Name: chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)
Uploaded: 2019-12-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dall'Accademia di Finlandia (concede 25013080481 e 25013142041 (I.J.), 286377 e 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), P'ivikki e Sakari Sohlberg Foundation (M.P.), T.J.), Finnish Medical Foundation (T.P.), The Competitive State Research (Fondazione Medica Finlandese) (T.P.), The Competitive State Research (Fondazione Medica Finlandese) Finanziamento dell'Expert Responsibility Area of Tampere University Hospital (grant 9V049 e 9X044 (M.P.), 9X011 e 9V010 (T.J.), The Competitive State Research Financing of the Expert Responsibility Area of Fimlab Laboratories (Grant X51409 (I.J.)), Tays Fondazione di sostegno (I.J., M.P., T.J.), Tampere Tuberculosis Foundation (I.J., M.P., T.J.), la Fondazione Culturale Finlandese (M.V.), la Fondazione Paulo (T.P.), la Cancer Society of Finland (M.P.) e la Fondazione Emil Aalton (T.P.).

Il protocollo qui descritto è stato approvato dal Comitato Nazionale Per l'Etica animale della Finlandia (numero di protocollo ESAVI/23659/2018).
1. Animali sperimentali, reagenti e attrezzature
<ol><li>Usa l'età e i topi abbinati al sesso. Iniziare lo studio a 7-9 settimane di età, perché la pelle nella maggior parte dei topi è in telogen (la fase di riposo) intorno a quell'età2.</li>
	<li>Osservare il comportamento degli animali durante lo studio e se combatto...

Il cancro della pelle indotta da DMBA-TPA è uno dei modelli tumorali più comunemente usati perché è altamente riproducibile e fornisce informazioni sulla progressione del tumore dall'inizio alla malignità. La misura dei risultati chiave, la formazione del papilloma, è facilmente e in modo affidabile quantitativo. Il modello affronta sia l'inizio tumorale (sopravvivenza senza tumore) che la progressione (numeri e dimensioni del tumore) contemporaneamente. Il modello è adatto per studiare diversi composti, come pote...

