Name: increasing durability of dissociated neural cell cultures using biologically active coralline matrix
Uploaded: 2020-06-03T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix at JoVE.com

この作業は、イスラエル貿易労働省のKAMINプログラムとQrons Inc.(777 Brickell Avenue Miami、FL 33131、US)によって資金提供されました。

このプロトコルでの動物の使用は、全国動物管理使用委員会によって承認されました。
注:炭酸カルシウムサンゴの骨格は、アラゴナイトの結晶形で使用する必要があります。神経培養のためにこれまでにテストされたサンゴの種類は、 ポリテスルテア、スティロフォラピスティラータ、トラ キフィリアジェフロイです。 スケルトンは全体または地上で購?...

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ここで紹介する手法は、培養中の神経細胞の維持と機能を改善する方法を説明しています。これは、細胞を育成し、その成長と活動を促進するサンゴの骨格粒子で作られたマトリックスに細胞を接着することによって達成されます。この手法を使用すると、脳内の細胞の環境を模倣する神経培養モデルの能力が向上します。
培養基質としてのマトリックスの導入は、古?...

解離した神経細胞(この場合は海馬細胞)の培養は、高い細胞分離とアクセス可能性を提供することにより、神経の成長と機能を研究するための貴重な実験モデルです1,2,3。このタイプの培養は、成長速度と生存率、神経毒性、神経突起の成長とネットワーキング、シナプスの接続性と可塑性、形態学的修飾、神経突起の組織と配線など、収集できる大量の情報のために、神経科学、医薬品開発、および組織工学で頻繁に使用されます1,4,5,6,7。
培養の重要性にもかかわらず、培養細胞は通常、2次元単層のガラスカバーガラス上で成長することを余儀なくされる。ガラスカバーガラスは接着強度の低い非育成基板であり、細胞増殖をサポートする能力が低いため、これらの厳密な環境改変は神経細胞の長期生存能力を著しく低下させます8,9,10,11。
培養された神経細胞は困難な条件で成長することを余儀なくされるため、生存率を高めるための不可欠なアプローチは、可能な限り自然環境を模倣することです12,13。これは、マトリックスとして機能し、細胞の細胞外マトリックスを模倣する生体材料を使用して、細胞が組織のような構造を形成し、栄養を助けることを可能にすることによって達成できます14。
生体材料の使用は、生体適合性の足場として機能し、機械的安定性を提供し、接着、生存、増殖、遊走、形態形成、および分化を含むさまざまな細胞特性を強化するため、細胞培養の改善における有望なアプローチです15,16,17。インビトロで細胞の状態を改善するために、いくつかの種類の生体材料が使用されます。それらの中には、生体高分子、または通常細胞の細胞外マトリックスの一部である生物学的成分がある。これらの生体材料は、主に重合コーティング剤またはヒドロゲル18、19、20の形態として使用される。一方では、上記のマトリックスは、細胞に成長するための使い慣れた3D環境を与え、皿への接着を促進し、それらに機械的支持を与える21、22。他方、それらの重合形態およびヒドロゲル内の細胞の閉じ込めは、増殖培地中に存在する育成成分への細胞のアクセスを妨害し、また顕微鏡的方法による細胞のフォローアップをより困難にする23。
サンゴの外骨格は、生物学的海洋起源のマトリックスです。それらは炭酸カルシウムでできており、機械的安定性があり、生分解性です。培養中の神経細胞を成長させるためのマトリックスとしてサンゴ骨格を使用した以前の研究では、ガラスカバーガラスと比較して、はるかに大きな接着性が示されています24,25。さらに、サンゴの骨格上で増殖した神経細胞は、その骨格が構成されているカルシウムを摂取する能力を示し、栄養欠乏の条件下で神経細胞を保護します26。さらに、サンゴの骨格は、神経細胞の生存率を高め、神経ネットワークの形成を促進し、シナプス結合の速度を高め、組織様構造の形成を可能にする支持的で育成的なマトリックスです27,28。最近の研究では、サンゴ骨格マトリックスの表面トポグラフィーがグリア細胞の分布と活性化に重要な役割を果たしていることも示されています8,29。また、サンゴ骨格は、培養中の骨細胞30、31、肝細胞、心筋細胞などの他の細胞種の培養のためのマトリックスとして有効である(未発表データ)。
したがって、サンゴの骨格は、in vitroで細胞を培養するための有望なマトリックスです。したがって、以下に詳述するプロトコルは、既存の方法で達成されたものよりも安定して繁栄した神経培養を生産するために、サンゴの骨格上で神経細胞を培養する技術について説明しています。このプロトコルは、心筋細胞、肝細胞、および他の細胞型の培養にも有用であり得る。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#60-662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D &#8211; glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Eagle (DMEM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical sieve</td>
			<td>Ari Levy</td>
			<td>#3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serun (FBS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>#04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First Day Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>85.1% Minimum Essential Eagle&#8217;s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#60-690160</td>
			<td>25cm^2, Tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-deoxy-uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>#BNCB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Romical</td>
			<td>#007130-72-19</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HANK&#39;S solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L - glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual strainer (40&#181;m)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#10199-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimun Essential Eagle (MEM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td>De-Groot</td>
			<td>4-P090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO (Sodium Hypochlorite)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#425044</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S8045</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuronal Growth Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>45% MEM, 40% Dulbecco&#39;s modified eagle&#39;s medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#60-628160, #60-627160</td>
			<td>60mm, 35mm, respectively.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly D &#8211; Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart Dentin Grinder</td>
			<td>KometaBio</td>
			<td>#GR101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#15-090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

