Name: chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)
Uploaded: 2019-12-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Academy of Finland (tilskudd 25013080481 og 25013142041 (I.J.), 286377 og 295814 (M.P.), 287907 (TJ)), Päivikki og Sakari Sohlberg Foundation (M.P., TJ), Finnish Medical Foundation (T.P.), The konkurrerende State Research Finansiering av Expert ansvar området Tampere University Hospital (Grant 9V049 og 9X044 (M.P.), 9X011 og 9V010 (TJ)), den konkurransedyktige State Research finansiering av Expert ansvarsområde av Fimlab Laboratories (Grant X51409 (I.J.)), Tays Support Foundation (I.J., M.P., TJ), Tampere tuberkulose Foundation (I.J., M.P., TJ), den finske Cultural Foundation (M.V.), Paulo Foundation (T.P.), Cancer Society of Finland (M.P.), og Emil Aaltonen Foundation (T.P.).

Protokollen som beskrives her, er godkjent av Finlands nasjonale komité for dyreetikk (Protokollnummer ESAVI/23659/2018).
1. eksperimentelle dyr, reagenser og utstyr
<ol><li>Bruk mus som passer til alder og sex. Start studien på 7 – 9 ukers alder, fordi huden i de fleste mus er i telogen (hvile fasen) rundt den alderen2.</li>
	<li>Observere oppførselen til dyrene i løpet av studien, og hvis de kjemper, som ofte skjer med menn, huse dem separat. Kamper kan forår...

DMBA-TPA-indusert hudkreft er en av de mest brukte kreft modeller fordi det er svært reproduserbar og gir informasjon om tumorprogresjon fra innvielse til kreft. Nøkkelen utfallet mål, papilloma formasjon, er lett og pålitelig kvantitativ. Modellen adresserer både tumor initiering (tumor-fri overlevelse) og progresjon (tumor tall og størrelser) samtidig. Modellen er egnet for å studere ulike forbindelser, slik som potensielle legemiddel, og virkningene av individuelle gener på tumorprogresjon i genmodifiserte dyr...

