Name: chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)
Uploaded: 2019-12-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA at JoVE.com

Ces travaux ont été financés par l'Académie de Finlande (subventions 25013080481 et 25013142041 (I.J.), 286377 et 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), fondation Deivikki et Sakari Sohlberg (M.P., T.J.), Finnish Medical Foundation (T.P.), The Competitive State Research Financement de la zone de responsabilité d'expert de l'hôpital universitaire de Tampere (subvention 9V049 et 9X044 (M.P.), 9X011 et 9V010 (T.J.)), Le financement de la recherche d'État concurrentiel de la zone de responsabilité experte des laboratoires Fimlab (subvention X51409 (I.J.)), Tays Fondation de soutien (I.J., M.P., T.J.), Tampere Tuberculosis Foundation (I.J., M.P., T.J.), la Finnish Cultural Foundation (M.V.), la Paulo Foundation (T.P.), Cancer Society of Finland (M.P.) et la Fondation Emil Aaltonen (T.P.).

Le protocole décrit ici a été approuvé par le Comité national d'éthique animale de Finlande (numéro de protocole ESAVI/23659/2018).
1. Animaux expérimentaux, réactifs et équipements
<ol><li>Utilisez des souris assorties à l'âge et au sexe. Commencez l'étude à l'âge de 7 à 9 semaines, parce que la peau de la plupart des souris est en telogen (la phase de repos) vers cet âge2.</li>
	<li>Observez le comportement des animaux pendant l'étude et s'ils se b...

Le cancer de la peau d'Origine DMBA-TPA est l'un des modèles de cancer les plus couramment utilisés parce qu'il est hautement reproductible et fournit des informations sur la progression tumorale de l'initiation à la malignité. La principale mesure des résultats, la formation du papillome, est facilement et de manière fiable quantitative. Le modèle traite à la fois de l'initiation tumorale (survie sans tumeur) et de la progression (nombres et tailles tumoraux) simultanément. Le modèle est adapté pour l'étude ...

