Name: chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)
Uploaded: 2019-12-19T14:00:00
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この作品は、フィンランドアカデミー(助成金25013080481および25013142041(I.J.)、286377および295814(M.P.)、287907(T.J.))、パイビッキとサカリ・サルベルク財団(M.P.)によって資金提供されました。 T.J.)、フィンランド医学財団(T.P.)、競争国家研究タンペレ大学病院の専門家責任領域(助成金9V049および9X044(M.P.)、9X011および9V010(T.J.))、フィムラボ研究所の専門家責任領域の競争国家研究ファイナンス(助成金X51409(I.J.))、テイズ支援財団(I.J.、M.P.、T.J.)、タンペレ結核財団(I.J.、M.P.、T.J.)、フィンランド文化財団(M.V.)、パウロ財団(T.P.)、フィンランド癌協会(M.P.)、エミール・アールトネン財団(T.P.)。

ここで説明するプロトコルは、フィンランドの国家動物倫理委員会(プロトコル番号ESAVI/23659/2018)によって承認されています。
1. 実験動物・試薬・機器
<ol><li>年齢と性別に一致したマウスを使用します。ほとんどのマウスの皮膚は、その2歳の周りのテロゲン(休息段階)にあるので、7〜9週齢で研究を開始します。</li>
	<li>研究中に動物の行動を観察し、?...

DMBA-TPA誘発性皮膚癌は、非常に再現性が高く、開始から悪性腫瘍への腫瘍進行に関する情報を提供するため、最も一般的に使用される癌モデルの1つである。主要な結果測定は、乳頭腫形成が容易かつ確実に定量的である。このモデルは、腫瘍開始(腫瘍フリー生存)と進行(腫瘍数とサイズ)の両方に同時に対処する。このモデルは、潜在的な治療薬などの異なる化合物の研究、および遺伝子組み...

