Name: chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)
Uploaded: 2019-12-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA at JoVE.com

Эта работа финансировалась Академией Финляндии (гранты 25013080481 и 25013142041 (I.J.), 286377 и 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), P'ivikki и Sakari Sohlberg Foundation (M.P., T.J.), Финский медицинский фонд (T.P.), Конкурентное государственное исследование Финансирование экспертной зоны ответственности университетской больницы Тампере (грант 9V049 и 9X044 (M.P.), 9X011 и 9V010 (T.J.)), Конкурентное государственное научно-исследовательское финансирование экспертной зоны ответственности лабораторий Fimlab (грант X51409 (I.J.)), Tays Фонд поддержки (I.J., M.P., T.J.), Фонд туберкулеза Тампере (I.J., M.P., T.J.), Финский культурный фонд (M.V.), Фонд Пауло (T.P.), Онкологическое общество Финляндии (M.P.) и Фонд Эмиля Аалтонена (T.P.).

Описанный здесь протокол был одобрен Национальным комитетом по этике животных Финляндии (протокольный номер ESAVI/23659/2018).
1. Экспериментальные животные, реагенты и оборудование
<ol><li>Используйте возраст и половые мышки. Начните исследование в возрасте 7-9 недель, потому что ...

DMBA-TPA-индуцированных рака кожи является одним из наиболее часто используемых моделей рака, поскольку он является высоко воспроизводимым и предоставляет информацию о прогрессии опухоли от начала до злокачественности. Ключевой показатель исхода, образование папилломы, легко и надежно ?...