Le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde. Par conséquent, il y a une demande pour développer des modèles expérimentaux fiables de maladie pour obtenir une meilleure compréhension de la maladie aussi bien que pour explorer des approches thérapeutiques potentielles. L'un des modèles expérimentaux in vivo les plus couramment utilisés pour étudier le développement du cancer de la peau est le modèle de carcinogenèse de la peau à deux étapes induit chimiquement à deux étapes1,2. Le modèle fournit un outil pour étudier l'initiation, la promotion et la progression de tumeur en plus des événements spécifiques tels que l'infiltration de cellules immunitaires et l'angiogenèse.
Pour employer le modèle de carcinogenèse de peau de deux étapes, la peau arrière des souris est traitée avec deux produits chimiques différents qui induisonnt ensemble la formation de tumeur. Le modèle est initié avec une faible dose de la mutagène, DMBA, suivie d'une exposition prolongée au promoteur de la tumeur, TPA3 (Figure 1). DMBA mute l'ADN au hasard en formant des adducts covalents avec l'ADN des cellules épidermiques et des cellules souches de kératinocyte primaire4,5,6,7. Certaines de ces mutations aléatoires ont lieu dans un proto-oncogène, comme Hras1 (mutations dans Kras et Nras sont également détectées) et la conversion de proto-oncogènes en oncogènes conduit la formation tumorale sous des stimuli appropriés. TPA, à son tour, est l'agent de croissance de croissance de tumeur le plus couramment utilisé. Sa cible moléculaire est la protéine kinase C (PKC)8. TPA active également la signalisation Wnt/ -caténine qui est cruciale pour la formation de tumeur dans le modèle9. L'exposition répétée et prolongée à l'agent de promotion mène à la signalisation accrue de cellules, à la production accrue des facteurs de croissance, et à une réaction inflammatoire locale, qui sont évidentes dues à la synthèse accrue d'ADN et à l'infiltration inflammatoire de cellules dans la peau traitée.
Les principaux médiateurs inflammatoires du modèle DMBA-TPA ont été identifiés10. Interleukin-17A (IL-17A) est connu pour être particulièrement tumorigène dans le modèle DMBA-TPA11,12. Il travaille en synergie avec l'interleukine 6 (IL-6) et participe au recrutement de macrophage et de neutrophile13,14. En outre, les cellules CD4et T et les neutrophiles se sont avérés tumorigènes dans le modèle DMBA-TPA. Enfin, les macrophages peuvent également promouvoir la tumorigénèse dans le modèle15,16,17.
Pendant la phase de promotion, la prolifération cellulaire des cellules mutées est améliorée et une hyperplasie soutenue de l'épiderme est maintenue1. Cela conduit au développement du papillome dans la peau en 10-20 semaines, après quoi les papillomes commencent à se convertir en tumeurs malignes, carcinomes épidermoïdes (SCC)2. Cependant, moins de 10% des papillomes progressent vers la malignité, bien que ce pourcentage dépende également du fond génétique des souris2,18. Pendant des décennies, on ne savait pas quel type de cellules ont été initialement mutés dans les tumeurs conduisant à la malignité, même si certaines études avaient rapporté des caractéristiques clairement distinctes dans les tumeurs malignes par rapport aux papillomes bénins19,20. Cependant, des études récentes ont considérablement augmenté notre compréhension sur l'origine clonale de la formation de tumeur dans le modèle21de DMBA-TPA. 22. 23. Il a été démontré que les deux cellules épithéliales dérivées de moelle osseuse et les cellules souches pileux follicules contribuent à la formation de tumeur22. Des études de traçage de lignée scénographie spécifiques à la scène ont révélé que les papillomes bénins sont d'origine monoclonal, mais ils recrutent de nouvelles populations épithéliales21,23. Cependant, un seul des clones cellulaires fonctionne comme un moteur de la carcinogenèse; il contient une mutation hras23. La progression vers la formation de carcinome est associée à un balayage clonal23.
Le DMBA cancérogène initie la formation de papillome et TPA favorise la croissance tumorale. Par conséquent, l'initiation de tumeur peut être étudiée séparément de la promotion en interrompant l'expérience avant la période de traitement de TPA. Comme la progression de tumeur est étudiée hebdomadairement elle offre une grande occasion pour l'analyse détaillée de croissance de tumeur tout au long de l'étude. Puisque les tumeurs sont produites par des produits chimiques externes, une mutation oncogène dans la lignée germinale est inutile. Ainsi, l'étude des effets d'un fond génétique (par exemple, knock-out/transgène contre type sauvage) sur la tumorigénèse est simple2. En somme, le modèle de cancer de la peau DMBA/TPA est une approche particulièrement utile pour étudier le rôle du système immunitaire dans la progression tumorale ainsi que pour l'évaluation des étapes d'initiation et de promotion de tumeur indépendamment ou interdépendante.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60445/60445fig1a.jpg"> Figure 1 : Contour du modèle de carcinogenèse de la peau induit par DMBA-TPA. Le DMBA cancérogène est appliqué topiquement pour induire des mutations d'ADN dans la phase d'initiation du modèle. L'agent de promotion de la croissance TPA est administré 2x par semaine pour améliorer la prolifération cellulaire pendant la phase de promotion, conduisant au développement de papillomes dans la peau. Les animaux sont sacrifiés après que la réponse du papillome a atteint un plateau, généralement dans les semaines 15-20, selon le fond génétique des souris. Une petite proportion des papillomes peut se développer davantage en SCC dans un délai de 20 à 50 semaines. Pour étudier les premiers événements de la phase d'initiation et de promotion précoce, des échantillons peuvent être prélevés (p. ex., peu de temps après la deuxième demande d'APT). Une photographie représentative et l'hématoxylin et l'éosine souillées section transversale des papillomes sur une peau de souris C57BL/6 après 19 semaines de traitement sont montrées. Barre d'échelle de 0,1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60445/60445fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1730-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1180-9710-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3254-100MG</td>
			<td>Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000141011</td>
			<td>Evaporates rapidly and is inflammable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane vet 1000 mg/g</td>
			<td>Piramal Critical Care Limited</td>
			<td></td>
			<td>Liquid isoflurane for inhalation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery-Operated Clipper Isis</td>
			<td>Albert Kerlb GmbH</td>
			<td>GT421</td>
			<td>For shaving the fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONTRAfluran-Restgasfilter</td>
			<td>ZeoSys GmbH</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linex Nature N1030 Ruler 30 cm</td>
			<td>Staples Business Advantage</td>
			<td>60383</td>
			<td>For measuring papillomas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN045AR</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mekasoft</td>
			<td>Mekalasi</td>
			<td>23008</td>
			<td>Table cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (Balb/c JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL/6JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>For histology samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-PE160-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance PLJ-C/PLJ-G</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>PLJ 600-3CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN044BX</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>For nucleic acid samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 100-1000 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 20-200 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Anaesthetic Key Filler</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Face Mask for Mouse</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO FM2200 Flowmeter</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Gas Exhaust Unit</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Induction Box</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO200VAP Vaporizer</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)

Le cancer est l'une des maladies humaines les plus dévastatrices. Les modèles expérimentaux de cancer sont importants pour obtenir la perspicacité dans l'interaction complexe de différents types et gènes de cellules en favorisant la progression de tumeur et pour fournir une plate-forme pour tester l'efficacité de différentes approches thérapeutiques. L'un des modèles expérimentaux de cancer inflammatoire le plus couramment utilisé est le modèle de cancérogène de la peau à deux étapes DMBA-TPA. La formation de tumeur est induite dans ce modèle par l'application topique de deux produits chimiques différents, 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) et 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA), qui causent ensemble la formation de papillome dans la peau. Comme le résultat primaire est la formation de papillome dans la peau, le modèle est un moyen idéal, fiable, et reproductible pour adresser l'initiation de tumeur (survie tumeur-libre) et la progression de tumeur (nombre et taille des tumeurs visibles). Les effets du traitement DMBA-TPA sont transmis par un mécanisme inflammatoire, ce qui rend ce modèle particulièrement approprié pour étudier le rôle du système immunitaire dans la formation tumorale. Cependant, ce modèle est limité à la peau et à d'autres surfaces où les produits chimiques peuvent être appliqués. Un protocole détaillé est fourni dans cet article pour utiliser le modèle avec succès.

