Name: chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)
Uploaded: 2019-12-19T14:00:00
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Este trabalho foi financiado pela Academia da Finlândia (subvenções 25013080481 e 25013142041 (I.J.), 286377 e 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), Päivikki e Fundação Sakari Sohlberg (Pm,, T.J.), Fundação Médica Finlandesa (T.P.), A Pesquisa Estatal Competitiva Financiamento da Área de Responsabilidade Especializada do Hospital Universitário de Tampere (concessão 9V049 e 9X044 (M.P.), 9X011 e 9V010 (T.J.)), O Financiamento De Investigação Estatal Competitivo da Área de Responsabilidade Especializada dos Laboratórios Fimlab (subvenção X51409 (I.J.)), Tays Fundação de Apoio (I.J., M.P., T.J.), Fundação Tampere Tuberculosis (I.J., M.P., T.J.), a Fundação Cultural Finlandesa (M.V.), a Fundação Paulo (T.P.), a Sociedade de Câncer da Finlândia (M.P.) e a Fundação Emil Aaltonen (T.P.).

O protocolo aqui descrito foi aprovado pelo Comitê Nacional de Ética Animal da Finlândia (número de protocolo ESAVI/23659/2018).
1. Animais experimentais, reagentes e equipamentos
<ol><li>Use idade e camundongos com sexo. Comece o estudo em 7-9 semanas de idade, porque a pele na maioria dos ratos está em telogênio (a fase de descanso) em torno dessa idade2.</li>
	<li>Observe o comportamento dos animais durante o estudo e se eles lutam, o que muitas vezes acontec...

O câncer de pele induzido pelo DMBA-TPA é um dos modelos de câncer mais usados porque é altamente reproduzível e fornece informações sobre a progressão do tumor da iniciação à malignidade. A medida-chave do resultado, a formação do papiloma, é facilmente e confiável quantitativa. O modelo aborda a iniciação tumoral (sobrevivência livre de tumores) quanto a progressão (números e tamanhos tumorais) simultaneamente. O modelo é adequado para estudar diferentes compostos, como potenciais terapêuticas, e ...