Kreft er en av de viktigste årsakene til dødsfall i verden. Derfor er det et krav om å utvikle pålitelig eksperimentell sykdom modeller for å få en bedre forståelse av sykdommen, samt å utforske potensielle terapeutiske tilnærminger. En av de mest brukte eksperimentelle in vivo-modeller for å studere hudkreft utvikling er den kjemisk indusert to-trinns hud kreft modell1,2. Modellen gir et verktøy for å studere tumor innvielse, forfremmelse, og progresjon i tillegg til bestemte hendelser som immun celle infiltrasjon og angiogenese.
For å bruke to-trinns hud kreft modell, er baksiden hud av mus behandlet med to forskjellige kjemikalier som sammen induserer tumor formasjon. Modellen initieres med en lav dose av arvestoffskadelig, DMBA, etterfulgt av forlenget eksponering for tumor arrangøren, TPA3 (figur 1). DMBA mutates DNA tilfeldig ved å danne kovalente addukter med DNA av epidermal celler og primære Keratinocyte stamceller4,5,6,7. Noen av disse tilfeldige mutasjoner finner sted i en proto-diagnostisk, slik som Hras1 (mutasjoner i Kras og NRAs er også oppdaget) og konvertering av proto-oncogenes til oncogenes stasjoner svulsten formasjonen under riktig stimuli. TPA, i sin tur, er den mest brukte tumor vekst-fremme agent. Dens molekylære mål er protein kinase C (PKC)8. TPA aktiverer også wnt/β-catenin signalering som er avgjørende for tumor dannelse i modellen9. Gjentatt og langvarig eksponering for fremme agent fører til økt celle signalering, økt produksjon av vekstfaktorer, og en lokal inflammatorisk reaksjon, som er tydelig på grunn av økt DNA-syntese og inflammatorisk celle infiltrasjon i den behandlede huden.
De viktigste inflammatoriske meglere i DMBA-TPA-modellen har blitt identifisert10. Interleukin-17A (Il-17A) er kjent for å være spesielt tumorigene i DMBA-TPA-modellen11,12. Det fungerer i synergi med interleukin 6 (Il-6) og deltar i macrophage og nøytrofile rekruttering13,14. I tillegg har CD4+ T celler og nøytrofile blitt vist å være TUMORIGENE i DMBA-TPA-modellen. Endelig kan makrofager også fremme tumorigenesis i modellen15,16,17.
I løpet av kampanje fasen, celle spredning av muterte celler er forbedret og en vedvarende, ved over huden opprettholdes1. Dette fører til papilloma utvikling i huden i 10-20 uker, hvoretter papillomer begynner å konvertere til ondartede svulster, plateepitel celle kreftsvulster (SCCs)2. Men mindre enn 10% av papillomer fremdrift til kreft, selv om denne prosentandelen også avhenger av den genetiske bakgrunnen til musene2,18. I flere ti år var det ikke kjent hvilken type celler opprinnelig ble mutert i svulster som fører til kreft, selv om noen studier hadde rapportert klart distinkte funksjoner i ondartet svulster i forhold til godartet papillomer19,20. Men nyere studier har i stor grad økt vår forståelse på klonal opprinnelsen til tumor dannelse i DMBA-TPA-modellen21. 22i. 23. det ble demonstrert at både benmarg-avledet epitelceller og hårsekken stamceller bidrar til tumor formasjon22. Stage-spesifikke avstamning tracing studier har avduket at godartet papillomer er av monoklonale opprinnelse, men de rekruttere nye epitel celle populasjoner21,23. Men bare én av celle kloner fungerer som en driver for kreft; den inneholder en HRAS mutasjon23. Progresjon til kreft formasjon er forbundet med en klonal feie23.
Kreftfremkallende DMBA initierer papilloma formasjon og TPA fremmer tumor vekst. Derfor kan tumor innvielsen bli studert separat fra kampanjen ved å avbryte eksperimentet før den TPA behandlingsperioden. Som tumorprogresjon er studert ukentlig det gir en stor mulighet for detaljert tumor vekst analyse gjennom studien. Fordi svulster er generert av eksterne kjemikalier, en kreftfremkallende mutasjon i germline er unødvendig. Dermed studere virkningene av en genetisk bakgrunn (f. eks knockout/transgene g. Wild type) på tumorigenesis er enkel2. I sum er DMBA/TPA hudkreft modellen en spesielt nyttig tilnærming for å studere rollen til immunsystemet i tumorprogresjon samt for evaluering av tumor innvielse og forfremmelse trinn uavhengig eller uavhengig.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60445/60445fig1a.jpg"> Figur 1: DMBA-TPA-indusert hud kreft modell omriss. Kreftfremkallende DMBA brukes lokalt for å indusere DNA-mutasjoner i startfasen av modellen. Veksten-fremme agent TPA administreres 2x i uken for å forbedre celle spredning i løpet av kampanje fasen, som fører til utvikling av papillomer i huden. Dyr blir ofret etter papilloma responsen når et platå, vanligvis innen uker 15 – 20, avhengig av den genetiske bakgrunnen til musene. En liten andel av papillomer kan videreutvikle seg i SCCs i løpet av 20 – 50 uker. For å studere tidlige hendelser i initiering og tidlig forfremmelse fasen, kan prøvene samles (f. eks, kort tid etter den andre TPA-programmet). En representativ fotografi og hematoksylin og eosin farget tverrsnitt av papillomer på en C57BL/6 mus huden etter 19 ukers behandling er vist. Scale bar = 0,1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60445/60445fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1730-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1180-9710-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3254-100MG</td>
			<td>Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000141011</td>
			<td>Evaporates rapidly and is inflammable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane vet 1000 mg/g</td>
			<td>Piramal Critical Care Limited</td>
			<td></td>
			<td>Liquid isoflurane for inhalation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery-Operated Clipper Isis</td>
			<td>Albert Kerlb GmbH</td>
			<td>GT421</td>
			<td>For shaving the fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONTRAfluran-Restgasfilter</td>
			<td>ZeoSys GmbH</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linex Nature N1030 Ruler 30 cm</td>
			<td>Staples Business Advantage</td>
			<td>60383</td>
			<td>For measuring papillomas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN045AR</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mekasoft</td>
			<td>Mekalasi</td>
			<td>23008</td>
			<td>Table cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (Balb/c JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL/6JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>For histology samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-PE160-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance PLJ-C/PLJ-G</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>PLJ 600-3CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN044BX</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>For nucleic acid samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 100-1000 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 20-200 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Anaesthetic Key Filler</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Face Mask for Mouse</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO FM2200 Flowmeter</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Gas Exhaust Unit</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Induction Box</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO200VAP Vaporizer</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)

Kreft er en av de mest ødeleggende menneskelige sykdommer. Eksperimentelle kreft modeller er viktig for å få innsikt i det komplekse samspillet mellom ulike celletyper og gener for å fremme tumorprogresjon og for å gi en plattform for å teste effekten av ulike terapeutiske tilnærminger. En av de mest brukte eksperimentelle inflammatorisk kreft modellene er DMBA-TPA to-trinns hud kreft modell. Tumor formasjon er indusert i denne modellen av aktuell anvendelse av to ulike kjemikalier, 7, 12-dimethylbenz [a] anthracene (DMBA) og 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA), som sammen forårsake papilloma dannelse i huden. Som det primære utfallet er papilloma dannelse i huden, er modellen en ideell, pålitelig og reproduserbar måte å ta opp både tumor initiering (tumor-fri overlevelse) og tumorprogresjon (antall og størrelse på synlige svulster). Effekten av DMBA-TPA-behandlingen overføres via en inflammatorisk mekanisme, som gjør denne modellen spesielt egnet for å studere immunsystemets rolle i tumor dannelse. Imidlertid er denne modellen begrenset til huden og andre overflater der kjemikaliene kan påføres på. En detaljert protokoll er gitt i denne artikkelen for å bruke modellen vellykket.

