess von entscheidender Bedeutung ist. Um mehrere einzigartige informationscodierte molekulare Leitern gleichzeitig zusammenzubauen, kann es notwendig sein, die Konzentration der Seltenerdmetall-Triflate-Lagerlösung zu erhöhen, die zur Aufrechterhaltung von Äquivalenten und gesamtem Reaktionsvolumen verwendet wird.
Während diese Selbstbaugruppen in erster Linie durch Massenspektrometrie gekennzeichnet sind, sind andere Techniken wie Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) möglich. Zu den Einschränkungen gehören die erforderliche Materialmenge, die Erschwinglichkeit von Monomeren und das Signal-Rausch-Verhältnis. Techniken, die Lösungsmittel erfordern, wie z.B. 1 H NMR, können zusätzlich unter der Unlöslichkeit selbst zusammengesetzter Strukturen leiden. Darüber hinaus können Seltenerdmetall-Triflate-Konzentrationen nach der Extraktion mit Methoden wie ICP-MS oder 19F NMR mit einem internen Standard bestimmt werden.
Im Laufe der Fortschritte bei der Verbesserung der Kontrolle über makro- und supramolekulare Nanostrukturen und Materialien stellt sich die Herausforderung, regelmäßige, aber veränderbare Baugruppen zu entwerfen und herzustellen. Das in diesem Bericht beschriebene Protokoll bietet einen Weg, solche Nanostrukturen durch sequenzselektive Baugruppen durch dynamische kovalente Wechselwirkungen zu erreichen.

Der Fortschritt in der Selbstmontage, dem Prozess, durch den kleine Untereinheiten größere Architekturen durch thermodynamisch angetriebene Pfade erzeugen, hat eine verbesserte Kontrolle über makro- und supramolekulare Nanostrukturen ermöglicht, typischerweise durch die Nutzung intermolekularer Wechselwirkungen wie Z-Stacking und Wasserstoffbindung1,2,3,4. Insbesondere Nukleinsäuren (d.h. Polynukleotide) haben sich als bemerkenswert vielseitige Nanokonstruktionsmedien herausgebildet, da die hohe Informationsdichte durch Watson-Crick-Basispaarung die Montage komplexer, sequenzselektiver Strukturenermöglicht 4,5. Während die inhärent geringe Festigkeit dieser transienten intermolekularen Bindungen eine Umlagerung und Fehlerkorrektur der Untereinheit ermöglicht, sind die resultierenden Strukturen oft anfällig für thermischen und mechanischen Abbau6. Im Gegensatz dazu, dynamische kovalente Wechselwirkungen7,8,9, eine Klasse von kovalenten Bindungsbildenden Reaktionen, die reversibel oder reansorierbar unter milden Bedingungen sind und vor kurzem verwendet wurden, um komplizierte Makromoleküle wie Leitern10,11,12,13, Käfige14,15,16und Stapel17, bieten erhöhte Bindungsstärken und robuste Strukturen. Leider wird die Fähigkeit zur Umlagerung und Fehlerkontrolle durch die relativ niedrigen Umlagerungsraten dieser kovalenten Arten verringert, wodurch ihre Fähigkeit zur Selbstmontage in gewünschte Produkte eingeschränkt wird18. Um diesem kinetischen Fallen zu begegnen, werden Katalysatoren oder raue Reaktionsbedingungen oft in Verbindung mit einfachen Bausteinen eingesetzt. Hier berichten wir über einen Prozess, der das kinetische Fangen umgeht, um die Selbstmontage molekularer Leitern von sequenzspezifischen Oligomeren zu ermöglichen, bei denen die Hybridisierung durch die in den Oligomerrückstandssequenzen kodierten Informationen gesteuert wird.
Aufgrund ihrer synthetischen Zugänglichkeit werden Poly(N-substituiertes Glycin)s (d.h. Peptoide) als oligomere Vorläufer eingesetzt, aus denen die molekularen Leitern zusammengesetzt sind19. Peptoide sind strukturelle Isomete von Peptiden, in denen Anhängergruppen auf dem durch das Rückgrat übertragenen Stickstoff angebracht werden, anstatt mit dem Kohlenstoff20gekoppelt zu werden. Mit der Solid-Phasen-Synthese wird eine exakte Platzierung dynamischer kovalenter Pendelgruppen entlang der Peptoidkette problemlos erreicht, was die Konstruktion von Vorläufer-Oligomeren ermöglicht, die sich zu komplexen supramolekularen Strukturen zusammensetzen können21.