O câncer é uma das principais causas de morte no mundo. Portanto, há uma demanda para desenvolver modelos de doenças experimentais confiáveis para obter uma melhor compreensão da doença, bem como para explorar possíveis abordagens terapêuticas. Um dos modelos in vivo experimentais mais comumente usados para estudar o desenvolvimento do câncer de pele é o modelo de carcinogênese de pele de dois estágios quimicamente induzido1,2. O modelo fornece uma ferramenta para estudar a iniciação, a promoção e a progressão do tumor além dos eventos específicos tais como a infiltração da pilha imune e o angiogenesis.
Para usar o modelo de carcinogênese de pele em dois estágios, a pele traseira de camundongos é tratada com dois produtos químicos diferentes que, juntos, induzem a formação do tumor. O modelo é iniciado com uma dose baixa do mutagen, DMBA, seguido pela exposição prolongada ao promotor do tumor, TPA3 (Figura 1). DMBA muta DNA aleatoriamente, formando adutores covalentes com o DNA de células epidérmicas e células-tronco teatinócitos primários4,5,6,7. Algumas dessas mutações aleatórias ocorrem em um proto-oncogene, como Hras1 (mutações em Kras e Nras também são detectadas) e a conversão de proto-oncogenes para oncogenes impulsiona a formação tumoral estímulos adequados. O TPA, por sua vez, é o agente de promoção do crescimento tumoral mais utilizado. Seu alvo molecular é proteína kinase C (PKC)8. O TPA também ativa a sinalização wnt/β-catenina que é crucial para a formação de tumores no modelo9. A exposição repetida e prolongada ao agente promotor leva a uma sinalização celular aprimorada, aumento da produção de fatores de crescimento e uma reação inflamatória local, que são evidentes devido ao aumento da síntese de DNA e infiltração de células inflamatórias na pele tratada.
Os principais mediadores inflamatórios no modelo DMBA-TPA foram identificados10. Interleukin-17A (IL-17A) é conhecido por ser particularmente tumorigenic no modelo DMBA-TPA11,12. Trabalha em sinergia com interleucina 6 (IL-6) e participa do recrutamento de macrófagos e neutrófilos13,14. Além disso, as células TCD4 + e neutrófilos têm se mostrado tumorigenic no modelo DMBA-TPA. Finalmente, macrófagos também podem promover tumorigênese no modelo15,16,17.
Durante a fase de promoção, a proliferação celular das células mutadas é reforçada e uma hiperplasia sustentada da epiderme é mantida1. Isso leva ao desenvolvimento do papiloma na pele em 10-20 semanas, após o que os papilomas começam a se converter em tumores malignos, carcinomas de células escamosas (SCCs)2. No entanto, menos de 10% dos papilomas progridem para a malignidade, embora essa porcentagem também dependa do fundo genético dos camundongos2,18. Durante décadas não se sabia que tipo de células foram inicialmente mutadas nos tumores que levaram à malignidade, embora alguns estudos tenham relatado características claramente distintas nos tumores malignos quando comparados aos papilomas benignos19,20. No entanto, estudos recentes têm aumentado muito a nossa compreensão sobre a origem clonal da formação tumoral no modelo DMBA-TPA21. 22. 23.Demonstrou-se que ambas as células epiteliais derivadas da medula óssea e as células-tronco do folículo piloso contribuem para a formação tumoral22. Estudos de rastreamento de linhagem específicos de palco revelaram que os papilomas benignos são de origem monoclonal, mas recrutam novas populações de células epiteliais21,23. No entanto, apenas um dos clones celulares funciona como motorista de carcinogênese; ele contém uma mutação Hras23. A progressão para a formação de carcinoma está associada a uma varredura clonal23.
O DMBA cancerígeno inicia a formação do papiloma e a TPA promove o crescimento tumoral. Assim, a iniciação do tumor pode ser estudada separadamente da promoção interrompendo o experimento antes do período de tratamento do TPA. Como a progressão do tumor é estudada semanalmente, oferece uma grande oportunidade para a análise detalhada do crescimento do tumor ao longo do estudo. Porque os tumores são gerados por produtos químicos externos, uma mutação oncogenic na linha germinal é desnecessária. Assim, estudar os efeitos de um fundo genético (por exemplo, nocaute /transgene vs. tipo selvagem) sobre tumorigênese é simples2. Em suma, o modelo de câncer de pele DMBA/TPA é uma abordagem particularmente útil para estudar o papel do sistema imunológico na progressão do tumor, bem como para a avaliação dos passos de iniciação e promoção do tumor de forma independente ou interdependente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60445/60445fig1a.jpg"> Figura 1: Esboço do modelo de carcinogênese de pele induzida por DMBA-TPA. O DMBA cancerígeno é aplicado topicamente para induzir mutações no DNA na fase de iniciação do modelo. O agente promotor de crescimento TPA é administrado 2x por semana para aumentar a proliferação celular durante a fase de promoção, levando ao desenvolvimento de papilomas na pele. Os animais são sacrificados após a resposta do papiloma atingir um platô, geralmente dentro das semanas 15-20, dependendo do fundo genético dos ratos. Uma pequena proporção dos papilomas pode se desenvolver ainda mais em SCCs dentro de 20-50 semanas. Para estudar os primeiros eventos na fase de iniciação e promoção precoce, as amostras podem ser coletadas (por exemplo, logo após a segunda aplicação de TPA). Uma fotografia representativa e hematoxilina e eosina manchada seção transversal de papilomas em uma pele de rato C57BL/6 após 19 semanas de tratamento são mostrados. Barra de escala = 0,1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60445/60445fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1730-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1180-9710-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3254-100MG</td>
			<td>Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000141011</td>
			<td>Evaporates rapidly and is inflammable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane vet 1000 mg/g</td>
			<td>Piramal Critical Care Limited</td>
			<td></td>
			<td>Liquid isoflurane for inhalation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery-Operated Clipper Isis</td>
			<td>Albert Kerlb GmbH</td>
			<td>GT421</td>
			<td>For shaving the fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONTRAfluran-Restgasfilter</td>
			<td>ZeoSys GmbH</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linex Nature N1030 Ruler 30 cm</td>
			<td>Staples Business Advantage</td>
			<td>60383</td>
			<td>For measuring papillomas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN045AR</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mekasoft</td>
			<td>Mekalasi</td>
			<td>23008</td>
			<td>Table cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (Balb/c JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL/6JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>For histology samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-PE160-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance PLJ-C/PLJ-G</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>PLJ 600-3CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN044BX</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>For nucleic acid samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 100-1000 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 20-200 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Anaesthetic Key Filler</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Face Mask for Mouse</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO FM2200 Flowmeter</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Gas Exhaust Unit</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Induction Box</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO200VAP Vaporizer</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)

O câncer é uma das doenças humanas mais devastadoras. Modelos experimentais de câncer são importantes para obter informações sobre a complexa interação de diferentes tipos de células e genes na promoção da progressão do tumor e fornecer uma plataforma para testar a eficácia de diferentes abordagens terapêuticas. Um dos modelos experimentais mais utilizados de câncer inflamatório experimental é o modelo de carcinogênese de pele de dois estágios DMBA-TPA. A formação tumoral é induzida neste modelo pela aplicação tópica de dois produtos químicos diferentes, 7,12-dimetilbenz[a]antracaneno (DMBA) e phorbol-13-acetato de 12-O-tetradecanoyl (TPA), que juntos causam formação de papiloma na pele. Como o resultado primário é a formação do papiloma na pele, o modelo é uma maneira ideal, confiável e reproduzível de abordar tanto a iniciação tumoral (sobrevivência livre de tumores) quanto a progressão do tumor (número e tamanho de tumores visíveis). Os efeitos do tratamento DMBA-TPA são transmitidos através de um mecanismo inflamatório, o que torna este modelo especialmente adequado para estudar o papel do sistema imunológico na formação de tumores. No entanto, este modelo é restrito à pele e outras superfícies onde os produtos químicos podem ser aplicados. Um protocolo detalhado é fornecido neste artigo para usar o modelo com sucesso.

