Name: chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)
Uploaded: 2019-12-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA at JoVE.com

Detta arbete finansierades av Finlands Akademi (bidrag 25013080481 och 25013142041 (I.J.), 286377 och 295814 (M.P.), 287907 (tj)), Päivikki och Sakari Sohlberg Foundation (M.P., tj), finska Medical Foundation (T.P.), den konkurrensutsatta statliga forskningen Finansiering av expert ansvarsområdet vid Tammerfors universitetssjukhus (Grant 9V049 och 9X044 (M.P.), 9X011 och 9V010 (tj)), den konkurrensutsatta statliga forskningsfinansieringen av expert ansvarsområdet i Fimlab Laboratories (Grant X51409 (I.J.)), Tays Support Foundation (I.J., M.P., tj), Tampere tuberculosis Foundation (I.J., M.P., tj), Finlands Kulturstiftelse (M.V.), Paulo Foundation (T.P.), Cancer Society of Finland (M.P.) och stiftelsen Emil Aaltonen (T.P.).

Det protokoll som beskrivs här har godkänts av Finlands nationella djur Etiknämnd (protokollnummer ESAVI/23659/2018).
1. försöksdjur, reagens och utrustning
<ol><li>Använd ålder och kön matchade möss. Starta studien vid 7 – 9 veckors ålder, eftersom huden i de flesta möss är i telogen (vilofasen) runt den åldern2.</li>
	<li>Observera beteendet hos djuren under studien och om de slåss, som ofta händer med hanar, hus dem separat. Slagsmål kan orsaka ne...

DMBA-TPA-inducerad hudcancer är en av de mest använda cancer modeller eftersom det är mycket reproducerbara och ger information om tumör progression från initiering till malignitet. Den viktigaste resultatmåttet, papillom formation, är lätt och tillförlitligt kvantitativ. Modellen behandlar både tumör initiering (tumör-fri överlevnad) och progression (tumör nummer och storlekar) samtidigt. Modellen lämpar sig för att studera olika föreningar, såsom potentiella Therapeutics, och effekterna av enskilda ge...

