Name: fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations
Uploaded: 2020-05-31T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations at JoVE.com

NTK wil de University of Miami Research Awards in Natural Sciences and Engineering erkennen voor de financiering van dit onderzoek. BR wil Alex en Ann Lauterbach bedanken voor de financiering van het Comparative and Evolutionary Immunology Laboratory. Het werk van BR werd ondersteund door Israel Science Foundation (ISF) nummers: 1416/19 en 2841/19, en HFSP Research Grant, RGY0085/2019. We willen Zhanna Kozhekbaeva en Mike Connelly bedanken voor de technische bijstand. We willen ook de Universiteit van Miami, Miller School of Medicine's Flow Cytometry Shared Resource bedanken in het Sylvester Comprehensive Cancer Center voor toegang tot de FACS cytometer en aan Shannon Saigh voor technische ondersteuning.

1. Dissociatie van weefsels van koraalskelet via airbrush en compressor
LET OP: Voer stappen uit op ijs en bescherm handen met handschoenen.
<ol><li>Monteer de airbrushkit door de luchtcompressor, slang en airbrush aan te sluiten(figuur 2). Stel de drukmeter in op 276−483 kPa. LET OP: De aanbevolen compressor en luchtslang die voor dit onderzoek werd gebruikt, was ingesteld op een maximale druk van 393 kPa. Gebruik buiten dit 276-483 kPa-bereik kan leiden t...

<ol>
	<li>Bellwood, D. R., Hughes, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional-scale+assembly+rules+and+biodiversity+of+coral+reefs.">Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs.</a> Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).</li><li>Ferrario, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effectiveness+of+coral+reefs+for+coastal+hazard+risk+reduction+and+adaptation.">The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation.</a> Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).</li><li>Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+microbial+community+associated+with+the+coral+Porites+astreoides.">Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides.</a> Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).</li><li>Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+stress+causes+host+cell+detachment+in+symbiotic+cnidarians:+implications+for+coral+bleaching.">Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching.</a> Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).</li><li>Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+infectious+diseases+really+killing+corals?+Alternative+interpretations+of+the+experimental+and+ecological+data.">Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).</li><li>Miller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+disease+following+massive+bleaching+in+2005+causes+60%+decline+in+coral+cover+on+reefs+in+the+US+Virgin+Islands.">Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands.</a> Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).</li><li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+reefs+under+rapid+climate+change+and+ocean+acidification.">Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification.</a> Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).</li><li>Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+zooxanthellae+in+the+thermal+tolerance+of+corals:+A+"nugget+of+hope"+for+coral+reefs+in+an+era+of+climate+change.">The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).</li><li>Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+causes+and+consequences+of+symbiont+shuffling+in+a+multi-partner+reef+coral+symbiosis+under+environmental+change.">Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).</li><li>Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy.">Anatomy.</a> Diseases of Coral. , 85-107 (2015).</li><li>Allemand, D., Tambutt&#233;, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutt&#233;, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+calcification,+cells+to+reefs.">Coral calcification, cells to reefs.</a> Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).</li><li>Rinkevich, B., Loya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Reproduction+of+the+Red+Sea+Coral+Stylophora+pistillata.+I.+Gonads+and+Planulae.">The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae.</a> Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).</li><li>Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corals+use+similar+immune+cells+and+wound-healing+processes+as+those+of+higher+organisms.">Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms.</a> PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).</li><li>Hayes, R. L., Bush, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+observations+of+recovery+in+the+reef-building+scleractinian+coral,+Montastrea+annularis,+after+bleaching+on+a+Cayman+reef.">Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef.</a> Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).</li><li>Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarian+Histology.">Cnidarian Histology.</a> Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).</li><li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals.">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).</li><li>Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+environmental+biology:+Cell+biology+informing+conservation.">Translational environmental biology: Cell biology informing conservation.</a> Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).</li><li>Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+cell+separation+and+isolation+by+fluorescence-activated+cell+sorting+(FACS).">Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).</li><li>Rosental, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+mammalian-like+haematopoietic+system+found+in+a+colonial+chordate.">Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate.</a> Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).</li><li>Silva-Lima, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Symbiodinium+Strains+Are+Hosted+by+the+Brazilian+Endemic+Corals+Mussismilia+spp.">Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp.</a> Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).</li><li>Yvan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+enumeration+of+bacterial+in+the+coral+surface+mucus+layer.">Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer.</a> Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).</li><li>Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching+response+of+Symbiodinium+(zooxanthellae):+Determination+by+flow+cytometry.">Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).</li><li>Baumgarten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+Aiptasia,+a+sea+anemone+model+for+coral+symbiosis.">The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).</li><li>Voolstra, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+genomes+of+Stylophora+pistillata+and+Acropora+digitifera+provides+evidence+for+extensive+differences+between+species+of+corals.">Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Pavlov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+control+of+tuna+fins:+A+role+for+the+lymphatic+system+in+vertebrate+locomotion.">Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion.</a> Science. 357 (6348), 310-314 (2017).</li></ol>

