Name: fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations
Uploaded: 2020-05-31T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations at JoVE.com

وتود NTK أن تعترف بجوائز جامعة ميامي للأبحاث في العلوم الطبيعية والهندسة لتمويلها هذا البحث. BR تود أن تشكر أليكس وآن لاوترباخ لتمويل مختبر المناعة المقارنة والتطورية. تم دعم عمل BR من قبل أرقام مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF): 1416/19 و 2841/19، ومنحة أبحاث HFSP، RGY0085/2019. ونود أن نشكر زانا كوزهيكباييفا ومايك كونيلي على المساعدة التقنية. ونود أيضا أن نشكر جامعة ميامي، وكلية ميلر للطب تدفق الموارد المشتركة في مركز سيلفستر الشامل للسرطان للوصول إلى مقياس الخلايا FACS وشانون صايغ للدعم التقني.

1. تفكيك الأنسجة من الهيكل العظمي المرجاني عن طريق البخاخة والضاغط
ملاحظة: تنفيذ الخطوات على الجليد وحماية اليدين مع قفازات.
<ol><li>تجميع عدة البخاخة عن طريق ربط ضاغط الهواء، خرطوم، والبخاخة(الشكل 2). تعيين مقياس الضغط بين 276-483 كيلو باسكال. ملاحظة: الضاغط المو...

<ol>
	<li>Bellwood, D. R., Hughes, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional-scale+assembly+rules+and+biodiversity+of+coral+reefs.">Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs.</a> Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).</li><li>Ferrario, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effectiveness+of+coral+reefs+for+coastal+hazard+risk+reduction+and+adaptation.">The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation.</a> Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).</li><li>Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+microbial+community+associated+with+the+coral+Porites+astreoides.">Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides.</a> Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).</li><li>Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+stress+causes+host+cell+detachment+in+symbiotic+cnidarians:+implications+for+coral+bleaching.">Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching.</a> Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).</li><li>Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+infectious+diseases+really+killing+corals?+Alternative+interpretations+of+the+experimental+and+ecological+data.">Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).</li><li>Miller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+disease+following+massive+bleaching+in+2005+causes+60%+decline+in+coral+cover+on+reefs+in+the+US+Virgin+Islands.">Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands.</a> Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).</li><li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+reefs+under+rapid+climate+change+and+ocean+acidification.">Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification.</a> Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).</li><li>Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+zooxanthellae+in+the+thermal+tolerance+of+corals:+A+"nugget+of+hope"+for+coral+reefs+in+an+era+of+climate+change.">The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).</li><li>Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+causes+and+consequences+of+symbiont+shuffling+in+a+multi-partner+reef+coral+symbiosis+under+environmental+change.">Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).</li><li>Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy.">Anatomy.</a> Diseases of Coral. , 85-107 (2015).</li><li>Allemand, D., Tambutt&#233;, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutt&#233;, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+calcification,+cells+to+reefs.">Coral calcification, cells to reefs.</a> Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).</li><li>Rinkevich, B., Loya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Reproduction+of+the+Red+Sea+Coral+Stylophora+pistillata.+I.+Gonads+and+Planulae.">The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae.</a> Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).</li><li>Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corals+use+similar+immune+cells+and+wound-healing+processes+as+those+of+higher+organisms.">Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms.</a> PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).</li><li>Hayes, R. L., Bush, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+observations+of+recovery+in+the+reef-building+scleractinian+coral,+Montastrea+annularis,+after+bleaching+on+a+Cayman+reef.">Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef.</a> Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).</li><li>Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarian+Histology.">Cnidarian Histology.</a> Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).</li><li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals.">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).</li><li>Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+environmental+biology:+Cell+biology+informing+conservation.">Translational environmental biology: Cell biology informing conservation.</a> Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).</li><li>Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+cell+separation+and+isolation+by+fluorescence-activated+cell+sorting+(FACS).">Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).</li><li>Rosental, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+mammalian-like+haematopoietic+system+found+in+a+colonial+chordate.">Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate.</a> Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).</li><li>Silva-Lima, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Symbiodinium+Strains+Are+Hosted+by+the+Brazilian+Endemic+Corals+Mussismilia+spp.">Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp.</a> Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).</li><li>Yvan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+enumeration+of+bacterial+in+the+coral+surface+mucus+layer.">Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer.</a> Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).</li><li>Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching+response+of+Symbiodinium+(zooxanthellae):+Determination+by+flow+cytometry.">Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).</li><li>Baumgarten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+Aiptasia,+a+sea+anemone+model+for+coral+symbiosis.">The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).</li><li>Voolstra, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+genomes+of+Stylophora+pistillata+and+Acropora+digitifera+provides+evidence+for+extensive+differences+between+species+of+corals.">Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Pavlov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+control+of+tuna+fins:+A+role+for+the+lymphatic+system+in+vertebrate+locomotion.">Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion.</a> Science. 357 (6348), 310-314 (2017).</li></ol>

