Name: chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)
Uploaded: 2019-12-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de Academie van Finland (subsidies 25013080481 en 25013142041 (I.J.), 286377 en 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), Päivikki en Sakari Sohlberg Foundation (M.P., T.J.), Finnish Medical Foundation (T.P.), het competitieve State Research Financiering van het gebied van de deskundige verantwoordelijkheid van het universitair ziekenhuis van Tampere (Grant 9V049 en 9X044 (M.P.), 9X011 en 9V010 (T.J.)), de competitieve staats onderzoeksfinanciering van het deskundige verantwoordelijkheidsgebied van Fimlab Laboratories (Grant X51409 (I.J.)), tays Support Foundation (I.J., M.P., T.J.), Tampere Tuberculosefonds (I.J., M.P., T.J.), de Finse culturele stichting (M.V.), de Paulo Foundation (T.P.), kanker Sociëteit van Finland (M.P.), en de Emil Aaltonen Foundation (T.P.).

Het hier beschreven protocol is goedgekeurd door de nationale Commissie voor dierenethiek van Finland (protocolnummer ESAVI/23659/2018).
1. proefdieren, reagentia en apparatuur
<ol><li>Gebruik leeftijd en seks-gematchte muizen. Start de studie met een leeftijd van 7 – 9 weken, omdat de huid in de meeste muizen zich in telogene bevindt (de rustfase) rond die leeftijd2.</li>
	<li>Observeer het gedrag van de dieren tijdens de studie en als ze vechten, wat vaak gebeurt ...

DMBA-TPA-geïnduceerde huidkanker is een van de meest gebruikte kanker modellen omdat het zeer reproduceerbaar is en informatie verschaft over de progressie van de tumor van initiatie tot maligniteit. De belangrijkste uitkomst maatregel, de vorming van papillomavirus, is eenvoudig en betrouwbaar kwantitatief. Het model behandelt beide tumor initiatie (tumor-vrije overleving) en progressie (tumor aantallen en-maten) tegelijkertijd. Het model is geschikt voor het bestuderen van verschillende verbindingen, zoals potentiële...

