Name: chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)
Uploaded: 2019-12-19T14:00:00
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이 작품은 핀란드 아카데미 (보조금 25013080481 및 25013142041 (I.J.), 286377 및 295814 (M.P.), 287907 (T.J.), Päivikki 및 사카리 솔베르크 재단 (M.P., T.J.), 핀란드 의학 재단 (T.P.), 경쟁 국가 연구 탐페레 대학 병원의 전문가 책임 영역 의 자금 조달 (부여 9V049 및 9X044 (M.P.), 9X011 및 9V010 (T.J.), Fimlab 실험실의 전문가 책임 영역의 경쟁 국가 연구 자금 조달 (부여 X51409 (I.J.)), Tays 지원 재단(I.J., M.P., T.J.), 탐페레 결핵 재단(I.J., M.P., T.J.), 핀란드 문화 재단(M.V.), 파울로 재단(T.P.), 핀란드 암 학회(M.P.), 에밀 알토넨 재단(T.P.).

여기에 설명된 프로토콜은 핀란드 국립 동물 윤리 위원회(프로토콜 번호 ESAVI/23659/2018)의 승인을 받았습니다.
1. 실험 동물, 시약 및 장비
<ol><li>나이와 성냥생을 사용한다. 대부분의 마우스에 있는 피부가 그 나이 의 주위에 텔로겐 (휴식 단계)에 있기 때문에 나이의 7-9 주에 연구 결과를 시작합니다2.</li>
	<li>연구 기간 동안 동물의 행동을 관찰하고 종종 남?...

DMBA-TPA 유도된 피부암은 매우 재현성이 뛰어나고 개시에서 악성종양에 이르는 종양 진행에 대한 정보를 제공하기 때문에 가장 일반적으로 사용되는 암 모델 중 하나입니다. 주요 결과 측정, 유두종 형성은 쉽고 안정적으로 양적입니다. 이 모델은 종양 개시 (종양없는 생존) 및 진행성 (종양 수 및 크기)을 동시에 해결합니다. 이 모델은 잠재적 치료제와 같은 다양한 화합물을 연구하는 데 적합하며 ...