تم تكييف هذا البروتوكول من Rosental et al.18 وتم تطويره لتحديد وعزل خلايا P. damicornis. وتركز المنهجية على عملية تصفية العينات لإزالة الحطام والخلايا غير القابلة للحياة والخلايا المستضافة من قبل السيمبيدياسية من خلال فحص العوامل الجوهرية للخلية، بما في ذلك حجم الخلية النسبي، وحبيب?...

الشعاب المرجانية هي واحدة من أهم النظم الإيكولوجية على وجه الأرض. وهي تيسر التنوع البيولوجي من خلال توفير موائل حيوية للأسماك واللافقاريات، وهي حاسمة لاستدامة المجتمعات البشرية المنشأ عن طريق توفير الغذاء وسبل العيش الاقتصادية من خلال السياحة1. كباني رئيسي للشعاب المرجانية، والحيوان المرجاني (فيلوم: Cnidaria) يساعد أيضا المجتمعات الساحلية من خلال إنشاء أطر كربونات الكالسيوم الكبيرة التي تخفف من الأضرار الناجمة عن الموجة والعواصف2.
الشعاب المرجانية كبالغين هي الحيوانات sessile التي تستضيف مجموعة واسعة من الشركاء الإندوسيفي، بما في ذلك الفيروسات، archaea، البكتيريا، البروتيين، الفطريات، وأبرزها، أعضاء الأسرة اللادغالي dinoflagellate سيمبيدياسي3. يمكن أن تسبب التغيرات في البيئة اختلالات في هذا المجتمع، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى تفشي الأمراض وتبييض المرجان حيث يتم طرد السيمبيدياسية التكافلية من مستعمرة المرجان، وبالتالي القضاء على المصدر الرئيسي للتغذية للشعاب المرجانية. كل من هذه السيناريوهات غالبا ما يسبب وفاة المضيف المرجان4,5,6. وتؤدي آثار الضغوط اتّسبة من صنع الإنسان، مثل التغير المناخي السريع، إلى تسريع أحداث موت المرجان الجماعي، مما يؤدي إلى انخفاض عالمي في عدد الشعاب المرجانية7.
وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير العديد من الطرق المختلفة للمساعدة في التخفيف من فقدان الشعاب المرجانية. وتشمل هذه الأساليب زراعة الشعاب المرجانية على الشعاب المرجانية القائمة، والعبور الجيني باستخدام الأنماط الجينية المتسامحة حراريا، والتلاعب الخلوي بالمجتمعات الميكروبية والتكافلية المستضافة داخل المرجان8،,9. على الرغم من هذه الجهود، لا يزال الكثير غير معروف حول تنوع الخلايا المرجانية وظيفة الخلية10،11،12،13. من الضروري فهم شامل لتنوع نوع الخلايا المرجانية ووظيفة الخلية لفهم كيفية تعامل الكائن المرجاني في ظل ظروف معيارية ومرهقة. وستستفيد الجهود الرامية إلى تحقيق أقصى قدر من الكفاءة في الترميم والحفظ من تعزيز فهم كيفية اقتران تنوع الخلايا ووظيفة الجينات.
وقد ركز العمل السابق على تنوع الخلايا ووظيفتها في المقام الأول على الدراسات النسيجية والأنسجة الكاملة الحمض النووي الريبي أخذ العينات14،15،16،17. للحصول على مزيد من التفاصيل حول وظيفة نوع خلية محددة في الشعاب المرجانية ، يجب أن تكون هناك طرق لعزل مجموعات محددة من خلايا المرجان الحية. وقد تم ذلك بنجاح في الكائنات الحية النموذج غير الكلاسيكي عن طريق فرز الخلايا المنشطة فلورسينس (FACS) تدفق تكنولوجيا القياس الخلوي18. يستخدم FACS مزيجًا من الليزر الذي يتم ضبطه على أطوال موجية مختلفة لقياس الخصائص الخلوية الذاتية المختلفة على مستوى الخلية الواحدة مثل حجم الخلية النسبية وحبيبات الخلية والفلورسب. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم وضع علامة على الخلايا بواسطة مركبات تحمل علامة فلورية لقياس خصائص محددة ومطلوبة18،19.