Die dynamische kovalente Neuanordnung der Imine-Konnektivität wird in diesem Verfahren eingesetzt, da die imine-erzeugende Kondensationsreaktion ein bequemes Mittel bietet, um die Selbstmontage durch Massenspektrometrie zu charakterisieren, da jede gebildete Bindung zu einer Massenreduktion von 18 g/mol22führt. Darüber hinaus kann das Gleichgewicht zwischen den Amin- und Aldehyd-Reaktanten und dem Iminprodukt durch Veränderung der Säurekonzentration variiert werden. Insbesondere werden Seltenerdmetalltriflate verwendet, um das Gleichgewicht zu beeinflussen und zusätzlich Ethylen-Acetal-geschützte Aldehyde23,24,25zu deprotecten. Zu beachten, dass Scandium triflate bereits häufig im Bereich der dynamischen kovalenten Selbstmontage verwendet wird, einschließlich seines jüngsten Erfolgs bei der Unterstützung der Synthese von kovalenten organischen Gerüsten (COFs) bei Raumtemperatur26,27. Zusätzlich ermöglicht die kontrastierende Löslichkeit der Oligo-(Peptoid-)Sequenzen und des Seltenerdmetalltriflates eine Gleichgewichtskontrolle durch Flüssigkeits-Flüssig-Extraktion. Der gemeldete Prozess nutzt diese Kontrolle, um die kinetischen Barrieren zu umgehen, die eine informationsgesteuerte Selbstmontage verhindern.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dioxane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1114</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>54793</td>
			<td>Matrix substance for MALDI-MS; &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-Aminoethyl)aniline</td>
			<td>Ontario Chemicals</td>
			<td>A2076</td>
			<td>98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Cyanobenzaldehyde</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>049317</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylpiperidine</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0445</td>
			<td>&#8805;98.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Toluenesulfonyl chloride</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>BR1703</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL High Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-240</td>
			<td>Centrifuge Tubes used for automated synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-212</td>
			<td>Glacial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic anhydride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A10</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td>For HPLC; Gradient grade; &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-plastic Norm-Ject syringes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7510-10</td>
			<td>Luer-Slip Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allyl chloroformate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>221741000</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14403</td>
			<td>&#8805;98.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>288306</td>
			<td>Anhydrous; &#8805;99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform-d</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC320690075</td>
			<td>For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlorodimethylsilane</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>1133100</td>
			<td>&#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloroethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E175</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D37-4</td>
			<td>Stabalized; Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>615080010</td>
			<td>Anhydrous; ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylene glycol monoethyl ether</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>E0048</td>
			<td>&#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td>200 Proof; Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E178</td>
			<td>Certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Photolabile SS resin</td>
			<td>CreoSalus</td>
			<td>SA50785</td>
			<td>100-200 mesh; 1% DVB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Peptide Vessel</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-1866-02</td>
			<td>Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-6AD HPLC pumps</td>
			<td>Shimadzu Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 405nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M405L2-C1</td>