Il cancro è una delle principali cause di morte nel mondo. Pertanto, vi è la richiesta di sviluppare modelli di malattia sperimentale affidabili per ottenere una migliore comprensione della malattia e per esplorare potenziali approcci terapeutici. Uno dei modelli sperimentali in vivo più comunemente utilizzati per studiare lo sviluppo del cancro della pelle è il modello di carcinogenesi cutanea a due stadi indotto chimicamente1,2. Il modello fornisce uno strumento per studiare l'inizio del tumore, la promozione e la progressione, oltre a eventi specifici come l'infiltrazione delle cellule immunitarie e l'angiogenesi.
Per utilizzare il modello di carcinogenesi cutanea a due stadi, la pelle posteriore dei topi viene trattata con due diverse sostanze chimiche che insieme inducono la formazione del tumore. Il modello viene avviato con una dose bassa del mutageno, DMBA, seguita da un'esposizione prolungata al promotore del tumore, TPA3 (Figura 1). DMBA muta il DNA in modo casuale formando addotti covalenti con il DNA delle cellule epidermiche e delle cellule staminali primarie cheratinociti4,5,6,7. Alcune di queste mutazioni casuali avvengono in un proto-oncogene, come Hras1 (vengono rilevate anche mutazioni in Kras e Nras) e la conversione dei proto-oncogeni in oncogeni guida la formazione del tumore sotto stimoli adeguati. TPA, a sua volta, è l'agente di promozione della crescita del tumore più comunemente usato. Il suo obiettivo molecolare è la chinasi proteica C (PKC)8. TPA attiva anche la segnalazione Wnt/z-catenin che è cruciale per la formazione del tumore nel modello9. L'esposizione ripetuta e prolungata all'agente promotore porta a una migliore segnalazione cellulare, a una maggiore produzione di fattori di crescita e a una reazione infiammatoria locale, che sono evidenti a causa di una maggiore sintesi del DNA e infiltrazione infiammatoria delle cellule nella pelle trattata.
I principali mediatori infiammatori nel modello DMBA-TPA sono stati identificati10. L'interleucina-17A (IL-17A) è noto per essere particolarmente cancerogeno nel modello DMBA-TPA11,12. Lavora in sinergia con l'interleuchino 6 (IL-6) e partecipa al reclutamento di macrofagi e neutrofi13,14. Inoltre, CD4- cellule T e neutrofili hanno dimostrato di essere cancerogeni nel modello DMBA-TPA. Infine, i macrofagi possono anche promuovere la tumorigenesi nel modello15,16,17.
Durante la fase di promozione, la proliferazione cellulare delle cellule mutate è migliorata e un'iperplasia sostenuta dell'epidermide viene mantenuta1. Questo porta allo sviluppo del papilloma nella pelle in 10-20 settimane, dopo di che i papillomi iniziano a convertirsi in tumori maligni, carcinomi a cellule squamose (SCC)2. Tuttavia, meno del 10% dei papillomi progredisce verso la malignità, anche se questa percentuale dipende anche dal background genetico dei topi2,18. Per decenni non si sapeva quale tipo di cellule fossero inizialmente mutate nei tumori che portavano alla malignità, anche se alcuni studi avevano riportato caratteristiche chiaramente distinte nei tumori maligni rispetto ai papillomi benigni19,20. Tuttavia, studi recenti hanno notevolmente aumentato la nostra comprensione sull'origine clonale della formazione del tumore nel modello DMBA-TPA21. 22. 23.È stato dimostrato che sia le cellule epiteliali derivate dal midollo osseo che le cellule staminali del follicolo pilifero contribuiscono alla formazione del tumore22. Studi di tracciamento del lignaggio specifico dello stadio hanno svelato che i papillomi benigni sono di origine monoclonale, ma reclutano nuove popolazioni di cellule epiteliali21,23. Tuttavia, solo uno dei cloni cellulari funziona come conducente della carcinogenesi; contiene una mutazione Hras23. La progressione verso la formazione di carcinoma è associata a uno sweep clonale23.
Il DMBA cancerogeno avvia la formazione del papilloma e il TPA promuove la crescita del tumore. Quindi, l'inizio del tumore può essere studiato separatamente dalla promozione interrompendo l'esperimento prima del periodo di trattamento TPA. Come la progressione del tumore è studiato settimanalmente offre una grande opportunità per l'analisi dettagliata della crescita del tumore in tutto lo studio. Poiché i tumori sono generati da sostanze chimiche esterne, una mutazione oncogenica nella linea germinale non è necessaria. Così, lo studio degli effetti di un background genetico (ad esempio, knockout/transgene vs tipo selvaggio) sulla tumorigenesi è semplice2. In sintesi, il modello di cancro della pelle DMBA/TPA è un approccio particolarmente utile per studiare il ruolo del sistema immunitario nella progressione tumorale, nonché per la valutazione delle fasi di avvio e promozione del tumore in modo indipendente o interdipendente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60445/60445fig1a.jpg"> Figura 1: contorno del modello di carcinogenesi cutanea indotta da DMBA-TPA. La DMBA cancerogena è applicata topicamente per indurre mutazioni del DNA nella fase di avvio del modello. L'agente di promozione della crescita TPA viene somministrato 2volte a settimana per migliorare la proliferazione cellulare durante la fase di promozione, portando allo sviluppo di papillomi nella pelle. Gli animali vengono sacrificati dopo che la risposta al papilloma raggiunge un altopiano, di solito entro settimane 15-20, a seconda del background genetico dei topi. Una piccola parte dei papillomi può svilupparsi ulteriormente in CCN entro 20-50 settimane. Per studiare i primi eventi nella fase di avvio e promozione precoce, è possibile raccogliere campioni (ad esempio, poco dopo la seconda applicazione TPA). Una fotografia rappresentativa e ematossilina e eosina macchiato sezione trasversale di papillomi su una pelle di topo C57BL/6 dopo 19 settimane di trattamento sono mostrati. Barra di scala - 0,1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60445/60445fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1730-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1180-9710-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3254-100MG</td>
			<td>Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000141011</td>
			<td>Evaporates rapidly and is inflammable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane vet 1000 mg/g</td>
			<td>Piramal Critical Care Limited</td>
			<td></td>
			<td>Liquid isoflurane for inhalation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery-Operated Clipper Isis</td>
			<td>Albert Kerlb GmbH</td>
			<td>GT421</td>
			<td>For shaving the fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONTRAfluran-Restgasfilter</td>
			<td>ZeoSys GmbH</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linex Nature N1030 Ruler 30 cm</td>
			<td>Staples Business Advantage</td>
			<td>60383</td>
			<td>For measuring papillomas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN045AR</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mekasoft</td>
			<td>Mekalasi</td>
			<td>23008</td>
			<td>Table cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (Balb/c JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL/6JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>For histology samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-PE160-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance PLJ-C/PLJ-G</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>PLJ 600-3CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN044BX</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>For nucleic acid samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 100-1000 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 20-200 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Anaesthetic Key Filler</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Face Mask for Mouse</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO FM2200 Flowmeter</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Gas Exhaust Unit</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Induction Box</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO200VAP Vaporizer</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)

Il cancro è una delle malattie umane più devastanti. I modelli sperimentali di cancro sono importanti per ottenere informazioni sulla complessa interazione di diversi tipi di cellule e geni nella promozione della progressione tumorale e per fornire una piattaforma per testare l'efficacia di diversi approcci terapeutici. Uno dei modelli di carcinogenesi infiammatoria sperimentale più comunemente utilizzati è il modello di carcinogenesi cutanea a due stadi DMBA-TPA. La formazione del tumore è indotta in questo modello dall'applicazione topica di due diverse sostanze chimiche, 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) e 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetato (TPA), che insieme causano formazione di papilloma nella pelle. Poiché il risultato principale è la formazione di papilloma nella pelle, il modello è un modo ideale, affidabile e riproducibile per affrontare sia l'inizio del tumore (sopravvivenza senza tumore) che la progressione del tumore (numero e dimensione dei tumori visibili). Gli effetti del trattamento DMBA-TPA sono trasmessi attraverso un meccanismo infiammatorio, che rende questo modello particolarmente adatto per studiare il ruolo del sistema immunitario nella formazione del tumore. Tuttavia, questo modello è limitato alla pelle e ad altre superfici su cui possono essere applicate le sostanze chimiche. In questo articolo viene fornito un protocollo dettagliato per utilizzare correttamente il modello.