حتى الآن، وتطبيق تدفق قياس الخلايا الخلايا المرجانية كان أساسا لتحليل سيمبيانياسيا تكافلي وغيرها من السكان البكتيرية من خلال الاستفادة من الفلور الفلورالطبيعية القوية20،21،22. كما استُخدم نظام مراقبة الشعاب المرجانية لتقدير حجم الجينوم المرجاني باستخدام إشارة علامة الحمض النووي الفلورية مقارنة بخلايا الكائنات الحية النموذجية المرجعية23،,24. ويوفر التطبيق الفعال للنظام الميداني للخلايا الدقيقة ثلاث أدوات متميزة مفيدة لدراسات بيولوجيا الخلايا: 1) الوصف المورفولوجي والوظيفي للخلايا المفردة؛ (2) الوصف الوظيفي والوظيفي للخلايا المفردة؛ (2) الوصف الوظيفي والوظيفي للخلايا المفردة؛ (2) الوصف الوظيفي والوظيفي للخلايا المفردة؛ (2) وصف وظيفي وعملي للخلايا المفردة؛ (2) وصف وظيفي وعملي للخلايا المفردة 2) تحديد وفصل وعزل مجموعات خلايا محددة لدراسات المصب؛ و 3) تحليل المقالات الوظيفية على مستوى الخلية الواحدة.
ولا يزال تطوير وتطبيق مختلف العلامات الفلورية الخارجية لدراسة الخلايا المرجانية غير مستكشفتقريبا. قد تتضمن هذه العلامات البروتينات الموسومة، أو ركائز الموسومة للإنزيمات، أو استجابات الفلورسنت للمركبات الأخرى. يمكن استخدام هذه العلامات لتحديد أنواع الخلايا التي لها خصائص فريدة، مثل تمييز الخلايا التي تنتج كميات مختلفة من ميزة مقصورة خلوية محددة، مثل الليسوسوماس. مثال إضافي هو استخدام الخرز المسمى الفلورسنت لتحديد وظيفيا الخلايا المختصة لبلع، أو ابتلاع مسببات الأمراض المستهدفة25. ويمكن بسهولة تحديد مجموعات الخلايا النشطة في استجابات المناعة من قبل FACS بعد ابتلاع هذه الخرز المطبقة خارجيًا. في حين تتطلب الطرق النسيجية التقليدية الأنسجة المحفوظة وساعات عديدة لتقريب النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لابتلاع النحل ، يمكن إجراء فحص وظيفي قائم على FACS لابتلاع مسببات الأمراض بسرعة نسبية على الخلايا الحية المعزولة. بالإضافة إلى دراسة الاستجابات الخاصة بالخلايا للإجهاد ، فإن هذه التكنولوجيا لديها القدرة على توضيح التعبير الخاص بالجينات وإلقاء الضوء على التاريخ التطوري والتنموي لأنواع الخلايا الفريدة تمامًا للcnidarians ، مثل الكاليكوبلاس والخلايا العصبية.
في الآونة الأخيرة، قمنا بإجراء فحص مكثف لأكثر من 30 علامة خلوية أسفرت عن تحديد 24 علامة قادرة على وضع علامات على الخلايا المرجانية، 16 منها مفيدة للتمييز بين السكان الفريدين18،مما يجعلها مجموعات من التمايز (CD). هنا نحن وصف عملية عزل الخلايا المرجانية في البوتشيبوروا داميكورنيس من إزالة الخلايا من الهيكل العظمي كربونات الكالسيوم إلى تحديد وعزل مجموعات خلايا محددة مع FACS(الشكل 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Airbrush Kit &#38; Compressor</td>
			<td>TCP Global</td>
			<td>ABD KIT-H-SET</td>
			<td>Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor &#38; Air Hose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Bulk Reef Supply</td>
			<td>205357</td>
			<td>Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10444</td>
			<td>2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection bag</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>38UV35</td>
			<td>Reloc Zippit 6&#34;L x 4&#34;W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-100ML</td>
			<td>Heat-inactivated at 57 &#176;C for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>pH 7.4; 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352063</td>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations

الشعاب المرجانية مهددة بسبب الضغوطات البشرية المنشأ. قد تحدث الاستجابة البيولوجية للشعاب المرجانية لهذه الضغوطات على المستوى الخلوي ، ولكن الآليات غير مفهومة بشكل جيد. للتحقيق في استجابة المرجان للضغوط، نحتاج إلى أدوات لتحليل الاستجابات الخلوية. على وجه الخصوص، نحن بحاجة إلى الأدوات التي تسهل تطبيق المقالات الوظيفية لفهم أفضل لكيفية تفاعل مجموعات الخلايا مع الإجهاد. في الدراسة الحالية، نستخدم فرز الخلايا المنشطة بالفلورسين (FACS) لعزل وفصل مجموعات الخلايا المختلفة في الشعاب المرجانية الحجرية. يتضمن هذا البروتوكول: (1) فصل أنسجة المرجان عن الهيكل العظمي، (2) إنشاء تعليق خلية واحدة، (3) وضع علامات على الخلايا المرجانية باستخدام علامات مختلفة للقياس الخلوي للتدفق، و(4) استراتيجيات الجاتوز وفرز الخلايا. ستمكن هذه الطريقة الباحثين من العمل على الشعاب المرجانية على المستوى الخلوي للتحليل والمقالات الوظيفية ودراسات التعبير الجيني لمجموعات الخلايا المختلفة.

وعموما، فإن هذا البروتوكول مفيد لأنه ييسر تحديد وجمع مجموعات الخلايا المرجانية الحية التي يمكن استخدامها في التحليلات الوظيفية. بدأ سير العمل مع الفصل الميكانيكي للأنسجة المرجانية من الهيكل العظمي كربونات الكالسيوم الأساسي(الشكل 1). هذه هي واحدة من أهم ?...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations at JoVE.com

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

وتخلق الشعاب المرجانية نظما إيكولوجية للتنوع البيولوجي هامة لكل من البشر والكائنات البحرية. ومع ذلك، ما زلنا لا نفهم الإمكانات الكاملة ووظيفة العديد من الخلايا المرجانية. هنا، نقدم بروتوكولاً تم تطويره لعزل ووسم وفصل مجموعات الخلايا المرجانية الحجرية.