			<td>405 nm LED used for photocleavage of peptoid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>Driver for LED light used in photocleavage of peptoid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer</td>
			<td>CEM Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium aluminum hydride</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>199877</td>
			<td>Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna C18 analytical RP-HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4252-E0</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna C18 prepatory RP-HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4253-P0-AX</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80700</td>
			<td>Cemented Needle (N)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Diisopropylcarbodiimide (DIC)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>M02889</td>
			<td>&#8805;99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>319937</td>
			<td>ACS reagent; &#8805;99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A200-212</td>
			<td>Certified ACS Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Cryogenic Gases</td>
			<td></td>
			<td>Contents under pressure, may explode if heated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylsilane</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>S13600</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence SPD-10A UV/vis Detector</td>
			<td>Shimadzu Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Toluenesulfonic acid monohydrate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>402885</td>
			<td>ACS reagent; &#8805;98.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scandium(III) triflate</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>009343</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use Needle</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26420</td>
			<td>18G x 1 1/2&#8243;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>094448</td>
			<td>99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td>Powder; Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>Pellets; Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S421-500</td>
			<td>Anhydrous; Granular; Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28145-497</td>
			<td>PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T397</td>
			<td>Certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>034279</td>
			<td>98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T324</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenylphosphine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>037818</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of information-bearing peptoids and their sequence-directed dynamic covalent self-assembly

Dieses Protokoll stellt die Verwendung von Lewis sauren Multi-Rollen-Reagenzien vor, um kinetisches Fallen zu umgehen, das während der Selbstmontage von informationscodierten oligomeren Strängen beobachtet wird, die durch gepaarte dynamische kovalente Wechselwirkungen vermittelt werden, und das thermische Radfahren nachahmt, das üblicherweise für die Selbstmontage komplementärer Nukleinsäuresequenzen verwendet wird. Primäre Aminmonomere mit Aldehyd und Aminanhänger-Moieties werden mit orthogonalen Schutzgruppen funktionalisiert und als dynamische kovalente Reaktantenpaare verwendet. Mit einem modifizierten automatisierten Peptid-Synthesizer werden die primären Aminmonomere durch Festphasen-Submonomersynthese in Oligo-Stränge (Peptoid) kodiert. Bei der Reinigung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und der Charakterisierung durch Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie (ESI-MS) werden sequenzspezifische Oligomere einer hohen Belastung eines Lewis-sauren Seltenerdmetalltriflats ausgesetzt, das sowohl die Aldehyd-Moieties schützt als auch das Reaktierungspaargleichgewicht so beeinflusst, dass sich die Stränge vollständig dissoziieren. Anschließend wird ein Bruchteil der Lewis-Säure extrahiert, wodurch das Glühen komplementärsequenzspezifischer Stränge zu informationscodierten molekularen Leitern entsteht, die durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisationsmassenspektrometrie (MALDI-MS) gekennzeichnet sind. Das in diesem Bericht beschriebene einfache Verfahren umgeht kinetische Fallen, die häufig auf dem Gebiet der dynamischen kovalenten Montage auftreten, und dient als Plattform für die zukünftige Gestaltung robuster, komplexer Architekturen.