increasing durability of dissociated neural cell cultures using biologically active coralline matrix

解離した海馬の神経細胞とグリア細胞の培養は、高い細胞分離と制御された環境を提供することにより、神経の成長と機能を研究するための貴重な実験モデルです。しかし、in vitroでの海馬細胞の生存は損なわれます:ほとんどの細胞は培養の最初の週に死にます。したがって、培養中の神経細胞の耐久性を高める方法を特定することは非常に重要です。
サンゴの骨格に由来する結晶性アラゴナイトの形の炭酸カルシウムは、神経培養のための優れた活性マトリックスとして使用することができます。グリア細胞を育て、保護し、活性化することにより、サンゴの骨格は他のマトリックスよりもin vitroでこれらの細胞の生存と成長を促進します。
このプロトコルは、サンゴマトリックス上で海馬細胞を培養する方法を記載しています。このマトリックスは、サンゴの骨格の粒を培養皿、フラスコ、ガラスカバーガラスに取り付けることによって生成されます。粒子は、細胞を微細な3次元(3D)環境に導入して成長し、組織のような構造を形成することにより、細胞の環境を改善するのに役立ちます。サンゴの骨格によってもたらされる3D環境は、粉砕によって細胞のために最適化することができ、グリア細胞の活性に影響を与えることがわかっている特性である粒子のサイズと密度(すなわち、マトリックスの粗さ)の制御を可能にします。さらに、穀物を使用すると、特に光学顕微鏡を使用する場合に、培養物の観察と分析が容易になります。したがって、プロトコルには、in vitroで神経細胞の維持と機能を改善するためのツールとして、サンゴマトリックスの生成と最適化の手順が含まれています。

サンゴ骨格マトリックスを調製するために、サンゴ骨格全体(図1A)をハンマーを使用して0.5〜2 cmの断片に分割し(図1B)、10%次亜塩素酸塩溶液、1M NaOH溶液、および30%H2O2溶液(図1C)を使用して3つのステップ(プロトコルのステップ1)を通じて有機残留物から完全に洗浄しました。サンゴの破片は、骨格の色が茶色(図<...

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Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

解離した海馬細胞培養は、神経科学における極めて重要な実験ツールです。サンゴの骨格をマトリックスとして使用すると、神経保護的および神経調節的役割により、培養における神経細胞の生存と機能が強化されます。したがって、サンゴマトリックス上で増殖した神経細胞はより高い耐久性を示し、それによって培養により適しています。

生物学的に活性なサンゴリンマトリックスを用いた解離神経細胞培養の耐久性向上

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

心筋組織工学のための生物由来注射用材料の作製

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

アクティブな細胞培養のための形状記憶ポリマー

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

アコースティックMicrostreamingを使用して標準的な実験系逆転写反応でmRNAの単セルの物理量からcDNA収量を増加させる

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

細胞培養物衝撃波アプリケーション

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

プライマリのグリア細胞の in Vitro Neuroinflammation のモデリングのための三次元ハイドロゲル文化を改善

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

大きな腱欠損を修復する組織設計されたコラーゲン移植片を用いた新規テノルラフィー縫合技術

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

腎臓皮質細胞外マトリックス由来ハイドロゲルを製造

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

いけにえの中空糸膜細胞培養による細胞外マトリックス繊維の生産

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...