فلورسينس تنشيط فرز الخلايا لعزل سكان الخلايا Scleractinian

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

وييسر هذا البروتوكول تحديد وعزل مجموعات الخلايا المرجانية الحية على مستوى وصفي لم يكن ممكنا من قبل. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالوصول إلى مستوى من خصوصية الخلية التي كانت حتى الآن غير قابلة للتحقيق في الغالب. وسوف يكون إثبات الإجراء الدكتور شانون سايغ، وهو باحث مشارك من تدفق المصدر المشترك استئصال الخلايا في مركز السرطان الشامل سيلفستر.لإعداد مقياس تدفق الخلايا الخلوية الحية لفرز الخلايا المرجانية، افتح قالب مشروع جديد في برنامج مقياس التدفق الخلوي وحدد الليزر المناسب للتحليل في لوحة الليزر. ثم، إنشاء الجانب مبعثر مقابل مؤامرة مبعثر إلى الأمام في المؤامرات المناسبة لإعداد استراتيجية الغات والتحليل. لتحليل تدفق الخلايا الخلوية وفرز الخلايا المرجانية الحية، تحميل عينة الخلية غير المطّوعة في غرفة العينة في مقياس الخلايا وبدء عملية القراءة.منذ الخلايا المرجانية هشة بشكل خاص، والحفاظ على ضغط مقياس الخلايا منخفضة لمنع تحلل الخلايا. في مؤامرة مبعثر، وضبط الجهد مضاعف الصورة إلى مركز النقاط والبدء في تسجيل الأحداث. في مؤامرة التشتت الأمامية مقابل الجانب، قم بإنشاء بوابة حول الخلايا في حوالي 10 إلى العلامة الرابعة على محور مبعثر إلى الأمام.استبدل عينة التحكم بالعينة الأولى من الخلايا الملطخة وسجل حوالي 10000 خلية قبل التوقف المؤقت. ثم بوابة الأحداث التي هي فريدة من نوعها لمجموعة عينة ملطخة. لفرز الخلايا المرجانية الحية، بعد اختيار السكان الخلية من الفائدة في برنامج تدفق مقياس الخلايا، ووضع أنبوب واحد microcentrifuge واحد يحتوي على 250 إلى 500 ميكرولترات من الحل جمع المناسبة في غرفة جمع مقياس الخلايا لكل مجموعة لفرز.مرة واحدة وقد مرت كمية مناسبة من الوقت لطرد الحطام، والبدء في فرز السكان المطلوب لجمع في أي مكان من 10،000 إلى عدة ملايين من الخلايا. في كل مرة يتم استخدام وصمة عار جديدة ، أو الأنواع ، أو الفرز ، وفرز ما لا يقل عن 2000 خلية من الاهتمام في 500 ميكرولترات من تلطيخ المتوسطة للسماح لفحص النقاء ليتم تنفيذها على السكان من الفائدة وإعادة تحلية الخلايا فرزها للتأكد من أن يتم قراءة الأحداث داخل البوابة المستخدمة في الفرز الأولي. للدراسات المختبرية، قم بتخزين الخلايا المخروزة على الجليد حتى يتم نقلها إلى حاضنة أو بيئة معقمة.لجلب الجزيئات غير الخلوية الأخرى التي لا تشترك في نفس الشكل أو التفاصيل مثل الخلايا المرجانية يمكن إزالتها من التحليل عن طريق إنشاء اختيار بوابة على رسمة مبعثرة إلى الأمام والجانب. يمكن استبعاد الخلايا الميتة بمقارنة إشارة DAPI من تعليق الخلايا غير الملطخة والملطخة باستخدام الرسم البياني والبوابات خارج الخلايا عالية التعبير عن DAPI. في موازاة ذلك، يمكن إزالة الخلايا التي تستضيف سيمبيوديناسيا autofluorescence عن طريق الغاء ضد الخلايا مع إشارة عالية في القناة الحمراء البعيدة.بعد عملية الغاء المتكررة هذه، تمثل الخلايا المتبقية مجموعات الخلايا المرجانية الحية سليمة تفتقر إلى symbiodeneasia. ويمكن بعد ذلك تصنيف هذه الخلايا إلى مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا عن طريق التلطيخ لملامح مثل نشاط أنواع الأكسجين التفاعلية و / أو محتوى الليسوسوم. من المهم أن نتذكر أن بعض الخلايا أكثر هشاشة من غيرها وتشغيل هذه العملية بعناية قدر الإمكان.مرة واحدة وقد تم عزل خلايا محددة، ويمكن استخدامها لمجرّفات وظيفية x-vivo مثل إنشاء ثقافات الخلية وخلق ملفات تعريف النسخ.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

العزلة وزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) التوسيم والفرز وبعد الإسفار خلية المنشط للتحديد ، ثقافة مستقلة عن العضوية الذائبة الكربون المهينة العوالق البكتيرية

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

قوية من الجيل الكبدية مثل خلايا الجنينية البشرية من السكان الخلايا الجذعية

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

تحليل خلية معينة من<em&gt; ل arabidopsis</em&gt; يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

دراسة التحلل البروتيني B من السيكلين على مستوى خلية واحدة في الجامعة السكان الخلية

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

عزل الخلايا الليفية عادي والسرطان يرتبط بها من الأنسجة الطازجة من الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

فرز<em&gt; المتسلسلة</em&gt; الكريات الخلية باستخدام كائن مجمع حدودي محلل وفارز

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...