Um die Fähigkeit von informationscodierten Peptoiden zu demonstrieren, sequenzselektive dynamische kovalente Selbstmontage in molekulare Leitern zu durchlaufen, wurde ein repräsentativer Strang, H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma, synthetisiert und mit seiner komplementären Peptoidsequenz hybridisiert. Die Monomere Npam und Npal (gekennzeichnet durch 1H NMR (500 MHz), Abbildung 1) wurden als dynamische kovalente Reaktantenpaare eingesetzt, wobei Neee die Löslichkeit der fertigen selbst zusammengesetzten Produkte unterstützte. Darüber hinaus ermöglicht die Einbeziehung des handelsüblichen Nma-Monomers eine Massendifferenzierung zwischen den beiden komplementären Sequenzen. Nach Abschluss der Solid-Phase-Submonomersynthese wurde die Alloc-Gruppe mit Pd(PPh3)4entfernt. Vor und nach dem Deschutz wurden Teile des Harzes unter 405 nm Licht gespaltet und durch ESI-MS gekennzeichnet (Abbildung 2). Die Sequenz wurde durch Prep HPLC gereinigt, lyophilisiert, um ein nicht-weißes Pulver zu erreichen, und Reinheit mit analytischem HPLC bestätigt (Abbildung 3). Das Oligo(Peptoid) wurde anschließend mit seiner komplementären Sequenz H2N-[Npal-Neee-Nam-Neee]2-Npal hybridisiert, um sich eine von MALDI-MS bestätigte Registerleiter zu leisten (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60442/60442fig1a.jpg"> Abbildung 1: Monomer-Synthetikschemata und 1H-NMR-Spektren. (A) synthetische Monomer-Schemata mit Reagenzien und Bedingungen: i) Allylchloroforat, 10 % wässrige Essigsäure, 1,4-Dioxan, Raumtemperatur, über Nacht; ii) Ethylenglykol, Toluol-p-Sulfonsäure, Toluol, Reflux, über Nacht; iii) LiAlH4, wasserfrei Et2O, 0 °C für 4 h, dann Raumtemperatur für 12 h; iv) Tosylchlorid, THF, 0 °C; (v) NaN3, DMF, 60 °C, 36 h; vi) Triphenylphosphin, THF, über Nacht. (B) Monomer 1H-NMR-Spektren (500 MHz, CDCl3): (i) 4-(2-aminoethyl)-N-(allylcarbonyloxy)phenylam (Npam); ii) 4-(1,3-Dioxacyclopent-2-yl)benzylamin (Npal); iii) 2-(2-ethoxyethoxy)ethylamin (Nee). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60442/60442fig1alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60442/60442fig2.jpg"> Abbildung 2: Synthese und Deprotection eines sequenzspezifischen Oligos(Peptoids). (A) Strukturen von H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma vor und nach der Entfernung von Alloc-Schutzgruppen mit begleitendem (B) ESI-Massenspektrum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60442/60442fig2alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60442/60442fig3a.jpg"> Abbildung 3: Reinigung und Charakterisierung eines informationscodierten Peptoids. (A) HPLC-Chromatogramm der Strangreinigung durch präparative hPLC mit einem linearen Gradienten von Acetonitril (MeCN) und Wasser: (1) 30% MeCN, 0,1-2,1 min; (2) 30-95% MeCN, 2.1-16.1 min; (3) 95% MeCN, 16,1-23,1 Min.; (4) 95% MeCN, 23,1-26,1 min. Peaks i und ii entsprechen niedermolekularen Reaktionsnebenprodukten, in erster Linie DIC-Harnstoff und oligomeren Arten einschließlich des gewünschten Produkts. (B) Analytisches HPLC-Chromatogramm und (C) ESI-Massenspektrum von H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma nach Lyophilisierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60442/60442fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60442/60442fig4.jpg"> Abbildung 4: Selbstmontage von H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma und seiner komplementären Sequenz, H2N-[Npal-Neee-Nam-Neee]2-Npal. (A) Strukturen der beiden Sequenzen und der resultierenden sequenzgesteuerten Baugruppe. (B) MALDI-Massenspektrum der molekularen Leiter nach dem Glühen bei Raumtemperatur über Nacht. Massen: erwartet [M+Na]+ = 3306.7, gefunden 3306.0; erwartet [M-1 imine+Na]+ = 3324.7, gefunden 3323.9; erwartet [M-2 imine +Na]+ = 3342.7, gefunden 3342.8; erwartet [M-2 imine +CH3OH+H]+ = 3352.8, gefunden 3352.0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60442/60442fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly at JoVE.com

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