Cancer är en av de främsta dödsorsakerna i världen. Därför finns det en efterfrågan att utveckla pålitliga experimentella sjukdomsmodeller för att få en bättre förståelse av sjukdomen samt att utforska potentiella terapeutiska metoder. En av de mest använda experimentella in vivo-modellerna för att studera hudcancer utveckling är den kemiskt inducerade tvåstegs hud cancerogenesen Model1,2. Modellen ger ett verktyg för att studera tumör initiering, befordran, och progression utöver specifika händelser såsom immun cell infiltration och angiogenes.
För att använda två-stegs hud carcinogenes modell, ryggen huden på möss behandlas med två olika kemikalier som tillsammans inducera tumör bildning. Modellen inleds med en låg dos av mutagen, DMBA, följt av långvarig exponering för tumörpromotorn, TPA3 (figur 1). Dmba muterar DNA slumpmässigt genom att bilda kovalenta addukter med DNA från epidermala celler och primära keratinocyter stamceller4,5,6,7. Några av dessa slumpmässiga mutationer äger rum i en proto-Onkogene, såsom Hras1 (mutationer i kras och de nationella regleringsmyndigheterna upptäcks också) och omvandlingen av proto-onkogener till onkogener driver tumörbildningen under rätt stimuli. TPA, i sin tur, är den mest använda tumörtillväxt främjande agent. Dess molekylära mål är proteinkinas C (PKC)8. TPA aktiverar också WNT/β-catenin signalering som är avgörande för tumör bildning i modell9. Upprepad och långvarig exponering för att främja agenten leder till förbättrad cellsignalering, ökad produktion av tillväxtfaktorer, och en lokal inflammatorisk reaktion, som är uppenbara på grund av ökad DNA-syntes och inflammatorisk cell infiltration i den behandlade huden.
De viktigaste inflammatoriska mediatorerna i DMBA-TPA-modellen har identifierats10. Interleukin-17a (Il-17a) är känd för att vara särskilt tumorigen i dmba-TPA-modellen11,12. Det fungerar i samverkan med interleukin 6 (IL-6) och deltar i makrofagen och neutrofila rekrytering13,14. Dessutom, CD4+ T-celler och neutrofiler har visat sig vara tumörframkallande i dmba-TPA-modellen. Slutligen kan makrofager också främja uppkomst i modellen15,16,17.
Under främjande fasen, cell spridningen av muterade celler förstärks och en ihållande hyperplasi i epidermis upprätthålls1. Detta leder till papillom utveckling i huden i 10 – 20 veckor, varefter papillom börjar konvertera till maligna tumörer, skivepitelcancer cell karcinom (SCCS)2. Emellertid, mindre än 10% av papillom framsteg till malignitet, även om denna procentsats beror också på den genetiska bakgrunden av möss2,18. I årtionden var det inte känt vilken typ av celler var initialt muterade i tumörer som leder till malignitet, även om vissa studier hade rapporterat klart distinkta funktioner i maligna tumörer jämfört med benign papillom19,20. Emellertid, nyare studier har kraftigt ökat vår förståelse för det klonala ursprunget av tumör bildning i DMBA-TPA modell21. 22. 23. det visades att både benmärg-härledda epitelceller och hårfollikelstamceller bidrar till tumörbildningen22. Stage-specifika härstamning studier har avslöjat att godartade papillom är av monoklonal ursprung, men de rekrytera nya epitelceller populationer21,23. Men endast en av cell klonerna fungerar som en drivkraft för carcinogenes; den innehåller en HRAS-mutation23. Progressionen till carcinom bildas är förknippad med en klon svep23.
Cancerframkallande dmba initierar papillom bildandet och TPA främjar tumörtillväxt. Därför, tumören initiering kan studeras separat från befordran genom att avbryta experimentet innan TPA behandlingsperioden. Som tumörprogression studeras veckovis det erbjuder en stor möjlighet för detaljerad tumörtillväxt analys under hela studien. Eftersom tumörerna genereras av externa kemikalier, är en onkogen mutation i köns cells onödigt. Således, studera effekterna av en genetisk bakgrund (t. ex. knockout/Transgene vs Wild typ) på uppkomst är enkel2. Sammanfattningsvis är DMBA/TPA hudcancer modell en särskilt användbar metod för att studera rollen av immunförsvaret i tumörprogression samt för utvärderingen av tumör initiering och främjande steg självständigt eller beroende.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60445/60445fig1a.jpg"> Figur 1: DMBA-TPA-inducerad hud carcinogenes modell kontur. Det carcinogena DMBA appliceras lokalt för att inducera DNA-mutationer i inledningsskedet av modellen. Den tillväxtbefrämjande agent TPA administreras 2x en vecka för att öka cellproliferation under främjande fasen, vilket leder till utvecklingen av papillom i huden. Djur offras efter papillom svar når en platå, vanligtvis inom veckor 15 – 20, beroende på den genetiska bakgrunden av möss. En liten del av papillom kan vidareutvecklas till SCCs inom 20 – 50 veckor. För att studera tidiga händelser i inledningen och tidig befordran fas, prover kan samlas in (t. ex., strax efter den andra TPA ansökan). Ett representativt fotografi och hematoxylin och eosin färgade tvärsnitt av papillom på en C57BL/6 mus hud efter 19 veckors behandling visas. Scale bar = 0,1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60445/60445fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1730-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1180-9710-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3254-100MG</td>
			<td>Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000141011</td>
			<td>Evaporates rapidly and is inflammable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane vet 1000 mg/g</td>
			<td>Piramal Critical Care Limited</td>
			<td></td>
			<td>Liquid isoflurane for inhalation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery-Operated Clipper Isis</td>
			<td>Albert Kerlb GmbH</td>
			<td>GT421</td>
			<td>For shaving the fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONTRAfluran-Restgasfilter</td>
			<td>ZeoSys GmbH</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linex Nature N1030 Ruler 30 cm</td>
			<td>Staples Business Advantage</td>
			<td>60383</td>
			<td>For measuring papillomas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN045AR</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mekasoft</td>
			<td>Mekalasi</td>
			<td>23008</td>
			<td>Table cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (Balb/c JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL/6JRj)</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td></td>
			<td>Other strains also possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>For histology samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-PE160-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance PLJ-C/PLJ-G</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>PLJ 600-3CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing</td>
			<td>VetTech Solutions Ltd</td>
			<td>AN044BX</td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>For nucleic acid samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 100-1000 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacta pipette 20-200 ul</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-729060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Anaesthetic Key Filler</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Face Mask for Mouse</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO FM2200 Flowmeter</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Gas Exhaust Unit</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Induction Box</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO200VAP Vaporizer</td>
			<td>Scintica instrumentation inc.</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical-induced skin carcinogenesis model using dimethylbenz[a]anthracene and 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (dmba-tpa)

Cancer är en av de mest förödande mänskliga sjukdomarna. Experimentella cancer modeller är viktiga för att få insikt i det komplexa samspelet mellan olika celltyper och gener för att främja tumörprogression och för att tillhandahålla en plattform för att testa effekten av olika terapeutiska metoder. En av de mest använda experimentella inflammatoriska cancer modeller är DMBA-TPA två-stegs hud carcinogenes modell. Tumör bildning induceras i denna modell av topikal applicering av två olika kemikalier, 7, 12-dimetylbenz [a] antracen (DMBA) och 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetat (TPA), som tillsammans orsakar papillom bildas i huden. Eftersom det primära resultatet är papillom bildning i huden, modellen är en idealisk, pålitlig, och reproducerbara sätt att ta itu med både tumör initiering (tumör-fri överlevnad) och tumör progression (antal och storlek av synliga tumörer). Effekterna av DMBA-TPA-behandling överförs via en inflammatorisk mekanism, vilket gör denna modell särskilt lämplig för att studera immunsystemets roll i tumör bildning. Denna modell är dock begränsad till huden och andra ytor där kemikalierna kan appliceras på. Ett detaljerat protokoll finns i den här artikeln för att använda modellen med lyckat resultat.