Рак является одной из ведущих причин смерти в мире. Поэтому существует спрос на разработку надежных экспериментальных моделей заболеваний, чтобы лучше понять болезнь, а также изучить потенциальные терапевтические подходы. Один из наиболее часто используемых экспериментальных моделей in vivo для изучения развития рака кожи является химически индуцированной двухступенчатой модели канцерогенеза кожи1,2. Модель предоставляет инструмент для изучения инициации опухоли, поощрения и прогрессирования в дополнение к конкретным событиям, таким как инфильтрация иммунных клеток и ангиогенез.
Для использования двухступенчатой модели канцерогенеза кожи, задняя кожа мышей лечится двумя различными химическими веществами, которые вместе вызывают образование опухоли. Модель инициируется с низкой дозой мутагена, DMBA, а затем длительное воздействие опухолевого промотора, TPA3 (Рисунок 1). DMBA устраняет ДНК случайнымобразом,образуя ковалентные аддукты с ДНК эпидермальных клеток и первичных кератиноцитов стволовых клеток4,5,6,7. Некоторые из этих случайных мутаций происходят в протоонкогене, таких как Hras1 (мутации в Красе и Нрасе также обнаружены) и преобразование протоонкогенов в онкогены приводит к образованию опухоли при надлежащих стимулах. TPA, в свою очередь, является наиболее часто используемым средством роста опухоли. Его молекулярная цель - протеина киназа C (PKC)8. TPA также активирует Wnt / катенин сигнализации, что имеет решающее значение для формирования опухоли в модели9. Повторное и длительное воздействие рекламирующего агента приводит к усилению клеточной сигнализации, увеличению выработки факторов роста и локальной воспалительной реакции, которые проявляются из-за повышенного синтеза ДНК и проникновения воспалительных клеток в обработанную кожу.
Ключевые воспалительные посредники в модели DMBA-TPA были определены10. Интерлейкин-17А (IL-17A), как известно, особенно опухолевых в модели DMBA-TPA11,12. Он работает в синергии с интерлейкином 6 (IL-6) и участвует в макрофаге и нейтрофилов вербовки13,14. Кроме того, было показано, что CD4и Т-клетки и нейтрофилы опухолевые в модели DMBA-TPA. Наконец, макрофаги могут также способствовать опухолевому в модели15,16,17.
Во время этапа продвижения, пролиферация клеток мутировавших клеток усиливается и устойчивая гиперплазия эпидермиса поддерживается1. Это приводит к развитию папилломы в коже через 10-20 недель, после чего папилломы начинают преобразовываться в злокачественные опухоли, плоскоклеточные карциномы (СКК)2. Однако, менее 10% папиллом прогрессирует до злокачественных новообразований, хотя этот процент также зависит от генетического фона мышей2,18. На протяжении десятилетий не было известно, какой тип клеток были первоначально мутировали в опухолях, ведущих к злокачественности, хотя некоторые исследования сообщили четко различные особенности в злокачественных опухолей по сравнению с доброкачественными папилломы19,20. Тем не менее, недавние исследования значительно увеличили наше понимание клонального происхождения образования опухоли в модели DMBA-TPA21. 22. 23. Было продемонстрировано, что как костного мозга полученных эпителиальных клеток и волосяного фолликула стволовых клеток способствуют образованию опухоли22. Этап конкретных линий отслеживания исследований обнародовал, что доброкачественные папилломы моноклонального происхождения, но они вербуют новые эпителиальные популяции клеток21,23. Однако, только один из клонов клетки действует как водитель для канцерогенеза; он содержит мутацию Hras23. Прогрессирование к образованию карциномы связано с клональной развертки23.
Канцероген DMBA инициирует формирование папилломы и TPA способствует росту опухоли. Таким образом, инициация опухоли может быть изучена отдельно от продвижения, прервав эксперимент до периода лечения TPA. По мере того как прогрессирование тумора изучено еженедельно оно предлагает большую возможность для детального анализа роста тумора в течении изучения. Поскольку опухоли генерируются внешними химическими веществами, онкогенная мутация в зародышевой линии не нужна. Таким образом, изучение влияния генетического фона (например, нокаут/трансген против дикого типа) на опухолевый генез является простым2. В целом, модель рака кожи DMBA/TPA является особенно полезным подходом для изучения роли иммунной системы в прогрессировании опухоли, а также для оценки инициирования опухоли и продвижения шагов независимо или взаимозависимо.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60445/60445fig1a.jpg"> Рисунок 1: DMBA-TPA-индуцированной кожи канцерогенез модели контура. Канцероген DMBA местно применяется для индуцирования мутаций ДНК в фазе инициации модели. Стимулирующий рост агент TPA вводится 2 раз в неделю для повышения пролиферации клеток на этапе продвижения, что приводит к развитию папиллом в коже. Звери приносятся в жертву после того, как папиллома ответ достигает плато, как правило, в течение нескольких недель 15-20, в зависимости от генетического фона мышей. Небольшая часть папиллом может далее развиваться в SCCs в течение 20-50 недель. Для изучения ранних событий на этапе посвящения и раннего продвижения могут быть собраны образцы (например, вскоре после второго применения TPA). Представленная фотография и гематоксилин и эозин окрашенных сечение папилломы на c57BL/6 мыши кожи после 19 недель лечения показаны. Шкала бар 0,1 мм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60445/60445fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1730-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1180-9710-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3254-100MG</td>
			<td>Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000141011</td>
			<td>Evaporates rapidly and is inflammable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane vet 1000 mg/g</td>
			<td>Piramal Critical Care Limited</td>
			<td></td>
			<td>Liquid isoflurane for inhalation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery-Operated Clipper Isis</td>
			<td>Albert Kerlb GmbH</td>
			<td>GT421</td>
			<td>For shaving the fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONTRAfluran-Restgasfilter</td>
			<td>ZeoSys GmbH</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linex Nature N1030 Ruler 30 cm</td>
			<td>Staples Business Advantage</td>
			<td>60383</td>
			<td>For measuring papillomas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN045AR</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mekasoft</td>
			<td>Mekalasi</td>
			<td>23008</td>
			<td>Table cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (Balb/c JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL/6JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>For histology samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-PE160-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance PLJ-C/PLJ-G</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>PLJ 600-3CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN044BX</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>For nucleic acid samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 100-1000 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 20-200 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Anaesthetic Key Filler</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Face Mask for Mouse</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO FM2200 Flowmeter</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Gas Exhaust Unit</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Induction Box</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO200VAP Vaporizer</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)

Рак является одним из самых разрушительных заболеваний человека. Экспериментальные модели рака важны для получения информации о сложном интерплене различных типов клеток и генов в продвижении прогрессирования опухоли и предоставить платформу для тестирования эффективности различных терапевтических подходов. Одной из наиболее часто используемых экспериментальных моделей воспалительного рака является двухступенчатая модель канцерогенеза DMBA-TPA. Формирование опухоли индуцируется в этой модели путем местного применения двух различных химических веществ, 7,12-диметилбенза (DMBA) и 12-O-Tetradecanoyl форбол-13-ацетат (TPA), которые вместе вызывают образование папилломы в коже. В качестве основного результата является формирование папилломы в коже, модель является идеальным, надежным и воспроизводимым способом решения как инициации опухоли (без опухолевого выживания) и прогрессирования опухоли (количество и размер видимых опухолей). Эффекты лечения DMBA-TPA передаются через воспалительный механизм, что делает эту модель особенно подходящей для изучения роли иммунной системы в формировании опухоли. Тем не менее, эта модель ограничивается кожи и других поверхностей, где химические вещества могут быть применены на. Подробный протокол предоставляется в этой статье, чтобы успешно использовать модель.

