Name: chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)
Uploaded: 2019-12-19T14:00:00
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Este trabajo fue financiado por la Academia de Finlandia (grants 25013080481 y 25013142041 (I.J.), 286377 y 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), la Fundación P-ivikki y Sakari Sohlberg (M.P., T.J.), Fundación Médica Finlandesa (T.P.), La Investigación del Estado Competitivo Financiación del área de Responsabilidad Experta del Hospital Universitario de Tampere (subvención 9V049 y 9X044 (M.P.), 9X011 y 9V010 (T.J.)), Financiación Competitiva de la Investigación del Estado competitivo del área de Responsabilidad Experta de Fimlab Laboratories (subvención X51409 (I.J.)), Tays Fundación de Apoyo (I.J., M.P., T.J.), Tampere Tuberculosis Foundation (I.J., M.P., T.J.), la Fundación Cultural Finlandesa (M.V.), la Fundación Paulo (T.P.), la Sociedad del Cáncer de Finlandia (M.P.) y la Fundación Emil Aaltonen (T.P.).

El protocolo descrito aquí ha sido aprobado por el Comité Nacional de Etica Animal de Finlandia (número de protocolo ESAVI/23659/2018).
1. Animales experimentales, reactivos y equipos
<ol><li>Use la edad y los ratones que coincidan con el sexo. Comience el estudio a las 7-9 semanas de edad, porque la piel en la mayoría de los ratones está en telógeno (la fase de reposo) alrededor de esa edad2.</li>
	<li>Observar el comportamiento de los animales durante el estud...

El cáncer de piel inducido por DMBA-TPA es uno de los modelos de cáncer más utilizados porque es altamente reproducible y proporciona información sobre la progresión tumoral desde la iniciación hasta la neoplasia maligna. La medida clave del resultado, la formación del papiloma, es cuantitativa de manera fácil y fiable. El modelo aborda simultáneamente la iniciación del tumor (supervivencia libre de tumores) y la progresión (números y tamaños de tumores). El modelo es adecuado para estudiar diferentes compue...