Il risultato principale è il tempo di sopravvivenza (cioè senza papilloma) tra i gruppi di trattamento o genotipi. Il risultato secondario è il numero di papillomi a settimana in ogni gruppo (Figura 2). I risultati attesi sono una differenza statisticamente significativa nel tempo libero del papilloma e nel numero di papillomi tra i gruppi sperimentali (due o più). Si raccomanda di contare il numero di papillomi e disegnare una curva durante la fase di promozione (TPA) per avere un'idea ...

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Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA

La carcinogenesi cutanea a due stadi è indotta da due sostanze chimiche applicate topicamente. Un mutagen 7,12-dimethylbenz[a]anthracene) provoca mutazioni nelle cellule epidermiche e una continua applicazione dello stimolatore di crescita generale 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetato accelera la formazione di papilloma cutaneo.

Modello di carcinogenesi cutanea indotta dalla sostanza chimica utilizzando Dimethylbenz[a]Anthracene e 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

Cancer is one of the most devastating human diseases. Experimental cancer models are important to gain insight into the complex interplay of different ...

Questo modello di cancro della pelle in due fasi consente lo studio del ruolo dell'infiammazione nel cancro della pelle e consente allo studio l'iniziazione del tumore come processo separato dalla progressione tumorale. La formazione tumorale in questo modello è indotta chimicamente e consente l'uso di ceppi knockout per studiare gli effetti di fattori ambientali o candidati terapeutici. Il modello è adatto per studiare il ruolo del sistema immunitario e l'angiogenesi nel cancro.Dimostra una patologia della malattia simile al carcinoma a cellule squamose nei pazienti umani. Sebbene questo metodo sia relativamente facile da condurre, è essenziale un tempismo accurato. È anche importante adottare misure di sicurezza appropriate durante la manipolazione del DMBA, che è cancerogeno.Prima di iniziare l'esperimento, ospita eventuali topi aggressivi di sette o nove settimane in gabbie separate per evitare combattimenti e lesioni cutanee. Per l'induzione del papilloma cutaneo, prima radere le pelli della schiena degli animali da esperimento e pesare i topi individualmente. 48 ore dopo la rasatura, utilizzare una pipetta per applicare 50 microgrammi di DMBA in 200 microlitri di acetone sull'area rasata di ogni topo anestetizzato.Per la promozione del papilloma cutaneo, sette giorni dopo l'applicazione DMBA trattare la pelle con cinque microgrammi di TPA in 200 microlitri di acetone due volte a settimana fino alla fine dell'esperimento. Esamina gli animali per papillomi e fotografa e registra le dimensioni di ogni singolo papilloma su una mappa ogni settimana. Una massa palpabile di diametro superiore a un millimetro è considerata un papilloma se rimane più lunga di una settimana.Quando la risposta tumorale raggiunge un plateau, raccogliere il materiale campione appropriato dagli animali 24 ore dopo l'ultima applicazione TPA e raccogliere pezzi di pelle a pieno spessore per l'analisi immunoistochimica. Utilizzare un punzone di biopsia per raccogliere pezzi di pelle da campioni di papilloma e pelle non papilloma per l'espressione genica e o anaylses proteici e utilizzare un bisturi per raccogliere pezzi da papilloma e pelle non papilloma per l'analisi immunoistochimica. Quindi raccogliere i linfonodi drenanti della pelle e un pezzo della milza per l'analisi citometrica del flusso come desiderato.Una differenza statisticamente significativa nel tempo libero del papilloma e nel numero di papillomi tra i gruppi sperimentali è tipicamente osservata nel modello tumorale TPA DMBA. Le analisi istologiche sono adatte per studiare la struttura dei papillomi, la morfologia della pelle o l'infiltrazione di cellule immunitarie di interesse. È essenziale applicare il DMBA e il TPA in modo uniforme sulla pelle e applicare il TPA a intervalli costanti.È anche importante contare regolarmente i papillomi. I meccanismi che influenzano il numero e il tempo della formazione tumorale possono essere studiati utilizzando diversi metodi, tra cui immunoistochimica, citometria del flusso, PCR quantitativa e analisi proteica. Questa tecnica convenzionale può essere facilmente adattata e applicata per studiare gli effetti di diversi geni, fattori ambientali o terapie di interesse sull'iniziazione e la progressione del tumore.È necessaria cautela quando si esegue la tecnica poiché il DMBA è cancerogeno e l'acetone evapora rapidamente. Si consiglia una maschera respiratoria adatta e l'uso dell'armadio a flusso.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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