Det huvudsakliga resultatet är överlevnad (dvs, papillom fri) tid mellan behandling eller genotyp grupper. Det sekundära utfallet är antalet papillom per vecka i varje grupp (figur 2). De förväntade resultaten är en statistiskt signifikant skillnad i papillom ledig tid och i antalet papillom mellan experimentella (två eller flera) grupper. Det rekommenderas att räkna antalet papillom och rita en kurva under befordran (TPA) fas för att få en uppfattning om skillnaderna mellan grupp...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA at JoVE.com

Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate DMBA-TPA

Två-stegs hud cancerogenesen induceras av två topikalt applicerade kemikalier. En mutagen 7, 12-dimetylbenz [a] antracen) orsakar mutationer i epidermala celler och en kontinuerlig tillämpning av allmän tillväxt stimulator 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetat accelererar hudpapillom formation.

Kemisk-inducerad hud carcinogenes modell med Dimetylbenz [a] antracen och 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-acetat (DMBA-TPA)

Cancer is one of the most devastating human diseases. Experimental cancer models are important to gain insight into the complex interplay of different ...

Denna två steg hudcancer modell möjliggör studiet av inflammationens roll i hudcancer och gör det möjligt för studien tumörinitiering som en separat process från tumörprogression. Tumörbildningen i denna modell är kemiskt inducerad och tillåter användning av knockout stammar att studera effekterna av miljöfaktorer eller terapeutiska kandidater. Modellen lämpar sig väl för att studera immunsystemets och angiogenes roll vid cancer.det visar en liknande sjukdom patologi till skivepitelcancer i mänskliga patienter. Även om denna metod är relativt lätt att genomföra, är korrekt timing viktigt. Det är också viktigt att vidta lämpliga säkerhetsåtgärder vid hantering av DMBA, som är cancerframkallande.Innan experimentet börjar, hus några aggressiva sju till nio veckor gamla möss i separata burar för att undvika striderna och hudskador. För hudpatillom induktion, först raka rygg skinn av försöksdjuren och väga mössen individuellt. 48 timmar efter rakning, använd en pipett för att applicera 50 mikrogram DMBA i 200 mikroliter aceton på det rakade området av varje sövd mus.För huden papillom främjande, sju dagar efter DMBA ansökan behandla huden med fem mikrogram TPA i 200 mikroliter aceton två gånger i veckan fram till slutet av experimentet. Undersök djuren för papillom och fotografera och registrera storleken på varje enskild papillom på en karta varje vecka. En påtaglig massa större än en millimeter i diameter anses vara en papillom om det förblir längre än en vecka.När tumören svar når en platå, skörda lämpligt provmaterial från djuren 24 timmar efter den sista TPA ansökan och insamling full tjocklek bitar av huden för immunohistochemical analys. Använd en biopsi punch att samla in hud bitar från papillom och icke-papillom hudprover för genuttryck och eller protein anaylses och använda en skalpell för att samla bitar från papillom och icke-papillom hud för immunohistokemisk analys. Samla sedan huden dränerande lymfkörtlar och en bit av mjälten för flöde cytometrisk analys som önskas.En statistiskt signifikant skillnad i papillom fri tid och i antalet papillom mellan de experimentella grupperna är vanligtvis observeras i DMBA TPA tumörmodellen. Histologiska analyser är lämpliga för att studera strukturen av papillom, morfologi i huden, eller infiltration av immunceller av intresse. Det är väsentligt att applicera DMBA och TPA jämnt på huden och att applicera TPA i jämna mellanrum.Det är också viktigt att räkna papillom regelbundet. De mekanismer som påverkar tumörbildningens antal och tid kan studeras med olika metoder, inklusive immunohistokemi, flödescytometri, kvantitativ PCR och proteinanalys. Denna konventionella teknik kan enkelt anpassas och tillämpas för att studera effekterna av olika gener, miljöfaktorer, eller therapeutics av intresse på tumör initiering och progression.Försiktighet krävs när du utför tekniken eftersom DMBA är cancerframkallande och aceton avdunstar snabbt. En lämplig andningsmask och användning av flödesskåp rekommenderas.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET och MRI guidad bestrålning av en Glioblastoma råtta modell med en mikro-irradiator

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

En 3D Organotypic melanom sfäroid hud modell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Viktiga endpoints och proliferativa markörer för att bedöma liten tarm skada och anpassning med hjälp av en musmodell av kemoterapi-inducerad mukosit

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radio känslighet av cancer stamceller i Lung cancer cellinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studera Triple negativ bröstcancer med ortopotopic bröstcancer modell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Använda Kyckling chorioallantoic Membrane In Vivo modell för att studera gynekologiska och urologiska cancerformer

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Använda datorbaserad bildanalys för att förbättra kvantifiering av lung metastasering i 4T1 Bröstcancermodellen

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Upptäckt av metastaserade regulatorer med hjälp av en snabb och kvantitativ intravital chick chorioallantoic membranmodell

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Tre differentialuttrycksanalysmetoder för RNA-sekvensering: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...