Det viktigste utfallet er overlevelse (dvs. papilloma fri) tid mellom behandling eller genotype grupper. Det sekundære resultatet er antall papillomer per uke i hver gruppe (figur 2). De forventede resultatene er en statistisk signifikant forskjell i papilloma fritid og i antall papillomer mellom de eksperimentelle (to eller flere) grupper. Det anbefales å telle antall papillomer og tegne en kurve under forfremmelse (TPA) fase for å få et inntrykk av forskjellene mellom gruppene på det ...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA at JoVE.com

Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA

To-trinns hud kreft er indusert av to lokalt anvendte kjemikalier. A arvestoffskadelig 7, 12-dimethylbenz [a] anthracene) forårsaker mutasjoner i epidermal celler og en kontinuerlig anvendelse av generell vekst stimulator 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate akselererer hudens papilloma formasjon.

Kjemisk-indusert Skin kreft modell bruke Dimethylbenz [a] Anthracene og 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-acetate (DMBA-TPA)

Cancer is one of the most devastating human diseases. Experimental cancer models are important to gain insight into the complex interplay of different ...

Denne to trinns hudkreftmodellen gjør det mulig å studere rollen som betennelse i hudkreft og tillater studien tumorinitiering som en egen prosess fra tumorprogresjon. Tumordannelsen i denne modellen er kjemisk indusert og tillater bruk av knockout-stammer for å studere effekten av miljøfaktorer eller terapeutiske kandidater. Modellen er godt egnet for å studere immunsystemets rolle og angiogenese i kreft.Det viser en lignende sykdomspatologi til plateepitelkarsinom hos menneskelige pasienter. Selv om denne metoden er relativt enkel å gjennomføre, er nøyaktig timing viktig. Det er også viktig å ta nødvendige sikkerhetstiltak ved håndtering av DMBA, som er et kreftfremkallende.Før du begynner eksperimentet, hus noen aggressive syv til ni uker gamle mus i separate bur for å unngå kamp og hudlesjoner. For hudpapillotominduksjon, barber først tilbake skinnene til de eksperimentelle dyrene og veie musene individuelt. 48 timer etter barbering, bruk en pipette til å bruke 50 mikrogram DMBA i 200 mikroliter aceton på det barberte området av hver bedøvet mus.For hud papilloma markedsføring, syv dager etter DMBA søknad behandle huden med fem mikrogram TPA i 200 mikroliter aceton to ganger i uken gjennom slutten av eksperimentet. Undersøk dyrene for papillomer og fotografer og registrer størrelsen på hver enkelt papillom på et kart hver uke. En håndgripelig masse større enn en millimeter i diameter regnes som en papillom hvis den forblir lenger enn en uke.Når tumorresponsen når et platå, høst det riktige prøvematerialet fra dyrene 24 timer etter den siste TPA-applikasjonen og samling av full tykkelsesstykker av huden for immunohistokjemisk analyse. Bruk et biopsislag for å samle hudstykker fra papilloma og ikke-papilloma hudprøver for genuttrykk og eller protein anaylses og bruke en skalpell til å samle biter fra papilloma og ikke-papilloma hud for immunohistokjemisk analyse. Deretter samler huden drenering lymfeknuter og et stykke milten for strømning cytometrisk analyse som ønsket.En statistisk signifikant forskjell i papillomafri tid og i antall papillomer mellom de eksperimentelle gruppene observeres vanligvis i DMBA TPA tumormodellen. Histologiske analyser er egnet for å studere strukturen av papillomer, morfologien i huden, eller infiltrasjon av immunceller av interesse. Det er viktig å bruke DMBA og TPA jevnt på huden og å bruke TPA i konsistente intervaller.Det er også viktig å telle papillomene regelmessig. Mekanismene som påvirker antall og tid for tumordannelse kan studeres ved hjelp av ulike metoder, inkludert immunohistochemistry, flow cytometri, kvantitativ PCR og proteinanalyse. Denne konvensjonelle teknikken kan enkelt tilpasses og brukes til å studere effekten av forskjellige gener, miljøfaktorer eller terapeutiske midler av interesse for tumorinitiering og progresjon.Forsiktighet er nødvendig når du utfører teknikken siden DMBA er kreftfremkallende og aceton fordamper raskt. En passende pustemaske og bruk av strømningskabinett anbefales.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET og MRI guidet bestråling av en Glioblastoma rotte modell med en mikro-irradiator

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

3D Organotypic melanom Spheroid huden modell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Betydelig sluttpunkt og proliferativ markører å vurdere liten intestinal skaden og tilpasning benytter en musen modell av kjemoterapi-indusert mukositt

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radiosensitivity av kreft stamceller i lungekreft cellelinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studere trippel negativ brystkreft ved hjelp ortotopisk brystkreft modell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Bruke kylling chorioallantoic membran i Vivo modell for å studere gynekologiske og urologiske kreftformer

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Bruke databasert bildeanalyse for å forbedre kvantifiseringen av lungemetastase i 4T1 brystkreftmodell

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Oppdagelse av metastatiske regulatorer ved hjelp av en rask og kvantitativ intravital chick chorioallantoic membranmodell

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Tre differensialuttrykksanalysemetoder for RNA-sekvensering: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...