Name: chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)
Uploaded: 2019-12-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af det finske Akademi (tilskud 25013080481 og 25013142041 (I.J.), 286377 og 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), Päivikki og Sakari Sohlberg Foundation (M.P., T.J.), Finnish Medical Foundation (T.P.), den konkurrencedygtige statslige forskning Finansiering af området for ekspert ansvar på Tampere Universitets Hospital (Grant 9V049 og 9X044 (M.P.), 9X011 og 9V010 (T.J.)), den konkurrencedygtige stats forskningsfinansiering af Fimlab Laboratories-laboratoriets ekspert ansvarsområde (Grant X51409 (I.J.)), Tays Støttefond (I.J., M.P., T.J.), Tampere tuberkulose Foundation (I.J., M.P., T.J.), den finske Kulturfond (M.V.), Paulo Foundation (T.P.), Cancer Society of Finland (M.P.) og Emil Aaltonen Foundation (T.P.).

Den her beskrevne protokol er godkendt af Finlands nationale dyreetiske Komité (protokolnummer ESAVI/23659/2018).
1. forsøgsdyr, reagenser og udstyr
<ol><li>Brug mus, som matcher alder og køn. Start studiet på 7 – 9 ugers alderen, fordi huden i de fleste mus er i telogen (hvilefasen) omkring den alder2.</li>
	<li>Observere opførsel af dyrene i løbet af undersøgelsen, og hvis de kæmper, som ofte sker med mænd, hus dem separat. Slagsmål kan forårsage nedsk?...

DMBA-TPA-induceret hudkræft er en af de mest almindeligt anvendte kræft modeller, fordi det er meget reproducerbare og giver oplysninger om tumorprogression fra initiering til malignitet. Den vigtigste resultatmåling, papilloma dannelse, er let og pålideligt kvantitativ. Modellen henvender sig både tumor initiering (tumor-fri overlevelse) og progression (tumor tal og størrelser) samtidig. Modellen er velegnet til at studere forskellige forbindelser, såsom potentiel terapeutisk, og virkningerne af individuelle gene...