Ein Protokoll wird für die Synthese von informationscodierten Peptoid-Oligomeren und für die sequenzgesteuerte Selbstmontage dieser Peptoide in molekulare Leitern unter Verwendung von Ainen und Aldehyden als dynamische kovalente Reaktantenpaare und Lewis-saure Seltenerd- Metalltriflate als Mehrzweckreagenzien.

Synthese von informationstragenden Peptoiden und deren sequenzgesteuerter dynamischer kovalenter Selbstmontage

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Dieses Protokoll ermöglicht die informationsgesteuerte Montage oligomerer Sequenzen durch dynamische kovalente Wechselwirkungen, die die sequenzselektive Hybridisierung von Nukleinsäuren wirklich imitieren, aber mit erhöhter Interstrandbindungsfestigkeit. Dynamische kovalente Baugruppen sind aufgrund ihrer begrenzten Kapazität für Bond-Rearrangement und Fehlerkorrektur in der Regel auf einfache Architekturen beschränkt. Im Gegensatz dazu mildert diese Technik durch die Erhöhung entlang der Konzentration einer Lewis-Säure, um die Bindungsdissoziation zu beeinflussen und anschließend die Bindungsumlagerung zu katalysieren, die vorherrschenden kinetischen Fangbeschränkungen der Selbstmontagesysteme.Diese Methode könnte in einer Vielzahl von Bereichen eingesetzt werden, die kovalente Bond-Rearrangement-Reaktionen nutzen, von kovalenten organischen Gerüsten mit außergewöhnlich niedrigen Fehlerraten bis hin zu biomaterialgewebeschnittstellen, die in der Lage sind, sich anzupassen und die weitere Umgestaltung des Gewebesubstrats zu ermöglichen. Bei der ersten Ausführung dieser Technik können Individuen kinetisch gefangene Baugruppen auch nach längeren Glühzeiten finden. Wir raten Erstanwendern, Hybridisierungen zwischen Oligomeren zu versuchen, die ausschließlich Aldehyd und ausschließlich Aminrückstände tragen, wodurch die kodierten Informationen und damit die Hybridisierung vereinfacht werden.Um dieses Verfahren zu beginnen, wiegen Sie 0,125 Gramm FMOC photolabile Feststoffträgerharz und fügen Sie es zu einem gefritted automatisierten Synthesizer Reaktionsgefäß. Setzen Sie das Gefäß in den Mikrowellenteil des Synthesizers ein. Füllen Sie die Hauptlösungsmittelflasche mit DMF und die Deprotection-Flasche mit einer Lösung von 20%4-Methylpiperidin in DMF und entleeren Sie den Abfall.Als nächstes bereiten Sie eine Mollösung von Bromessigsäure und DIC in DMF mit einem Gesamtvolumen von 1,5 Millilitern für jeden Rückstand in der Reihenfolge und 0,47 Milliliter essiges Anhydrid auf 4,53 Milliliter DMF vor, um eine Fünf-Milliliter-Verschließlösung herzustellen. Bereiten Sie 0,5 Molarenlösungen jedes primären Amins vor, das in NMP verwendet werden soll. Das Gesamtvolumen jeder Lösung sollte 2,5 Milliliter für jeden Rückstand des entsprechenden Primäramins plus zusätzliche 2,5 Milliliter betragen.Fügen Sie alle Lösungen zum automatisierten Synthesizer-Verteiler hinzu. Mit einem automatisierten Peptid-Synthesizer, das Harz anschwellen, spalten Sie die FMOC-Gruppe, und führen Sie die Verschiebungsreaktion, wie im Textprotokoll beschrieben. Danach die Wände eines gefranstglasigen Reaktionsgefäßes mit einem Drei-Wege-Stopphahn zu salzen, indem Sie es nach oben mit einer Lösung von 5% Dichlorodimethylsilan in DCE füllen.Lassen Sie es für 30 Minuten sitzen, dann das Gefäß abtropfen lassen und mit DCE und Methanol waschen. Nachdem das Gefäß trocken ist, das Harz auf sie übertragen. Waschen Sie das Harz dreimal mit DCM mit fünf Millilitern für jede Wäsche, während sie mit Stickstoffgas durch einen Arm sprudeln und Vakuum mit einem anderen ziehen.Trocknen und lagern Sie das Harz und das beigefügte Oligopeptoid bis zum Detektion und Dekolleté. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, das Harz erneut anschwellen lassen, wenn es länger als einen Tag gelagert wurde, indem Sie es mit fünf Millilitern DMF für 10 Minuten sprudeln. Entleeren Sie das Gefäß und fügen Sie dem Glaspeptidgefäß einen kleinen magnetischen Rührstab und drei Milliliter trockenes DCM hinzu.Wiegen Sie 0,1 Äquivalente des Palladiumkatalysators und 25 Äquivalente Phenylsilan pro Alloc-Gruppe. Verwenden Sie eine Klemme, um das Reaktionsgefäß in einem Winkel über der Rührplatte so zu positionieren, dass das Harz eine sanfte Rührung durchläuft, während es im Lösungsmittel aufgehängt bleibt, und das Gefäß verkapseln, um eine Verdunstung des DCM zu verhindern. Nach einer Stunde