암은 세계에서 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 따라서, 질병에 대한 더 나은 이해를 얻고 잠재적인 치료 접근법을 탐구하기 위해 신뢰할 수 있는 실험적 질병 모델을 개발해야 하는 요구가 있다. 피부암 발병을 연구하기 위해 생체내에서 가장 일반적으로 사용되는 실험 모델 중 하나는 화학적으로 유도된 2단계 피부발암 생성 모델1,2이다. 이 모델은 면역 세포 침투 및 혈관 신생과 같은 특정 사건 이외에 종양 개시, 승진 및 진행을 연구하는 도구를 제공합니다.
2단계 피부 발암 모델을 사용하기 위해, 마우스의 뒷피부는 함께 종양 형성을 유도하는 2개의 상이한 화학물질로 치료된다. 모델은 돌연변이원, DMBA의 저용량으로 개시되고, 종양 프로모터, TPA3에 장기간 노출된다(도1). DMBA는 표피 세포와 1 차적인 각질 세포 줄기 세포의 DNA를 가진 공유 adducts를 형성하여 무작위로 DNA를돌연변이4,5,6,7. 이 무작위 돌연변이의 몇몇은 Hras1와 같은 프로토 종양유전자에서 일어나고 (Kras와 Nras에 있는 돌연변이는 또한 검출됩니다) 및 종양 유전자에 프로토 종양유전자의 변환은 적당한 자극의 밑에 종양 대형을 구동합니다. TPA는 차례로, 가장 일반적으로 사용되는 종양 성장 촉진 제이다. 이의 분자 표적은 단백질 키나아제C(PKC)8이다. TPA는 또한 모델9에서종양 형성에 중요한 Wnt/β-카테닌 신호를 활성화합니다. 촉진제에 대한 반복적이고 장기간 노출되면 세포 신호 신호, 성장 인자의 생산 증가, 및 치료된 피부의 DNA 합성 및 염증 세포 침투 증가로 인한 국소 염증 반응이 나타납니다.
DMBA-TPA 모델의 주요 염증 성 중재자는10. 인터류핀-17A(IL-17A)는 DMBA-TPA 모델11,12에서특히 종양발생성인 것으로 알려져 있다. 인터류키친 6(IL-6)과 시너지 효과를 발휘하며 대식세포 및 호중구 모집에 참여하고13,14. 또한,CD4+ T 세포 및 호중구는 DMBA-TPA 모델에서 종양발생이 있는 것으로 나타났다. 마지막으로, 대식세포는 또한 모델15,16,17에서종양 발생을 촉진할 수 있다.
촉진 단계에서, 돌연변이된 세포의 세포 증식은 강화되고 표피의 지속적인 증식은1. 이것은 10-20 주에 있는 피부에 있는 유두종 발달로 이끌어 내고, 그 후에 유두종은 악성 종양, 편평상피세포 암(SCC)2로 전환하기 시작합니다. 그러나, 유두종의 10% 미만은 악성으로 진행되지만, 이 비율은 또한 마우스2,18의유전적 배경에 의존한다. 수십 년 동안 어떤 종류의 세포가 악성 종양으로 이어지는 종양에서 처음 돌연변이되었는지는 알려지지 않았지만, 일부 연구는 양성 유두종19,20과비교할 때 악성 종양에서 명확하게 뚜렷한 특징을 보고했음에도 불구하고. 그러나, 최근 연구 결과는 DMBA-TPA 모형21에있는 종양 대형의 클론 기원에 우리의 이해를 크게증가시켰습니다. 22. 23.골수 유래 상피 세포와 모낭 줄기 세포 모두 종양 형성에 기여하는 것으로 입증되었다22. 단계 특정 혈통 추적 연구 결과는 양성 유두종이 단클론 기원의 다는 것을, 그러나 새로운 상피 세포 인구를 모집한다는 것을 밝혔다21,23. 그러나, 세포 클론 중 하나만 발암을 위한 드라이버로 기능; 그것은 Hras 돌연변이23을포함합니다. 암종 형성에 대한 진행은 클론스윕(23)과연관된다.
발암 물질 DMBA 유두종 형성을 시작 하 고 TPA 종양 성장을 촉진. 따라서, 종양 개시는 TPA 치료 기간 전에 실험을 중단시킴으로써 촉진으로부터 별도로 연구될 수 있다. 종양 진행이 매주 연구됨에 따라 연구 전반에 걸쳐 상세한 종양 성장 분석을 위한 좋은 기회를 제공한다. 종양은 외부 화학 물질에 의해 생성되기 때문에 생식선의 종양 발생 돌연변이가 필요하지 않습니다. 따라서, 종양 발생에 대한 유전 적 배경 (예를 들어, 녹아웃 / 이식 유전자 대 야생 유형)의 효과를 연구하는 것은 간단합니다2. 요약하면, DMBA/TPA 피부암 모델은 종양 진행에서 면역 계통의 역할을 연구할 뿐만 아니라 종양 개시 및 승진 단계의 독립적으로 또는 상호 의존적으로 평가하는 데 특히 유용한 접근법이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60445/60445fig1a.jpg"> 도 1: DMBA-TPA-유도 피부 발암 모델 개요. 발암 물질 DMBA는 모델의 개시 단계에서 DNA 돌연변이를 유도하기 위해 국소적으로 적용된다. 성장 촉진제 TPA는 촉진 단계 동안 세포 증식을 향상시키기 위해 일주일에 2회 투여되며, 피부의 유두종 발달로 이어진다. 유두종 반응이 고원에 도달한 후, 보통 마우스의 유전적 배경에 따라 15-20주 이내에 동물을 희생한다. 유두종의 작은 비율은 20-50 주 안에 SCC로 더 발전할 수 있습니다. 개시 및 조기 승격 단계에서 초기 이벤트를 연구하기 위해 샘플을 수집할 수 있습니다(예: 두 번째 TPA 적용 직후). 19주 간의 치료 후 C57BL/6 마우스 피부에 유두종의 대표적인 사진과 헤마톡실린 및 에오신 스테인드 단면이 표시됩니다. 배율 표시줄 = 0.1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60445/60445fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1730-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1180-9710-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3254-100MG</td>
			<td>Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000141011</td>
			<td>Evaporates rapidly and is inflammable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane vet 1000 mg/g</td>
			<td>Piramal Critical Care Limited</td>
			<td></td>
			<td>Liquid isoflurane for inhalation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery-Operated Clipper Isis</td>
			<td>Albert Kerlb GmbH</td>
			<td>GT421</td>
			<td>For shaving the fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONTRAfluran-Restgasfilter</td>
			<td>ZeoSys GmbH</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linex Nature N1030 Ruler 30 cm</td>
			<td>Staples Business Advantage</td>
			<td>60383</td>
			<td>For measuring papillomas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN045AR</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mekasoft</td>
			<td>Mekalasi</td>
			<td>23008</td>
			<td>Table cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (Balb/c JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL/6JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>For histology samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-PE160-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance PLJ-C/PLJ-G</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>PLJ 600-3CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN044BX</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>For nucleic acid samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 100-1000 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 20-200 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Anaesthetic Key Filler</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Face Mask for Mouse</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO FM2200 Flowmeter</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Gas Exhaust Unit</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Induction Box</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO200VAP Vaporizer</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)