Kræft er en af de førende dødsårsager i verden. Derfor er der et krav om at udvikle pålidelige eksperimentelle sygdomsmodeller for at opnå en bedre forståelse af sygdommen samt for at udforske potentielle terapeutiske tilgange. En af de mest almindeligt anvendte eksperimentelle in vivo modeller til at studere hudkræft udvikling er den kemisk induceret to-trins hud carcinogenese model1,2. Modellen giver et værktøj til at studere tumor initiering, forfremmelse, og progression i tillæg til specifikke begivenheder såsom immuncelle infiltration og angiogenese.
At bruge to-trins hud carcinogenese model, bagsiden hud af mus er behandlet med to forskellige kemikalier, der tilsammen fremkalde tumordannelse. Modellen initieres med en lav dosis af mutagen, DMBA, efterfulgt af længerevarende udsættelse for tumor promotoren, TPA3 (figur 1). Dmba muserer DNA tilfældigt ved at danne kovalente addukter med DNA fra Epidermal celler og primære keratinocyt stamceller4,5,6,7. Nogle af disse tilfældige mutationer finder sted i en proto-oncogene, såsom Hras1 (mutationer i Kras og NTM opdages også) og omdannelsen af proto-onkogener til onkogener driver tumordannelse under ordentlige stimuli. TPA, igen, er den mest almindeligt anvendte tumorvækst fremmende middel. Dens molekylære mål er proteinkinase C (PKC)8. TPA aktiverer også WNT/β-køreledningen i signalering, der er afgørende for tumordannelse i model9. Gentagen og langvarig udsættelse for fremme agent fører til øget celle signalering, øget produktion af vækstfaktorer, og en lokal inflammatorisk reaktion, som er indlysende på grund af øget DNA-syntese og inflammatorisk celleinfiltration i den behandlede hud.
De vigtigste inflammatoriske mediatorer i DMBA-TPA-modellen er blevet identificeret10. Interleukin-17a (Il-17a) er kendt for at være særligt tumorigent i dmba-TPA-modellen11,12. Det virker i synergi med interleukin 6 (Il-6) og deltager i makrofag og neutrofilrekruttering13,14. Desuden har CD4+ T- celler og neutrofiler vist sig at være tumorigent i dmba-TPA-modellen. Endelig kan makrofager også fremme tumor i model15,16,17.
Under forfremmelses fasen forstærkes celle spredningen af de muterede celler, og et vedvarende hyperplasi af epidermis vedligeholdes1. Dette fører til papilloma udvikling i huden i 10 – 20 uger, hvorefter papillomer begynder at konvertere til maligne tumorer, plade celle karcinomer (SCCS)2. Men mindre end 10% af papillomer fremskridt til malignitet, selv om denne procentdel også afhænger af den genetiske baggrund af musene2,18. I årtier var det ikke kendt, hvilken type celler blev oprindeligt muteret i tumorer fører til malignitet, selv om nogle undersøgelser havde rapporteret klart forskellige funktioner i de Maligne tumorer i forhold til benign papillomer19,20. Men, nylige undersøgelser har i høj grad øget vores forståelse på den klonale oprindelse af tumordannelse i DMBA-TPA model21. 22. 23. det blev påvist, at både knoglemarv-afledte epiteliale celler og hårsæk stamceller bidrager til tumordannelse22. Stage-specifikke Lineage Tracing undersøgelser har afsløret, at godartede papillomer af monoklonale oprindelse, men de rekruttere nye epiteliale cellepopulationer21,23. Men kun en af celle klonerne fungerer som en drivkraft for carcinogenese; den indeholder en HRAS-mutation23. Progression til karcinom dannelse er forbundet med en klonal feje23.
Det kræftfremkaldende DMBA initierer papilloma dannelse og TPA fremmer tumorvækst. Derfor kan tumor initiering undersøgt separat fra kampagnen ved at afbryde eksperimentet før TPA-behandlingsperioden. Som tumorprogression er undersøgt ugentligt det giver en stor mulighed for detaljeret tumorvækst analyse i hele studiet. Fordi tumorer er genereret af eksterne kemikalier, en onkogen mutation i kimcelle er unødvendig. Således er det ligetil at studere virkningerne af en genetisk baggrund (f. eks. knockout/transgene vs. vildtype) på tumor2. I sum, DMBA/TPA Skin Cancer model er en særlig nyttig tilgang til at studere rollen af immunsystemet i tumorprogression samt til evaluering af tumor initiering og forfremmelse skridt selvstændigt eller indbyrdes afhængige.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60445/60445fig1a.jpg"> Figur 1: DMBA-TPA-induceret hud carcinogenese model skitse. Det kræftfremkaldende dmba påføres topisk for at inducere DNA-mutationer i Initierings fasen af modellen. Den vækstfremmende agent TPA administreres 2x om ugen for at øge celle spredningen under forfremmelses fasen, hvilket fører til udviklingen af papillomer i huden. Dyr ofres, efter at papillomas respons når et plateau, sædvanligvis inden for uger 15-20, afhængigt af muternes genetiske baggrund. En lille del af papillomer kan videreudvikle sig til VKF inden for 20 – 50 uger. For at studere tidlige hændelser i Initierings fasen og den tidlige forfremmelses fase kan der indsamles prøver (f. eks. kort tid efter den anden TPA-applikation). Et repræsentativt fotografi og hematoxylinlegemer og eosin farvede tværsnit af papillomer på en C57BL/6 mus hud efter 19 ugers behandling er vist. Scale bar = 0,1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60445/60445fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1730-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1180-9710-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3254-100MG</td>
			<td>Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000141011</td>
			<td>Evaporates rapidly and is inflammable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane vet 1000 mg/g</td>
			<td>Piramal Critical Care Limited</td>
			<td></td>
			<td>Liquid isoflurane for inhalation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery-Operated Clipper Isis</td>
			<td>Albert Kerlb GmbH</td>
			<td>GT421</td>
			<td>For shaving the fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONTRAfluran-Restgasfilter</td>
			<td>ZeoSys GmbH</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linex Nature N1030 Ruler 30 cm</td>
			<td>Staples Business Advantage</td>
			<td>60383</td>
			<td>For measuring papillomas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN045AR</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mekasoft</td>
			<td>Mekalasi</td>
			<td>23008</td>
			<td>Table cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (Balb/c JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL/6JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>For histology samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-PE160-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance PLJ-C/PLJ-G</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>PLJ 600-3CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN044BX</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>For nucleic acid samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 100-1000 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 20-200 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Anaesthetic Key Filler</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Face Mask for Mouse</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO FM2200 Flowmeter</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Gas Exhaust Unit</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Induction Box</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO200VAP Vaporizer</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)

Kræft er en af de mest ødelæggende sygdomme hos mennesker. Eksperimentelle kræft modeller er vigtige for at få indsigt i det komplekse samspil mellem forskellige celletyper og gener i at fremme tumorprogression og til at give en platform til afprøvning af effekten af forskellige terapeutiske tilgange. En af de mest almindeligt anvendte eksperimentelle inflammatoriske kræft modeller er DMBA-TPA to-trins hud carcinogenese model. Tumor dannelse induceres i denne model af den topikale anvendelse af to forskellige kemikalier, 7, 12-dimethylbenz [a] anthracen (DMBA) og 12-O-tetradecanoyl phorbols-13-acetat (TPA), der tilsammen forårsager papilloma dannelse i huden. Som det primære resultat er papilloma dannelse i huden, modellen er en ideel, pålidelig, og reproducerbare måde at løse både tumor initiering (tumor-fri overlevelse) og tumorprogression (antal og størrelse af synlige tumorer). Virkningerne af DMBA-TPA behandling overføres via en inflammatorisk mekanisme, hvilket gør denne model specielt egnet til at studere rollen af immunsystemet i tumordannelse. Denne model er dog begrænset til huden og andre overflader, hvor kemikalierne kan påføres. Der findes en detaljeret protokol i denne artikel, hvor modellen kan bruges korrekt.