癌は世界の主要な死因の一つである。したがって、疾患のより良い理解を得るために、また潜在的な治療アプローチを探求するために、信頼性の高い実験疾患モデルを開発する必要があります。皮膚癌の発症を研究するために生体内モデルで最も一般的に使用される実験の1つは、化学的に誘導された二段皮膚発癌モデル1、2である。このモデルは、免疫細胞浸潤や血管新生などの特定の事象に加えて、腫瘍の開始、促進、および進行を研究するためのツールを提供します。
二段皮膚発癌モデルを使用するために、マウスの背部皮膚は、一緒に腫瘍形成を誘導する2つの異なる化学物質で治療される。モデルは、変異原、DMBAの低用量で開始され、続いて腫瘍プロモーターへの長期暴露、TPA3(図1)。DMBAは、表皮細胞および原発性角化細胞幹細胞4、5、6、7のDNAと共有付加を形成することによりDNAをランダムに変異させる。これらのランダム突然変異の一部は、Hras1(KrasおよびNrasの突然変異も検出される)のようなプロトオンコジーンで起こり、プロトオンコゲ遺伝子を腫瘍遺伝子に変換すると、適切な刺激の下で腫瘍形成を促進する。TPAは、順番に、最も一般的に使用される腫瘍増殖促進剤である。その分子標的はプロテインキナーゼC(PKC)8である。TPAはまた、モデル9の腫瘍形成に不可欠なWnt/β-カテニンシグナル伝達を活性化する。促進剤への反復および長期暴露は、細胞シグナル伝達の増強、増殖因子の産生の増加、および治療された皮膚におけるDNA合成および炎症性細胞浸潤の増加によって明らかである局所炎症反応につながる。
DMBA-TPAモデルの主要な炎症メディエーターは10.インターロイキン-17A(IL-17A)は、DMBA-TPAモデル11、12において特に腫瘍原性であることが知られている。インターロイキン6(IL-6)との相乗効果で動作し、マクロファージおよび好中球募集13、14に参加しています。さらに、CD4+T細胞および好中球は、DMBA-TPAモデルにおいて腫瘍原性であることが示されている。最後に、マクロファージはまた、モデル15、16、17における腫瘍形成を促進することができる。
促進段階では、変異細胞の細胞増殖が増強され、表皮の持続的な過形成が1に維持される。これは、10〜20週で皮膚の乳頭腫の発症につながり、その後乳頭腫は悪性腫瘍に変換し始め、扁平上皮癌(SCC)2。しかしながら、乳頭腫の10%未満は悪性腫瘍に進行するが、この割合はマウス2、18の遺伝的背景にも依存する。何十年もの間、悪性腫瘍につながる腫瘍で最初にどのような種類の細胞が変異したのかは分かっていなかったが、良性乳頭腫19、20と比較した場合、悪性腫瘍の明らかに明確な特徴を報告していた。しかし、最近の研究は、DMBA-TPAモデル21における腫瘍形成のクローン起源に関する我々の理解を大幅に高めています。22.23.骨髄由来上皮細胞および毛包幹細胞の両方が腫瘍形成22に寄与することが実証された。ステージ特異的系統追跡研究は、良性乳頭腫がモノクローナル起源であることを明らかにしたが、彼らは新しい上皮細胞集団21、23を募集する。しかし、細胞クローンの1つだけは発癌のドライバーとして機能します。それはフラス突然変異23を含んでいます。癌形成への進行は、クローンススイープ23に関連している。
発がん性DMBAは乳頭腫形成を開始し、TPAは腫瘍の増殖を促進する。したがって、腫瘍開始は、TPA治療期間の前に実験を中断することによって、促進とは別に研究することができる。腫瘍の進行が毎週研究されているように、それは研究全体を通して詳細な腫瘍の成長分析のための素晴らしい機会を提供しています。腫瘍は外部化学物質によって生成されるため、生殖細胞系列の発癌性突然変異は不要である。従って、遺伝的背景(例えば、ノックアウト/トランスジーン対野生型)が腫瘍形成に及ぼす影響を研究することは、簡単な2である。要するに、DMBA/TPA皮膚癌モデルは、腫瘍進行における免疫系の役割を研究するだけでなく、腫瘍の開始および促進ステップを独立または相互に依存的に評価するための特に有用なアプローチである。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60445/60445fig1a.jpg"> 図1:DMBA-TPA誘発皮膚発癌モデルの概要発がん性DMBAは、モデルの開始段階でDNA突然変異を誘導するために局所的に適用される。増殖促進剤TPAは、促進段階の間に細胞増殖を増強するために週2倍投与され、皮膚における乳頭腫の発症につながる。動物は、乳頭腫応答が高原に達した後、マウスの遺伝的背景に応じて、通常15〜20週以内に犠牲にされる。乳頭腫のごく一部は、さらに20〜50週間以内にSCCに発展することができます。開始および早期プロモーション段階の初期の事象を研究するために、サンプルを収集することができる(例えば、2番目のTPAアプリケーションの直後)。19週間の治療後のC57BL/6マウス皮膚上の乳頭腫の代表的な写真およびヘマトキシリンおよびエオシン染色断面が示されている。スケール バー = 0.1 mm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60445/60445fig1large.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1730-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1180-9710-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3254-100MG</td>
			<td>Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000141011</td>
			<td>Evaporates rapidly and is inflammable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane vet 1000 mg/g</td>
			<td>Piramal Critical Care Limited</td>
			<td></td>
			<td>Liquid isoflurane for inhalation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery-Operated Clipper Isis</td>
			<td>Albert Kerlb GmbH</td>
			<td>GT421</td>
			<td>For shaving the fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONTRAfluran-Restgasfilter</td>
			<td>ZeoSys GmbH</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linex Nature N1030 Ruler 30 cm</td>
			<td>Staples Business Advantage</td>
			<td>60383</td>
			<td>For measuring papillomas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN045AR</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mekasoft</td>
			<td>Mekalasi</td>
			<td>23008</td>
			<td>Table cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (Balb/c JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL/6JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>For histology samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-PE160-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance PLJ-C/PLJ-G</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>PLJ 600-3CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN044BX</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>For nucleic acid samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 100-1000 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 20-200 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Anaesthetic Key Filler</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Face Mask for Mouse</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO FM2200 Flowmeter</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Gas Exhaust Unit</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Induction Box</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO200VAP Vaporizer</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)

癌は最も壊滅的な人間の病気の一つです。実験的な癌モデルは、腫瘍の進行を促進する上で異なる細胞型および遺伝子の複雑な相互作用に関する洞察を得て、異なる治療アプローチの有効性をテストするためのプラットフォームを提供するために重要である。最も一般的に使用される実験的炎症性癌モデルの1つは、DMBA-TPA二段皮膚発癌モデルである。腫瘍形成は、7,12-ジメチルベンズ(a)アントラセン(DMBA)と12-O-テトラデカノイルホルボル-13-酢酸(TPA)の2つの異なる化学物質の局所適用によってこのモデルに誘導され、一緒に皮膚に乳頭腫形成を引き起こす。主な結果は皮膚における乳頭腫形成であるため、モデルは、腫瘍の開始(腫瘍を含まない生存)と腫瘍進行(目に見える腫瘍の数と大きさ)の両方に対処するための理想的で信頼性が高く、再現可能な方法です。DMBA-TPA治療の効果は炎症機構を介して伝達され、このモデルは腫瘍形成における免疫系の役割を研究するのに特に適している。しかし、このモデルは、化学物質を適用できる皮膚および他の表面に制限される。この記事では、モデルを正常に使用するための詳細なプロトコルが提供されています。