암은 가장 치명적인 인간의 질병 중 하나입니다. 실험적인 암 모형은 종양 진행을 승진시키기에 있는 다른 세포 모형 및 유전자의 복잡한 상호 작용에 통찰력을 얻고 다른 치료 접근의 효험을 시험하기 위한 발판을 제공하기 위하여 중요합니다. 가장 일반적으로 사용되는 실험적 염증성 암 모델 중 하나는 DMBA-TPA 2단계 피부 발암 모델입니다. 종양 형성은 두 가지 다른 화학 물질, 7,12-디메틸벤드[a]안트라세네(DMBA) 및 12-O-테트레이드카노일 포르볼-13-아세테이트(TPA)의 국소 적용에 의해 이 모델에서 유도되며, 이는 함께 피부에 유두종 형성을 일으킨다. 1 차적인 결과는 피부에 있는 유두종 대형이기 때문에, 모형은 종양 개시 (종양 자유로운 생존) 및 종양 진행 (눈에 보이는 종양의 수 그리고 크기) 둘 다를 해결하는 이상적이고, 믿을 수 있고, 재현가능한 방법입니다. DMBA-TPA 치료의 효과는 염증 메커니즘을 통해 전달되며, 이 모델은 종양 형성에서 면역 계통의 역할을 연구하는 데 특히 적합합니다. 그러나 이 모델은 화학 물질을 적용할 수 있는 피부 및 기타 표면으로 제한됩니다. 이 문서에서는 모델을 성공적으로 사용할 수 있는 자세한 프로토콜이 제공됩니다.

주요 결과는 치료 또는 유전자형 그룹 사이의 생존 (즉, 유두종 무료) 시간입니다. 두 번째 결과는 각 그룹에서 주당 유두종의 수입니다(그림 2). 예상 된 결과는 유두종 자유 시간 및 실험 (2 개 이상의) 그룹 사이의 유두종의 수에서 통계적으로 유의한 차이이다. 유두종의 수를 계산하고 프로모션 (TPA) 단계에서 곡선을 그리는 것이 좋습니다 그 단계에서 그룹 간의 차이의 아?...

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Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA

2 단계 피부 발암은 2개의 국소 적용된 화학제품에 의해 유도됩니다. 돌연변이 원 7,12-디메틸벤젠[a]anthracene)은 표피 세포의 돌연변이를 일으키고 일반적인 성장 자극기 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-아세테이트의 지속적인 적용은 피부 유두종 형성을 가속화합니다.