Le principal résultat est le temps de survie (c.-à-d. sans papillome) entre le traitement ou les groupes de génotype. Le résultat secondaire est le nombre de papillomes par semaine dans chaque groupe (figure 2). Les résultats attendus sont une différence statistiquement significative dans le temps libre du papillome et dans le nombre de papillomes entre les groupes expérimentaux (deux ou plus). Il est recommandé de compter le nombre de papillomes et de tracer une courbe pendant la ph...

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Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA

La carcinogenèse de peau à deux étapes est induite par deux produits chimiques topiques appliqués. Un mutagène 7,12-dimethylbenz[a]anthracene) provoque des mutations dans les cellules épidermiques et une application continue du stimulateur de croissance générale 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate accélère la formation de papillome cutané.

Modèle de carcinogenèse de la peau induitparé par des produits chimiques à l'aide de Dimethylbenz[a]Anthracene et 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

Cancer is one of the most devastating human diseases. Experimental cancer models are important to gain insight into the complex interplay of different ...

Ce modèle de cancer de la peau en deux étapes permet l’étude du rôle de l’inflammation dans le cancer de la peau et permet à l’étude l’initiation tumorale comme un processus distinct de la progression tumorale. La formation tumorale dans ce modèle est induite chimiquement et permet l’utilisation de souches knockout pour étudier les effets des facteurs environnementaux ou des candidats thérapeutiques. Le modèle est bien adapté pour étudier le rôle du système immunitaire et de l’angiogenèse dans le cancer.Il démontre une pathologie semblable de maladie au carcinome squamous de cellules dans les patients humains. Bien que cette méthode soit relativement facile à conduire, un calendrier précis est essentiel. Il est également important de prendre les mesures de sécurité appropriées lors de la manipulation du DMBA, qui est cancérigène.Avant de commencer l’expérience, abritez des souris agressives âgées de sept à neuf semaines dans des cages séparées pour éviter les combats et les lésions cutanées. Pour l’induction du papillome cutané, rasez d’abord la peau arrière des animaux expérimentaux et pesez les souris individuellement. 48 heures après le rasage, utiliser une pipette pour appliquer 50 microgrammes de DMBA dans 200 microlitres d’acétone sur la zone rasée de chaque souris anesthésiée.Pour la promotion du papillome cutané, sept jours après l’application du DMBA traiter la peau avec cinq microgrammes de TPA dans 200 microlitres d’acétone deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Examinez les animaux à la recherche de papillomes et photographiez et enregistrez la taille de chaque papillome individuel sur une carte chaque semaine. Une masse palpable supérieure à un millimètre de diamètre est considérée comme un papillome s’il reste plus d’une semaine.Quand la réponse de tumeur atteint un plateau, récoltez le matériel approprié d’échantillon des animaux 24 heures après la dernière application de TPA et collectez des morceaux pleins d’épaisseur de peau pour l’analyse immunohistochemical. Utilisez un poinçon de biopsie pour recueillir des morceaux de peau à partir d’échantillons de papillome et de peau non papilloma pour l’expression des gènes et ou des anaylses protéiques et utilisez un scalpel pour recueillir des morceaux de papillome et de peau non papilloma pour l’analyse immunohistochimique. Puis recueillir la peau drainant les ganglions lymphatiques et un morceau de la rate pour l’analyse cytométrique de flux que vous le souhaitez.Une différence statistiquement significative dans le temps libre de papillome et dans le nombre de papillomes entre les groupes expérimentaux est typiquement observée dans le modèle de tumeur de TPA de DMBA. Les analyses histologiques conviennent à l’étude de la structure des papillomes, de la morphologie de la peau ou de l’infiltration de cellules immunitaires d’intérêt. Il est essentiel d’appliquer uniformément le DMBA et le TPA sur la peau et d’appliquer le TPA à intervalles réguliers.Il est également important de compter les papillomes régulièrement. Les mécanismes qui affectent le nombre et l’heure de la formation de tumeur peuvent être étudiés utilisant différentes méthodes, y compris l’immunohistochimie, la cytométrie de flux, le PCR quantitatif, et l’analyse de protéine. Cette technique conventionnelle peut être facilement adaptée et appliquée pour étudier les effets de différents gènes, facteurs environnementaux, ou thérapeutiques d’intérêt sur l’initiation et la progression tumorales.La prudence est de mise lors de l’exécution de la technique puisque le DMBA est cancérigène et que l’acétone s’évapore rapidement. Un masque respiratoire approprié et l’utilisation de l’armoire d’écoulement sont recommandés.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Recherche

Recherche en cancérologie

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