Kanker is een van de belangrijkste doodsoorzaken in de wereld. Daarom is er een eis om betrouwbare experimentele ziekte modellen te ontwikkelen om een beter begrip van de ziekte te verkrijgen en om mogelijke therapeutische benaderingen te onderzoeken. Een van de meest gebruikte experimentele in vivo modellen om de ontwikkeling van huidkanker te bestuderen is de chemisch geïnduceerde tweetraps huid carcinogenese model1,2. Het model biedt een hulpmiddel om tumor initiatie, promotie en progressie te bestuderen naast specifieke gebeurtenissen zoals immuuncelinfiltratie en angiogenese.
Om het tweetraps huid carcinogenese model te gebruiken, wordt de rughuid van muizen behandeld met twee verschillende chemicaliën die samen tumorvorming induceren. Het model wordt geïnitieerd met een lage dosis van de mutagene stof, DMBA, gevolgd door langdurige blootstelling aan de tumor promotor, TPA3 (Figuur 1). Dmba muteert DNA willekeurig door covalente adducten te vormen met het DNA van epidermale cellen en primaire Keratinocyt stamcellen4,5,6,7. Sommige van deze willekeurige mutaties vinden plaats in een proto-oncogen, zoals Hras1 (mutaties in kras en Nri's worden ook gedetecteerd) en de omzetting van proto-oncogenen naar oncogenen stimuleert de tumorvorming onder de juiste stimuli. TPA, op zijn beurt, is de meest gebruikte tumor groeibevorderende agent. Het moleculaire doelwit is proteïne kinase C (PKC)8. TPA activeert ook WNT/β-bovenbouw in signalering die cruciaal is voor tumorvorming in model9. Herhaalde en langdurige blootstelling aan de bevorderend middel leidt tot verbeterde celsigna lering, verhoogde productie van groeifactoren, en een lokale ontstekingsreactie, die duidelijk zijn als gevolg van verhoogde DNA-synthese en inflammatoire celinfiltratie in de behandelde huid.
De belangrijkste ontstekingsmediatoren in het DMBA-TPA-model zijn geïdentificeerd10. Interleukine-17a (Il-17a) is bekend dat het bijzonder tumorigene in de dmba-TPA model11,12. Het werkt in synergie met Interleukine 6 (Il-6) en participeert in macrofaag en neutrofiele recruitment13,14. Daarnaast is aangetoond dat CD4+ T-cellen en neutrofielen tumorigene zijn in het dmba-TPA-model. Tot slot, macrofagen kunnen ook bevorderen tumorvorming in het model15,16,17.
Tijdens de promotie fase wordt de celproliferatie van de gemuleerde cellen versterkt en wordt een aanhoudende hyperplasie van de epidermis gehandhaafd1. Dit leidt tot de ontwikkeling van papillomavirus in de huid in 10 – 20 weken, waarna de papillomas beginnen te converteren naar kwaadaardige tumoren, plaveiselcel carcinomen (SCCs)2. Echter, minder dan 10% van de papillomas vooruitgang naar maligniteit, hoewel dit percentage ook afhangt van de genetische achtergrond van de muizen2,18. Decennia lang was het niet bekend wat voor soort cellen werden aanvankelijk gemuleerd in de tumoren leidt tot maligniteit, hoewel sommige studies duidelijk onderscheiden kenmerken in de kwaadaardige tumoren had gemeld in vergelijking met goedaardige papillomas19,20. Echter, recente studies hebben sterk toegenomen ons begrip op de klonale oorsprong van tumorvorming in de DMBA-TPA model21. 22. 23. aangetoond is dat zowel epitheliale cellen als haarfollikel stamcellen in het beenmerg bijdragen aan de tumorvorming22. Stage-specifieke Lineage tracing studies hebben onthuld dat goedaardige papillomas van monoklonale oorsprong zijn, maar ze rekruteren nieuwe epitheliale celpopulaties21,23. Echter, slechts één van de cel klonen fungeert als een driver voor carcinogenese; het bevat een Hras-mutatie23. De progressie naar carcinoom vorming wordt geassocieerd met een van klonen sweep23.
De kankerverwekkende stof DMBA initieert de papillomavirus-formatie en TPA bevordert de tumorgroei. Vandaar, de tumor initiatie kan afzonderlijk worden bestudeerd van de promotie door het onderbreken van het experiment voor de TPA behandelingsperiode. Als de tumorprogressie wekelijks wordt bestudeerd biedt het een grote kans voor gedetailleerde tumorgroei analyse gedurende de studie. Omdat de tumoren worden gegenereerd door externe chemicaliën, is een oncogene mutatie in de kiembaan overbodig. Het bestuderen van de effecten van een genetische achtergrond (bijv. Knockout/transgene vs. wild type) op tumorvorming is dus rechtlijnig2. Kortom, de DMBA/TPA huidkanker model is een bijzonder nuttige aanpak voor het bestuderen van de rol van het immuunsysteem in de progressie van de tumor, alsmede voor de evaluatie van de inleiding van de tumor en promotie stappen onafhankelijk of onderling afhankelijk.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60445/60445fig1a.jpg"> Figuur 1: DMBA-TPA-geïnduceerde huid carcinogenese modeloverzicht. De kankerverwekkende stof DMBA wordt topisch toegepast om DNA-mutaties in de initiatie fase van het model te induceren. De groeibevorderende agent TPA wordt 2 x per week toegediend om de celproliferatie tijdens de promotie fase te verbeteren, wat leidt tot de ontwikkeling van papillomas in de huid. Dieren worden geofferd nadat de papillomavirus-reactie een plateau bereikt, meestal binnen weken 15 – 20, afhankelijk van de genetische achtergrond van de muizen. Een klein deel van de papillomas kan binnen 20 – 50 weken verder uitgroeien tot Scc's. Voor het bestuderen van vroege gebeurtenissen in de initiatie-en vroege promotie fase kunnen monsters worden verzameld (bijvoorbeeld kort na de tweede TPA-toepassing). Een representatieve foto en hematoxyline en eosine gekleurd doorsnede van papillomas op een C57BL/6 muis huid na 19 weken behandeling worden getoond. Schaalbalk = 0,1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60445/60445fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1730-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1180-9710-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3254-100MG</td>
			<td>Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000141011</td>
			<td>Evaporates rapidly and is inflammable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane vet 1000 mg/g</td>
			<td>Piramal Critical Care Limited</td>
			<td></td>
			<td>Liquid isoflurane for inhalation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery-Operated Clipper Isis</td>
			<td>Albert Kerlb GmbH</td>
			<td>GT421</td>
			<td>For shaving the fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONTRAfluran-Restgasfilter</td>
			<td>ZeoSys GmbH</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linex Nature N1030 Ruler 30 cm</td>
			<td>Staples Business Advantage</td>
			<td>60383</td>
			<td>For measuring papillomas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN045AR</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mekasoft</td>
			<td>Mekalasi</td>
			<td>23008</td>
			<td>Table cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (Balb/c JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL/6JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>For histology samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-PE160-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance PLJ-C/PLJ-G</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>PLJ 600-3CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN044BX</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>For nucleic acid samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 100-1000 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 20-200 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Anaesthetic Key Filler</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Face Mask for Mouse</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO FM2200 Flowmeter</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Gas Exhaust Unit</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Induction Box</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO200VAP Vaporizer</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)