디메틸벤드[a]안트라세네 및 12-O-테트레이드카노일 포르볼-13-아세테이트(DMBA-TPA)를 이용한 화학적 유발 피부 발암 모델

Cancer is one of the most devastating human diseases. Experimental cancer models are important to gain insight into the complex interplay of different ...

이 두 단계 피부암 모델은 피부암에서 염증의 역할에 대한 연구를 가능하게 하고 종양 진행과는 별개의 과정으로서 종양 개시를 연구할 수 있게 한다. 이 모형에 있는 종양 형성은 화학적으로 유도되고 환경 요인 또는 치료 후보의 효력을 공부하기 위하여 녹아웃 긴장의 사용을 허용합니다. 이 모델은 암에서 면역 체계와 혈관 신생의 역할을 연구하는 데 적합합니다.그것은 인간 적인 환자에 있는 편평상피 세포 암에 유사한 질병 병리를 보여줍니다. 이 방법은 비교적 수행하기 쉽지만 정확한 타이밍이 필수적입니다. 발암물질인 DMBA를 취급할 때 적절한 안전 조치를 취하는 것도 중요합니다.실험을 시작하기 전에, 싸움과 피부 병변을 피하기 위해 별도의 케이지에 공격적인 7 ~ 9 주 된 마우스를 보관하십시오. 피부 유두종 유도의 경우 먼저 실험 동물의 뒤쪽 스킨을 면도하고 마우스를 개별적으로 계량합니다. 면도 후 48시간 후, 파이펫을 사용하여 200마이크로리터의 DMBA를 각 마취 마우스의 면도 부위에 적용합니다.피부 유두종 프로모션의 경우, DMBA 적용 후 7일 후 실험종료까지 일주일에 두 번 200마이크로리터의 TPA 5마이크로그램으로 피부를 치료한다. 유두종 동물을 검사하고 매주지도에 각 개별 유두종의 크기를 촬영하고 기록합니다. 직경이 1밀리미터보다 큰 만져볼 수 있는 질량은 1주일 이상 남아 있는 경우 유두종으로 간주됩니다.종양 반응이 고원에 도달하면, 마지막 TPA 적용 후 24시간 후 동물로부터 적절한 시료 물질을 수확하고 면역히스토컬 분석을 위해 피부의 전체 두께 조각을 수집한다. 생검 펀치를 사용하여 유두종 및 비 유두종 피부 샘플에서 유전자 발현 및 단백질 아나일스를 수집하고 메스를 사용하여 면역 화학 적 분석을 위해 유두종 및 비 유두종 피부에서 조각을 수집합니다. 그런 다음 원하는대로 흐르는 세포 측정 분석을 위해 림프절과 비장의 조각을 배출하는 피부를 수집합니다.유두종 자유 시간 및 실험 군 간의 유두종의 수에 통계적으로 유의한 차이는 전형적으로 DMBA TPA 종양 모델에서 관찰된다. 조직학적 분석은 유두종의 구조, 피부의 형태 또는 관심있는 면역 세포의 침투를 연구하는 데 적합합니다. DMBA와 TPA를 피부에 고르게 바르고 일관된 간격으로 TPA를 적용하는 것이 필수적입니다.또한 유두종을 정기적으로 계산하는 것이 중요합니다. 종양 형성의 수와 시간에 영향을 미치는 메커니즘은 면역 조직 화학, 유동 세포측정, 정량적 PCR 및 단백질 분석을 포함한 다른 방법을 사용하여 연구될 수 있다. 이 종래의 기술은 종양 개시 및 진행에 대한 관심의 다른 유전자, 환경 요인 또는 치료법의 효과를 연구하기 위해 쉽게 적응하고 적용될 수 있다.DMBA는 발암성이고 아세톤이 빠르게 증발하기 때문에 기술을 수행할 때 주의가 필요합니다. 적절한 호흡 마스크와 유동 캐비닛의 사용을 권장합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

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연구

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Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

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Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...

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