Основным результатом является выживание (т.е. папиллома бесплатно) время между лечением или генотипгруппы. Вторичным результатом является количество папиллом в неделю в каждой группе(рисунок 2). Ожидаемые результаты являются статистически значимой разницей в свободно?...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA at JoVE.com

Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA

Двухступенчатый кожный канцерогенез индуцируется двумя местно прикладными химическими веществами. Мутаген 7,12-диметилбенцзазазазас) вызывает мутации в эпидермальных клетках и непрерывное применение стимулятора общего роста 12-O-Tetradecanoyl phorbol-13-ацетат ускоряет формирование папилломы кожи.

Химически-индуцированной модели карциногенеза кожи Использование диметилбенцзазаии и 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Ацетат (DMBA-TPA)

Cancer is one of the most devastating human diseases. Experimental cancer models are important to gain insight into the complex interplay of different ...

Эта двухшаговая модель рака кожи позволяет изучить роль воспаления в раке кожи и позволяет изучать инициирование опухоли как отдельный процесс от прогрессирования опухоли. Формирование опухоли в этой модели химически индуцированных и позволяет использовать нокаут штаммов для изучения воздействия факторов окружающей среды или терапевтических кандидатов. Модель хорошо подходит для изучения роли иммунной системы и ангиогенеза при раке.Он демонстрирует аналогичную патологию заболевания плоскоклеточной карциномы у пациентов. Хотя этот метод относительно прост в проведении, точное время имеет важное значение. Важно также принять соответствующие меры безопасности при обработке DMBA, который является канцерогеном.Перед началом эксперимента, дом любых агрессивных семи-девяти недель мышей в отдельных клетках, чтобы избежать боевых действий и поражений кожи. Для индукции папилломы кожи, сначала побрить спину шкуры экспериментальных животных и взвешивать мышей индивидуально. Через 48 часов после бритья используйте пипетку для применения 50 микрограммов DMBA в 200 микролитров ацетона на бритую область каждой обезболивающей мыши.Для продвижения папилломы кожи, через семь дней после применения DMBA лечить кожу с пятью микрограммами TPA в 200 микролитров ацетона два раза в неделю до конца эксперимента. Осматривать животных на папилломы и фотографировать и записывать размер каждой отдельной папилломы на карте каждую неделю. Ощутимая масса диаметром более одного миллиметра считается папилломой, если она остается длиннее одной недели.Когда реакция опухоли достигает плато, собрать соответствующий образец материала из животных 24 часов после последнего применения TPA и сбора полной толщины кусочки кожи для иммуногистохимического анализа. Используйте пунш биопсии для сбора кусочков кожи из папилломы и не папилломы образцов кожи для экспрессии генов и или белковых анаилов и использовать скальпель для сбора кусочков папилломы и не-папилломы кожи для иммуноистохимического анализа. Затем соберите слива кожи лимфатических узлов и кусок селезенки для потока цитометрического анализа по желанию.Статистически значимая разница во времени свободного времени папилломы и в количестве папиллом между экспериментальными группами обычно наблюдается в модели опухоли DMBA TPA. Гистологические анализы подходят для изучения структуры папиллом, морфологии кожи или проникновения иммунных клеток, представляющих интерес. Очень важно применять DMBA и TPA равномерно на коже и применять TPA в последовательных интервалах.Также важно регулярно считать папилломы. Механизмы, влияющие на количество и время образования опухоли, могут быть изучены с помощью различных методов, включая иммуногистохимию, цитометрию потока, количественный ПЦР и анализ белка. Этот обычный метод может быть легко адаптирован и применен для изучения влияния различных генов, факторов окружающей среды или терапевтических средств, представляющих интерес для инициирования и прогрессирования опухоли.При выполнении техники требуется осторожность, так как DMBA канцерогенен, а ацетон быстро испаряется. Рекомендуется подходящая дыхательная маска и использование шкафа потока.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

ПЭТ и МРТ руководствуясь облучения глиобластома мышиной модели с помощью микро облучатель

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Модель 3D Organotypic меланомы кожи сфероида

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Важные конечные точки и пролиферативные маркеры для оценки малых кишечных травм и адаптации с помощью мыши модели химиотерапии индуцированного мукозита

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Радиочувствительность стволовых клеток рака в линиях клеток рака легких

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Изучение Тройной отрицательный рак молочной железы Использование ортотопической модели рака молочной железы

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Использование куриных хориоаллантоических Membrane In Vivo Модель для изучения гинекологических и урологических раков

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Использование компьютерного анализа изображений для улучшения количественной оценки метастазов легких в модели рака молочной железы 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Открытие метастатических регуляторов с использованием быстрой и количественной прижизальной модели хориоаллантоической мембраны цыпленка

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Три метода дифференциального экспрессионного анализа для секвенирования РНК: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...