Kanker is een van de meest verwoestende menselijke ziekten. Experimentele kanker modellen zijn belangrijk om inzicht te krijgen in het complexe samenspel van verschillende celtypen en genen in het bevorderen van tumorprogressie en om een platform te bieden voor het testen van de werkzaamheid van verschillende therapeutische benaderingen. Een van de meest gebruikte experimentele inflammatoire kanker modellen is de DMBA-TPA tweetraps huid carcinogenese model. Tumor vorming wordt in dit model geïnduceerd door de actuele toepassing van twee verschillende chemicaliën, 7, 12-dimethylbenz [a] antraceen (DMBA) en 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetaat (TPA), die samen de papillomavirus vorming in de huid veroorzaken. Omdat het primaire resultaat papillomavirus-vorming in de huid is, is het model een ideale, betrouwbare en reproduceerbaar manier om beide tumor initiatie (tumor vrije overleving) en tumorprogressie (aantal en grootte van zichtbare tumoren) aan te pakken. De effecten van de DMBA-TPA-behandeling worden overgebracht via een ontstekingsmechanisme, waardoor dit model vooral geschikt is om de rol van het immuunsysteem bij tumorvorming te bestuderen. Dit model is echter beperkt tot de huid en andere oppervlakken waar de chemicaliën kunnen worden aangebracht. In dit artikel vindt u een gedetailleerd protocol om het model te kunnen gebruiken.

Het belangrijkste resultaat is de overleving (d.w.z. papillomavirus vrije) tijd tussen de behandelings-of genotype groepen. Het secundaire resultaat is het aantal papillomas per week in elke groep (Figuur 2). De verwachte resultaten zijn een statistisch significant verschil in het papillomavirus vrije tijd en in het aantal papillomen tussen de experimentele (twee of meer) groepen. Het wordt aanbevolen om het aantal papillomas te tellen en een curve te tekenen tijdens de promotie fase (TPA) o...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA at JoVE.com

Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA

Tweetraps huid carcinogenese wordt geïnduceerd door twee topisch toegepaste chemicaliën. Een mutagene stof 7, 12-dimethylbenz [a] anthraceen) veroorzaakt mutaties in de epidermale cellen en een continue toepassing van de algemene groeistimulator 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetaat versnelt de vorming van papillomavirus.

Chemisch-geïnduceerde huid carcinogenese model met behulp van Dimethylbenz [a] anthraceen en 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-acetaat (DMBA-TPA)

Cancer is one of the most devastating human diseases. Experimental cancer models are important to gain insight into the complex interplay of different ...