Det vigtigste resultat er overlevelse (dvs., papilloma fri) tid mellem behandling eller genotype grupper. Det sekundære udfald er antallet af papillomer pr. uge i hver gruppe (figur 2). De forventede resultater er en statistisk signifikant forskel i papillomer fritid og i antallet af papillomer mellem de eksperimentelle (to eller flere) grupper. Det anbefales at tælle antallet af papillomer og tegne en kurve i løbet af kampagnen (TPA) fase for at få en idé om forskellene mellem gruppern...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA at JoVE.com

Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA

To-trins hudcarcinogenese induceres af to topisk anvendte kemikalier. En mutagen 7, 12-dimethylbenz [a] anthracen) forårsager mutationer i Epidermal celler og en kontinuerlig anvendelse af generelle vækst stimulator 12-O-tetradecanoyl phorbols-13-acetat accelererer huden papilloma dannelse.

Kemisk induceret Hudcarcinogenese model ved brug af Dimethylbenz [a] anthracen og 12-O-Tetradecanoyl Phorbols-13-acetat (DMBA-TPA)

Cancer is one of the most devastating human diseases. Experimental cancer models are important to gain insight into the complex interplay of different ...

Denne to trin hudkræft model gør det muligt at studere den rolle, betændelse i hudkræft og gør det muligt at studere tumor indledning som en separat proces fra tumor progression. Tumordannelsen i denne model er kemisk induceret og tillader brug af knockout stammer til at studere virkningerne af miljømæssige faktorer eller terapeutiske kandidater. Modellen er velegnet til at studere den rolle, immunsystemet og angiogenese i kræft.Det viser en lignende sygdom patologi til planocellulært karcinom hos humane patienter. Selv om denne metode er relativt let at gennemføre, præcis timing er afgørende. Det er også vigtigt at træffe passende sikkerhedsforanstaltninger ved håndtering af DMBA, som er kræftfremkaldende.Før du begynder forsøget, hus enhver aggressiv syv til ni uger gamle mus i separate bure for at undgå at bekæmpe og hudlæsioner. For hud papilloma induktion, først barbere ryggen skind af de eksperimentelle dyr og vejer musene individuelt. 48 timer efter barbering, bruge en pipette til at anvende 50 mikrogram DMBA i 200 mikroliter acetone på barberet område af hver bedøvet mus.For hud papilloma forfremmelse, syv dage efter DMBA ansøgning behandle huden med fem mikrogram TPA i 200 mikroliter acetone to gange om ugen gennem slutningen af forsøget. Undersøg dyrene for papillomer og fotografi og registrere størrelsen af hver enkelt papilloma på et kort hver uge. En håndgribelig masse større end en millimeter i diameter betragtes som en papilloma, hvis det forbliver længere end en uge.Når tumorresponsen når et plateau, høstes det relevante prøvemateriale fra dyrene 24 timer efter den sidste TPA-applikation og indsamling af fuld tykkelse stykker af huden til immunhisemokisk analyse. Brug en biopsi punch til at indsamle hud stykker fra papilloma og ikke-papilloma hudprøver til genekspression og eller protein anaylses og bruge en skalpel til at indsamle stykker fra papilloma og ikke-papilloma hud til immunohistokemisk analyse. Derefter indsamles huden drænende lymfeknuder og et stykke af milten for flow cytometrisk analyse som ønsket.En statistisk signifikant forskel i papilloma fritid og i antallet af papillomer mellem de eksperimentelle grupper er typisk observeret i DMBA TPA tumor model. Histologiske analyser er egnet til at studere strukturen af papillomer, morfologi af huden, eller infiltration af immunceller af interesse. Det er vigtigt at anvende DMBA og TPA jævnt på huden og anvende TPA i ensartede intervaller.Det er også vigtigt at tælle papillomer regelmæssigt. De mekanismer, der påvirker antallet og tidspunktet for tumordannelse kan studeres ved hjælp af forskellige metoder, herunder immunohistochemistry, flow cytometri, kvantitativ PCR, og protein analyse. Denne konventionelle teknik kan let tilpasses og anvendes til at undersøge virkningerne af forskellige gener, miljømæssige faktorer, eller terapeutiske af interesse på tumor indledning og progression.Forsigtighed er påkrævet, når du udfører teknikken, da DMBA er kræftfremkaldende og acetone fordamper hurtigt. En passende åndedrætsmaske og brug af strømskab anbefales.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET og Mr guidede bestråling af en glioblastom rotte Model ved hjælp af en mikro-irradiator

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

En 3D Organotypic melanom klumpformet hudmodel

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Vigtige endepunkter og proliferative markører til at vurdere små tarmskader og tilpasning ved hjælp af en muse model af kemoterapi-induceret mucositis

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Røntgen følsomhed af kræft stamceller i lungekræft cellelinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studere Triple Negative Breast Cancer Brug Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Brug af kylling chorioallantoic membran i Vivo Model til at studere gynækologiske og urologiske kræftformer

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Brug computer-baseret billedanalyse til at forbedre kvantificeringen af lungemetastase i 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Opdagelsen af metastatiske regulatorer ved hjælp af en hurtig og kvantitativ intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Tre metoder til differentialudtryksanalyse til RNA-sekventering: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...