主な結果は、治療または遺伝子型群間の生存(すなわち、乳頭腫フリー)時間である。二次的な結果は、各グループの週あたりの乳頭腫の数です(図2)。期待される結果は、乳頭腫の自由時間と実験(2つ以上)群間の乳頭腫の数において統計的に有意な差である。その段階でのグループ間の違いを把握するために、パピロマの数をカウントし、プロモーション(TPA)フェーズ中に...

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Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA

二段皮膚発癌は、局所的に適用される2つの化学物質によって誘発される。変異原7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン)は、表皮細胞の突然変異を引き起こし、一般的な増殖刺激剤12-O-テトラデカノイルホルボル-13-酢酸の連続的な適用は、皮膚乳頭腫形成を促進する。

ジメチルベンズを用いた化学的誘発性皮膚発癌モデル[a]アントラセンと12-O-テトラデカノイル・ホルボル-13-酢酸(DMBA-TPA)

Cancer is one of the most devastating human diseases. Experimental cancer models are important to gain insight into the complex interplay of different ...

この2段階の皮膚癌モデルは、皮膚癌における炎症の役割の研究を可能にし、腫瘍の進行とは別のプロセスとして腫瘍開始を研究することを可能にする。このモデルの腫瘍形成は化学的に誘導され、ノックアウト株を使用して環境因子または治療候補の効果を研究することを可能にする。このモデルは、がんにおける免疫系と血管新生の役割を研究するのに適しています。これは、ヒト患者における扁平上皮癌と同様の疾患病態を示す。この方法は比較的行いやすいですが、正確なタイミングが不可欠です。発がん性物質であるDMBAを取り扱う際には、適切な安全対策を講じることも重要です。実験を開始する前に、戦いと皮膚病変を避けるために、別々のケージに任意の積極的な7〜9週のマウスを収容します。皮膚乳頭腫誘導の場合は、まず実験動物の背中の皮膚を剃り、マウスを個別に計量する。シェービングの48時間後、ピペットを使用して、各麻酔マウスの剃った領域に200マイクロリットルのDMBAを50マイクログラム塗布します。皮膚乳頭腫の促進のために、DMBAの適用の7日後に、実験の終わりまで週に2回200マイクロリットルのアセトンで5マイクログラムのTPAで皮膚を治療する。乳頭腫の動物を調べ、毎週地図上の個々の乳頭腫の大きさを写真に記録します。直径1ミリメートルを超える触知可能な質量は、1週間以上残っている場合は乳頭腫と見なされます。腫瘍応答が高原に達すると、最後のTPAの適用の24時間後に動物から適切なサンプル材料を収穫し、免疫組織化学分析のために皮膚の完全な厚さの部分を採取する。生検パンチを使用して、乳頭腫および非乳頭腫の皮膚サンプルから遺伝子発現およびタンパク質アニールスを採取し、メスを使用して乳頭腫および非乳頭腫皮膚から断片を収集して免疫学的分析を行います。次に、皮膚のリンパ節を排出し、必要に応じてフローサイトメトリック分析のために脾臓の一部を収集します。乳頭腫の遊離時間と実験群間の乳頭腫の数の統計的に有意な差は、典型的にはDMBA TPA腫瘍モデルにおいて観察される。組織学的分析は、乳頭腫の構造、皮膚の形態、または目的の免疫細胞の浸潤を研究するのに適しています。皮膚にDMBAとTPAを均等に塗布し、一定の間隔でTPAを適用することが不可欠です。また、定期的に乳頭腫を数える事が重要です。腫瘍形成の数と時間に影響を与えるメカニズムは、免疫組織化学、フローサイトメトリー、定量PCR、タンパク質分析など、さまざまな方法を用いて研究することができます。この従来の技術は、腫瘍の開始および進行に対する異なる遺伝子、環境因子、または目的の治療薬の効果を研究するために容易に適応し、適用することができる。DMBAは発がん性があり、アセトンはすぐに蒸発するので、この技術を行う際には注意が必要です。適当な呼吸マスクとフローキャビネットの使用をお勧めします。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

コンピュータベースの画像解析を用いて4T1乳がんモデルにおける肺転移の定量化を改善

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Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

迅速かつ定量的なチック絨毛管内膜モデルを用いた転移性調節因子の発見

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNAシーケンシング用の3つの微分発現解析方法:リンマ、エッジャー、DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...