Dit tweestaps huidkankermodel maakt de studie van de rol van ontsteking bij huidkanker mogelijk en maakt het mogelijk om de tumorinitiatie te bestuderen als een apart proces van tumorprogressie. De tumorvorming in dit model wordt chemisch geïnduceerd en maakt het gebruik van knock-outstammen mogelijk om de effecten van omgevingsfactoren of therapeutische kandidaten te bestuderen. Het model is zeer geschikt voor het bestuderen van de rol van het immuunsysteem en angiogenese bij kanker.Het toont een vergelijkbare ziekte pathologie plaveiselcelcarcinoom bij menselijke patiënten. Hoewel deze methode relatief eenvoudig uit te voeren is, is een nauwkeurige timing essentieel. Het is ook belangrijk om passende veiligheidsmaatregelen te nemen bij de behandeling van DMBA, dat is een kankerverwekkende stof.Voor het begin van het experiment, huis een agressieve zeven tot negen weken oude muizen in aparte kooien om te voorkomen dat vechten en huidletsels. Voor huidpailloma inductie scheer je eerst de rughuiden van de proefdieren en weeg je de muizen individueel. Gebruik 48 uur na het scheren een pipet om 50 microgram DMBA in 200 microliter aceton aan te brengen op het geschoren gebied van elke verdoofde muis.Voor huid papilloma promotie, zeven dagen na DMBA toepassing behandelen de huid met vijf microgram TPA in 200 microliters van aceton twee keer per week tot het einde van het experiment. Bestudeer de dieren op papillomen en fotografeer en fotografeer en notuleer elke week de grootte van elk individueel papilloma op een kaart. Een voelbare massa groter dan een millimeter in diameter wordt beschouwd als een papilloma als het langer dan een week blijft.Wanneer de tumorrespons een plateau bereikt, oogst u 24 uur na de laatste TPA-toepassing het juiste monstermateriaal van de dieren en verzamel u volledige diktestukken van de huid voor immunohistochemische analyse. Gebruik een biopsie punch om huidstukken te verzamelen van papilloma en niet-papilloma huidmonsters voor genexpressie en of eiwitanaylenen en gebruik een scalpel om stukjes papilloma en niet-papilloma huid te verzamelen voor immunohistochemische analyse. Verzamel vervolgens de huid drainerende lymfeklieren en een stuk van de milt voor flow cytometrische analyse zoals gewenst.Een statistisch significant verschil in de papilloma vrije tijd en in het aantal papillomen tussen de experimentele groepen wordt meestal waargenomen in het DMBA TPA tumormodel. Histologische analyses zijn geschikt voor het bestuderen van de structuur van de papillomen, de morfologie van de huid, of de infiltratie van immuuncellen van belang. Het is essentieel om de DMBA en TPA gelijkmatig op de huid toe te passen en TPA in consistente intervallen aan te brengen.Het is ook belangrijk om de papillomen regelmatig te tellen. De mechanismen die het aantal en de tijd van tumorvorming beïnvloeden, kunnen worden bestudeerd met behulp van verschillende methoden, waaronder immunohistochemie, stroomcytometrie, kwantitatieve PCR en eiwitanalyse. Deze conventionele techniek kan gemakkelijk worden aangepast en toegepast om de effecten van verschillende genen, omgevingsfactoren of therapieën van belang te bestuderen op tumorinitiatie en progressie.Voorzichtigheid is geboden bij het uitvoeren van de techniek, omdat DMBA kankerverwekkend is en aceton snel verdampt. Een geschikt ademhalingsmasker en het gebruik van de stroomkast worden aanbevolen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET en MRI geleide bestraling van een Glioblastoma Rat-Model met behulp van een Micro-irradiator

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Een 3D Organotypic melanoom sferoïde huidmodel

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Belangrijke eindpunten en proliferatieve markers om kleine darm letsel en aanpassing te beoordelen met behulp van een muis model van chemotherapie-geïnduceerde Mucositis

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radio sensitiviteit van kanker stamcellen in longkanker cellijnen

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Met behulp van de Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model om gynaecologische en urologische kankers studie

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Computergebaseerde beeldanalyse gebruiken om de kwantificering van longmetastase in het 4T1 Breast Cancer Model te verbeteren

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Ontdekking van gemetastaseerde regulatoren met behulp van een snel en kwantitatief intravital chick chorioallantoic membraanmodel

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Drie differentiële expressieanalysemethoden voor RNA-sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...