O principal resultado é o tempo de sobrevivência (ou seja, livre de papiloma) entre o tratamento ou os grupos genótipo. O resultado secundário é o número de papilomas por semana em cada grupo(Figura 2). Os resultados esperados são uma diferença estatisticamente significativa no tempo livre do papiloma e no número de papiillomas entre os grupos experimentais (dois ou mais). Recomenda-se contar o número de papilomas e desenhar uma curva durante a fase de promoção (TPA) para ter uma...

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Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA

A carcinogênese de pele em dois estágios é induzida por dois produtos químicos aplicados topicamente. Um mutagen 7,12-dimetilbenz [a] antracaneno) provoca mutações nas células epidérmicas e uma aplicação contínua do estimulador de crescimento geral 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetato acelera a formação de papiloma da pele.

Modelo de carcinogênese cutânea induzida por produtos químicos usando dimetilbenz[a]Anthracene e 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetato (DMBA-TPA)

Cancer is one of the most devastating human diseases. Experimental cancer models are important to gain insight into the complex interplay of different ...

Este modelo de câncer de pele de duas etapas permite o estudo do papel da inflamação no câncer de pele e permite ao estudo a iniciação do tumor como um processo separado da progressão do tumor. A formação de tumores neste modelo é quimicamente induzida e permite o uso de cepas de nocaute para estudar os efeitos de fatores ambientais ou candidatos terapêuticos. O modelo é adequado para estudar o papel do sistema imunológico e da angiogênese no câncer.Demonstra uma patologia da doença semelhante ao carcinoma escamoso celular em pacientes humanos. Embora este método seja relativamente fácil de conduzir, o tempo preciso é essencial. Também é importante tomar as medidas de segurança adequadas ao lidar com o DMBA, que é um cancerígeno.Antes de começar o experimento, abriga qualquer camundongo agressivo de sete a nove semanas em gaiolas separadas para evitar lutas e lesões na pele. Para indução de papiloma de pele, primeiro raspe as peles traseiras dos animais experimentais e pese os camundongos individualmente. 48 horas após a barba, use uma pipeta para aplicar 50 microgramas de DMBA em 200 microliters de acetona na área raspada de cada rato anestesiado.Para a promoção do papiloma de pele, sete dias após a aplicação de DMBA tratar a pele com cinco microgramas de TPA em 200 microlitros de acetona duas vezes por semana até o final do experimento. Examine os animais para papilomas e fotografe e grave o tamanho de cada papiloma individual em um mapa a cada semana. Uma massa palpável maior que um milímetro de diâmetro é considerada um papiloma se permanecer por mais de uma semana.Quando a resposta do tumor atingir um platô, colde o material amostral apropriado dos animais 24 horas após a última aplicação do TPA e cole moscotomas de espessura total da pele para análise imunohistoquímica. Use um soco de biópsia para coletar pedaços de pele de papiloma e amostras de pele não papiloscópica para expressão genética e ou anaylses proteicas e use um bisturi para coletar pedaços de papiloma e pele não papiloma para análise imunohistoquímica. Em seguida, colete os linfonodos de drenagem da pele e um pedaço do baço para análise citométrica de fluxo conforme desejado.Uma diferença estatisticamente significativa no tempo livre do papiloma e no número de papilomas entre os grupos experimentais é tipicamente observada no modelo de tumor DMBA TPA. Análises histológicas são adequadas para estudar a estrutura dos papiloscopes, a morfologia da pele ou a infiltração de células imunes de interesse. É essencial aplicar o DMBA e o TPA uniformemente na pele e aplicar TPA em intervalos consistentes.Também é importante contar os papilomas regularmente. Os mecanismos que afetam o número e o tempo de formação do tumor podem ser estudados utilizando diferentes métodos, incluindo imunohistoquímica, citometria de fluxo, PCR quantitativo e análise de proteínas. Esta técnica convencional pode ser facilmente adaptada e aplicada para estudar os efeitos de diferentes genes, fatores ambientais ou terapêuticas de interesse na iniciação e progressão do tumor.É necessário cautela ao executar a técnica, já que o DMBA é cancerígeno e a acetona evapora rapidamente. Recomenda-se uma máscara de respiração adequada e o uso de armário de fluxo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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