El cáncer es una de las principales causas de muerte en el mundo. Por lo tanto, existe la demanda de desarrollar modelos de enfermedades experimentales fiables para obtener una mejor comprensión de la enfermedad, así como para explorar posibles enfoques terapéuticos. Uno de los modelos experimentales in vivo más utilizados para estudiar el desarrollo del cáncer de piel es el modelo de carcinogénesis cutánea de dos etapas inducido químicamentemodelo1,2. El modelo proporciona una herramienta para estudiar la iniciación, promoción y progresión del tumor, además de eventos específicos como la infiltración de células inmunitarias y la angiogénesis.
Para utilizar el modelo de carcinogénesis cutánea de dos etapas, la piel posterior de los ratones se trata con dos sustancias químicas diferentes que juntos inducen la formación de tumores. El modelo se inicia con una dosis baja del mutágeno, DMBA, seguida de una exposición prolongada al promotor tumoral, TPA3 (Figura 1). DMBA muta el ADN aleatoriamente mediante la formación de aductos covalentes con el ADN de células epidérmicas y células madre de queratinocitos primarios4,5,6,7. Algunas de estas mutaciones aleatorias tienen lugar en un protooncógeno, como Hras1 (también se detectan mutaciones en Kras y Nras) y la conversión de protooncogenes a oncogenes impulsa la formación tumoral bajo estímulos adecuados. TPA, a su vez, es el agente que promueve el crecimiento tumoral más comúnmente utilizado. Su diana molecular es la proteína quinasa C (PKC)8. TPA también activa la señalización Wnt/a-catenina que es crucial para la formación de tumores en el modelo9. La exposición repetida y prolongada al agente promotor conduce a una mayor señalización celular, una mayor producción de factores de crecimiento y una reacción inflamatoria local, que son evidentes debido al aumento de la síntesis de ADN y la infiltración de células inflamatorias en la piel tratada.
Se han identificado los principales mediadores inflamatorios en el modelo DMBA-TPA10. Se sabe que la interleucina-17A (IL-17A) es particularmente tumorigénica en el DMBA-TPA modelo11,12. Trabaja en sinergia con la interleucina 6 (IL-6) y participa en la captación de macrófagos y neutrófilos13,14. Además, se ha demostrado que los células CD4+ T y los neutrófilos son tumorígenos en el modelo DMBA-TPA. Por último, los macrófagos también pueden promover la tumorigenesis en el modelo15,16,17.
Durante la fase de promoción, se mejora la proliferación celular de las células mutadas y se mantiene una hiperplasia sostenida de la epidermis1. Esto conduce al desarrollo del papiloma en la piel en 10-20 semanas, después de lo cual los papilomas comienzan a convertirse en tumores malignos, carcinomas de células escamosas (SCC)2. Sin embargo, menos del 10% de los papilomas progresan a neoplasia maligna, aunque este porcentaje también depende del trasfondo genético de los ratones2,18. Durante décadas no se supo qué tipo de células fueron mutadas inicialmente en los tumores que conducen a la neoplasia maligna, a pesar de que algunos estudios habían reportado características claramente distintas en los tumores malignos en comparación con papilomas benignos19,20. Sin embargo, estudios recientes han aumentado en gran medida nuestra comprensión sobre el origen clónico de la formación de tumores en el DMBA-TPA modelo21. 22. 23. Se demostró que tanto las células epiteliales derivadas de la médula ósea como las células madre del folículo piloso contribuyen a la formación tumoral22. Estudios de trazado de linaje específicos de la etapa han revelado que los papilomas benignos son de origen monoclonal, pero reclutan nuevas poblaciones de células epiteliales21,23. Sin embargo, sólo uno de los clones celulares funciona como conductor de la carcinogénesis; contiene una mutación de Hras23. La progresión a la formación de carcinoma se asocia con un barrido clonal23.
El carcinógeno DMBA inicia la formación de papiloma y TPA promueve el crecimiento tumoral. Por lo tanto, la iniciación del tumor se puede estudiar por separado de la promoción interrumpiendo el experimento antes del período de tratamiento con TPA. A medida que la progresión del tumor se estudia semanalmente, ofrece una gran oportunidad para el análisis detallado del crecimiento tumoral a lo largo del estudio. Debido a que los tumores son generados por sustancias químicas externas, una mutación oncogénica en la línea germinal es innecesaria. Por lo tanto, el estudio de los efectos de un fondo genético (por ejemplo, nocaut/transgén frente a tipo salvaje) en la tumorigenesis es sencillo2. En resumen, el modelo de cáncer de piel DMBA/TPA es un enfoque particularmente útil para estudiar el papel del sistema inmunitario en la progresión tumoral, así como para la evaluación de los pasos de iniciación y promoción del tumor de forma independiente o interdependiente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60445/60445fig1a.jpg"> Figura 1: Esquema del modelo de carcinogénesis de la piel inducido por DMBA-TPA. El DMBA carcinógeno se aplica tópicamente para inducir mutaciones de ADN en la fase de iniciación del modelo. El agente promotor del crecimiento TPA se administra 2 veces a la semana para mejorar la proliferación celular durante la fase de promoción, lo que conduce al desarrollo de papilomas en la piel. Los animales son sacrificados después de que la respuesta del papiloma alcanza una meseta, generalmente dentro de las semanas 15-20, dependiendo del trasfondo genético de los ratones. Una pequeña proporción de los papilomas puede convertirse aún más en SCCs dentro de 20-50 semanas. Para estudiar los primeros eventos en la fase de iniciación y promoción temprana, se pueden recoger muestras (por ejemplo, poco después de la segunda solicitud de TPA). Se muestra una fotografía representativa y una sección transversal teñida de papilomas sobre una piel de ratón C57BL/6 después de 19 semanas de tratamiento. Barra de escala de 0,1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60445/60445fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1730-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1180-9710-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3254-100MG</td>
			<td>Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000141011</td>
			<td>Evaporates rapidly and is inflammable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane vet 1000 mg/g</td>
			<td>Piramal Critical Care Limited</td>
			<td></td>
			<td>Liquid isoflurane for inhalation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery-Operated Clipper Isis</td>
			<td>Albert Kerlb GmbH</td>
			<td>GT421</td>
			<td>For shaving the fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONTRAfluran-Restgasfilter</td>
			<td>ZeoSys GmbH</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linex Nature N1030 Ruler 30 cm</td>
			<td>Staples Business Advantage</td>
			<td>60383</td>
			<td>For measuring papillomas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN045AR</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mekasoft</td>
			<td>Mekalasi</td>
			<td>23008</td>
			<td>Table cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (Balb/c JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL/6JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>For histology samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-PE160-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance PLJ-C/PLJ-G</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>PLJ 600-3CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN044BX</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>For nucleic acid samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 100-1000 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 20-200 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Anaesthetic Key Filler</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Face Mask for Mouse</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO FM2200 Flowmeter</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Gas Exhaust Unit</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Induction Box</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO200VAP Vaporizer</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)

El cáncer es una de las enfermedades humanas más devastadoras. Los modelos experimentales de cáncer son importantes para obtener información sobre la compleja interacción de diferentes tipos de células y genes en la promoción de la progresión tumoral y para proporcionar una plataforma para probar la eficacia de diferentes enfoques terapéuticos. Uno de los modelos de cáncer inflamatorio experimental más comúnmente utilizados es el modelo de carcinogénesis cutánea de dos etapas DMBA-TPA. La formación de tumores se induce en este modelo mediante la aplicación tópica de dos productos químicos diferentes, 7,12-dimetilbenz[a]anthracene (DMBA) y 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA), que juntos papi causan la formación de causa en la piel. Como el resultado principal es la formación de papiloma en la piel, el modelo es una forma ideal, fiable y reproducible de abordar tanto la iniciación del tumor (supervivencia libre de tumores) como la progresión tumoral (número y tamaño de tumores visibles). Los efectos del tratamiento DMBA-TPA se transmiten a través de un mecanismo inflamatorio, lo que hace que este modelo sea especialmente adecuado para estudiar el papel del sistema inmunológico en la formación de tumores. Sin embargo, este modelo está restringido a la piel y otras superficies donde se pueden aplicar los productos químicos. En este artículo se proporciona un protocolo detallado para usar el modelo correctamente.