die Lösung abfiltern und das Harz dreimal mit DCM mit fünf Millilitern pro Waschgang waschen.Wiederholen Sie dann noch einmal den Alloc-Deprotection. Als nächstes spülen Sie das Harz zwei Mal sequenziell mit Methanol und DCM ab und übertragen sie in eine 20-Milliliter-Durchstechflasche. Untertauchen Sie das Harz in DMF, rühren und spalten Sie, wie im Textprotokoll beschrieben.Verwenden Sie dann einen Spritzenfilter, um befreites Oligopeptoid vom Harz zu trennen und das Lösungsmittel unter Vakuum zu entfernen. Die Peptoide in einem 50-50-Gemisch aus Wasser und Acetonitril rekonstituieren und mit umgekehrten Phasenpräparativen HPLC reinigen. Kombinieren Sie die gereinigten Fraktionen, dann einfrieren und lyophilisieren sie, um ein off-white Pulver zu ergeben.Analysieren Sie das Pulver mit ESI- und MALDI-Massenspektrometrie. Um die Reinheit zu bewerten, führen Sie analytische HPLC der gereinigten Oligopeptoide durch. Bereiten Sie zunächst 10 Millimolar-Lagerlösungen jeder Oligopeptoidsequenz für die Selbstmontage und eine 10 Millimolar-Stammlösung von Scandiumtriflat in wasserfreiem Acetonitril vor.Fügen Sie 20 Mikroliter jeder Peptoid-Stammlösung zu einer Drei-Milliliter-Durchstechflasche hinzu, die mit einem magnetischen Rührbalken ausgestattet ist. Fügen Sie 1,5 Äquivalente der Scandium-Triflate-Lösung pro potentiellen Aminbindung aus der Stammlösung hinzu und fügen Sie genügend Wasser und Acetonitril hinzu, um 200 Mikroliter einer 2%Wasser- und Acetonitrillösung zu bilden. Bei 70 Grad Celsius zwei Stunden lang vorsichtig umrühren, um das Aldehyd zu deprotektormen Acetyl zu erhalten und alle Stränge zu dissoziieren.Danach die Durchstechflasche mit 200 Mikroliter Chloroform und zwei Milliliter Wasser aufladen. Schütteln Sie die Durchstechflasche vorsichtig. Lassen Sie die Mischung für mindestens 15 Minuten stehen.Nach vollständiger Phasentrennung die organische Schicht mit einer Mikroliterspritze extrahieren. Die organische Schicht in eine neue Durchstechflasche geben und bei 70 Grad Celsius rühren, um oligomer zu glühen, was in der Regel sechs Stunden dauert. Um die Fähigkeit von informationscodierten Peptoiden zu demonstrieren, sequenzselektive dynamische kovalente Selbstmontage in molekulare Leitern zu durchlaufen, wird ein repräsentativer Strang synthetisiert und mit seiner komplementären Peptoidsequenz hybridisiert.Die Monomere NPAM und NPAL werden als dynamische kovalente Reaktantenpaare eingesetzt, wobei NEEE die Löslichkeit der fertigen selbst zusammengesetzten Produkte unterstützt. Nach Abschluss der Solid-Phase-Submonomersynthese wird die Alloc-Gruppe entfernt. Vor und nach dem Deschutz wurden Teile des Harzes unter 405 Nanometer Leichtwasser zerknirscht und durch Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie charakterisiert.Die Sequenz wird durch Prep HPLC gereinigt, dann lyophilisiert, um ein off-white Pulver zu erreichen und die Reinheit wird mit analytischem HPLC bestätigt. Das Oligopeptoid wird anschließend mit seiner komplementären Sequenz hybridisiert, um sich eine von MALDI-MS bestätigte Registerleiter zu leisten. Denken Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens daran, genügend Zeit für die vollständig getrennten Schichten einzuplanen, bis die wässrige Fraktion transparent wird, mindestens 15 Minuten, um eine ausreichende Katalysatorextraktion zu gewährleisten.Nach Abschluss dieses Montageverfahrens sollte eine Massenspektrometrie durchgeführt werden, um das Ausmaß der Hybridisierung zu bestimmen. Zusätzlich kann induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie oder Fluor-NMR verwendet werden, um die Scandiumkonzentration nach der Extraktion zu bewerten. Während diese Technik vor kurzem entwickelt wurde, gehen wir davon aus, dass der in unserer Arbeit beschriebene biomimetische Ansatz entscheidend dazu beitragen wird, die zukünftige Gestaltung und informationsgesteuerte Montage komplexer Nanostrukturen zu lenken.Einige der hier verwendeten Reagenzien sind gefährlich. Bitte seien Sie vorsichtig, wenn Sie mit diesen oder anderen Chemikalien umgehen. Tragen Sie alle persönlichen Schutzausrüstungen und führen Sie alle Experimente in einer Dunstabzugshaube durch.

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Chemistry

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