El resultado principal es el tiempo de supervivencia (es decir, libre de papiloma) entre el tratamiento o los grupos de genotipos. El resultado secundario es el número de papilomas por semana en cada grupo(Figura 2). Los resultados esperados son una diferencia estadísticamente significativa en el tiempo libre del papiloma y en el número de papilomas entre los grupos experimentales (dos o más). Se recomienda contar el número de papilomas y dibujar una curva durante la fase de promoción ...

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Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA

La carcinogénesis cutánea de dos etapas es inducida por dos productos químicos aplicados tópicamente. Un mutágeno 7,12-dimethylbenz[a]anthracene) causa mutaciones en las células epidérmicas y una aplicación continua del estimulador general del crecimiento 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate acelera la formación de papiloma de la piel.

Modelo de carcinogénesis de piel inducida por productos químicos utilizando Dimethylbenz[a]Anthracene y 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

Cancer is one of the most devastating human diseases. Experimental cancer models are important to gain insight into the complex interplay of different ...

Este modelo de cáncer de piel de dos pasos permite el estudio del papel de la inflamación en el cáncer de piel y permite el estudio de la iniciación del tumor como un proceso separado de la progresión tumoral. La formación tumoral en este modelo es inducida químicamente y permite el uso de cepas eliminatorias para estudiar los efectos de factores ambientales o candidatos terapéuticos. El modelo es adecuado para estudiar el papel del sistema inmunitario y la angiogénesis en el cáncer.Demuestra una patología de enfermedad similar al carcinoma de células escamosas en pacientes humanos. Aunque este método es relativamente fácil de llevar a cabo, la sincronización precisa es esencial. También es importante tomar las medidas de seguridad adecuadas al manipular DMBA, que es un carcinógeno.Antes de comenzar el experimento, alberga a cualquier ratón agresivo de siete a nueve semanas de edad en jaulas separadas para evitar peleas y lesiones en la piel. Para la inducción del papiloma de la piel, primero afeite las pieles de la espalda de los animales experimentales y pese los ratones individualmente. 48 horas después del afeitado, utilice una pipeta para aplicar 50 microgramos de DMBA en 200 microlitros de acetona en el área afeitada de cada ratón anestesiado.Para la promoción del papiloma de la piel, siete días después de la aplicación de DMBA tratar la piel con cinco microgramos de TPA en 200 microlitros de acetona dos veces a la semana hasta el final del experimento. Examine a los animales en busca de papilomas y fotografíes y registre el tamaño de cada papiloma individual en un mapa cada semana. Una masa palpable superior a un milímetro de diámetro se considera un papiloma si permanece más de una semana.Cuando la respuesta tumoral alcance una meseta, recoja el material de muestra apropiado de los animales 24 horas después de la última aplicación de TPA y recoja trozos de piel de espesor completo para el análisis inmunohistoquímico. Usa un punzón de biopsia para recolectar trozos de piel de muestras de piel de papiloma y no papiloma para la expresión génica o anaylses de proteínas y usa un bisturí para recolectar piezas de papiloma y piel no papilloma para el análisis inmunohistoquímico. A continuación, recoja los ganglios linfáticos que drenan la piel y una parte del bazo para el análisis citométrico de flujo como desee.Una diferencia estadísticamente significativa en el tiempo libre del papiloma y en el número de papilomas entre los grupos experimentales se observa típicamente en el modelo tumoral DMBA TPA. Los análisis histológicos son adecuados para estudiar la estructura de los papilomas, la morfología de la piel o la infiltración de células inmunitarias de interés. Es esencial aplicar el DMBA y el TPA uniformemente sobre la piel y aplicar TPA en intervalos constantes.También es importante contar los papilomas regularmente. Los mecanismos que afectan el número y la hora de la formación de tumores se pueden estudiar utilizando diferentes métodos, incluyendo inmunohistoquímica, citometría de flujo, PCR cuantitativo y análisis de proteínas. Esta técnica convencional se puede adaptar y aplicar fácilmente para estudiar los efectos de diferentes genes, factores ambientales o terapias de interés en la iniciación y progresión del tumor.Se requiere precaución al realizar la técnica ya que DMBA es cancerígeno y la acetona se evapora rápidamente. Se recomienda una máscara de respiración adecuada y el uso de gabinete de flujo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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