Dit protocol werd aangepast van Rosental et al.18 en ontwikkeld voor de identificatie en isolatie van P. damicornis cellen. De methodologie richt zich op het proces van filteren monsters om puin te verwijderen, niet-levensvatbare cellen, en Symbiodiniaceae gehoste cellen door het onderzoek van cel intrinsieke factoren, met inbegrip van relatieve celgrootte, relatieve cel granulariteit, cel autofluorescentie, en de aanwezigheid van intacte cellulaire membranen. Deze technieken kunnen worde...

Koraalriffen zijn een van de belangrijkste ecosystemen op aarde. Ze vergemakkelijken de biodiversiteit door het verstrekken van kritieke habitats voor vissen en ongewervelde dieren en zijn van cruciaal belang voor het behoud van antropogene gemeenschappen door het verstrekken van voedsel en economisch levensonderhoud door middel van toerisme1. Als de belangrijkste bouwer van koraalriffen, het koraal dier (Phylum: Cnidaria) helpt ook kustgemeenschappen door het creëren van grote calcium carbonaat kaders die golf en storm schade te verzachten2.
Koralen als volwassenen zijn sessile dieren die een breed scala van endosymbiotische partners, waaronder virussen, archaea, bacteriën, protisten, schimmels, en vooral, leden van de algen dinoflagellate familie Symbiodiniaceae3host . Veranderingen in het milieu kunnen leiden tot onevenwichtigheden in deze gemeenschap, vaak leidt tot ziekte-uitbraken en koraal bleken waarin de symbiotische Symbiodiniaceae worden verdreven uit de koraalkolonie, waardoor de belangrijkste bron van voeding voor het koraal wordt geëlimineerd. Beide scenario's veroorzaken vaak de dood van de koraalgastheer4,5,6. Effecten van antropogene geïnduceerde stressoren, zoals snelle klimaatverandering, versnellen de massa koraalsterfte, wat leidt tot een wereldwijde achteruitgang van koraalriffen7.
Onlangs zijn er veel verschillende methoden ontwikkeld om het verlies van koraalriffen te helpen beperken. Deze methoden omvattenoutplanting van koralen op bestaande riffen, genetische kruising met behulp van thermisch tolerante genotypen, en cellulaire manipulatie van de microbiële en symbiotische gemeenschappen gehost binnen het koraal8,9. Ondanks deze inspanningen blijft er veel onbekend over koraalceldiversiteit en celfunctie10,11,12,13. Een grondig begrip van koraalceltypediversiteit en celfunctie is noodzakelijk om te begrijpen hoe het koraalorganisme zich gedraagt onder normatieve en stressvolle omstandigheden. Inspanningen om de efficiëntie van herstel en behoud te maximaliseren, zullen profiteren van een beter begrip van de manier waarop celdiversiteit en genfunctie worden gekoppeld.
Eerdere werkzaamheden over celdiversiteit en -functie waren voornamelijk gericht op histologische studies en RNA-bemonstering met volledig weefsel14,15,16,17. Om meer details te verkrijgen over de specifieke celtypefunctie in koralen, moeten er methoden zijn voor de isolatie van specifieke populaties van levende koraalcellen. Dit is met succes gedaan in niet-klassische modelorganismen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsorting (FACS) flow cytomemetrietechnologie18. FACS maakt gebruik van een combinatie van lasers afgestemd op verschillende golflengten om verschillende endogene cellulaire eigenschappen te meten op het niveau van één cel, zoals relatieve celgrootte, cel granulariteit en autofluorescentie. Bovendien kunnen de cellen worden gemarkeerd door fluorescerende stoffen om specifieke, gewenste eigenschappen18,19te meten .
Tot nu toe is de toepassing van stromingscytometrie op koraalcellen voornamelijk bedoeld geweest voor de analyse van symbiotische Symbiodiniaceae en andere bacteriële populaties door gebruik te maken van hun sterke, natuurlijke autofluorescentie20,21,22. FACS is ook gebruikt om de grootte van het koraalgenoom te schatten door fluorescerend DNA-markersignaal te gebruiken in vergelijking met referentiemodelorganismecellen23,24. De efficiënte toepassing van FACS biedt drie verschillende instrumenten die nuttig zijn voor celbiologiestudies: 1) morfologische en functionele beschrijving van enkele cellen; 2) identificatie, scheiding en isolatie van specifieke celpopulaties voor downstreamstudies; en 3) de analyse van functionele testen op het niveau van één cel.
De ontwikkeling en toepassing van verschillende exogene fluorescerende markers voor de studie van koraalcellen blijft bijna onontgonnen. Dergelijke markers kunnen bestaan uit gelabelde eiwitten, gelabelde substraten voor enzymen of fluorescerende reacties op andere verbindingen. Deze markeringen kunnen worden gebruikt om celtypen te identificeren die unieke eigenschappen hebben, zoals het markeren van cellen die verschillende hoeveelheden van een specifieke cellulaire compartimentfunctie produceren, zoals lysosomen. Een bijkomend voorbeeld is het gebruik van fluorescerend gelabelde kralen om cellen die bevoegd zijn voor fagocytose of het overspoelen van een gerichte ziekteverwekker25functioneel te identificeren. Populaties van cellen die actief zijn in immuniteitsreacties kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door FACS na het overspoelen van deze exogene toegepaste kralen. Terwijl traditionele histologische methoden bewaard weefsel en vele uren nodig hebben om het percentage cellen positief te benaderen voor bead engulfment, kan een op FACS gebaseerde functionele test voor pathogene engulfment relatief snel worden uitgevoerd op geïsoleerde levende cellen. Naast het bestuderen van celspecifieke reacties op stress, heeft deze technologie het potentieel om genspecifieke expressie te verduidelijken en de evolutionaire en ontwikkelingsgeschiedenis van celtypen te verlichten die volledig uniek zijn voor cnidarians, zoals calicoblasten en cnidocyten.
Onlangs hebben we een intensieve screening uitgevoerd van meer dan 30 cellulaire markers die resulteerden in het identificeren van 24 die in staat zijn om koraalcellen te labelen, waarvan er 16 nuttig zijn voor het onderscheiden van uniekepopulaties 18, waardoor ze clusters van differentiatie (CD) zijn. Hier beschrijven we het proces van koraalcelisolatie in Pocillopora damicornis van het verwijderen van cellen uit het calciumcarbonaatskelet tot de identificatie en isolatie van specifieke celpopulaties met FACS (figuur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Airbrush Kit &#38; Compressor</td>
			<td>TCP Global</td>
			<td>ABD KIT-H-SET</td>
			<td>Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor &#38; Air Hose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Bulk Reef Supply</td>
			<td>205357</td>
			<td>Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10444</td>
			<td>2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection bag</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>38UV35</td>
			<td>Reloc Zippit 6&#34;L x 4&#34;W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-100ML</td>
			<td>Heat-inactivated at 57 &#176;C for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>pH 7.4; 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352063</td>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations

Koraalriffen worden bedreigd als gevolg van antropogene stressoren. De biologische reactie van koraal op deze stressoren kan op cellulair niveau optreden, maar de mechanismen zijn niet goed begrepen. Om de reactie van koraal op stressoren te onderzoeken, hebben we tools nodig voor het analyseren van cellulaire reacties. We hebben met name instrumenten nodig die de toepassing van functionele tests vergemakkelijken om beter te begrijpen hoe celpopulaties reageren op stress. In de huidige studie gebruiken we fluorescentie-geactiveerde celsordening (FACS) om verschillende celpopulaties in steenachtige koralen te isoleren en te scheiden. Dit protocol omvat: (1) de scheiding van koraalweefsels van het skelet, (2) het creëren van een eencellige suspensie, (3) het labelen van de koraalcellen met behulp van verschillende markers voor stroomcytometrie, en (4) gating en celsorling strategieën. Deze methode zal onderzoekers in staat stellen om te werken aan koralen op cellulair niveau voor analyse, functionele testen, en genexpressie studies van verschillende celpopulaties.

Over het algemeen is dit protocol nuttig omdat het de identificatie en verzameling van levende koraalcelpopulaties vergemakkelijkt die kunnen worden gebruikt voor functionele analyses. De workflow begon met de mechanische scheiding van koraalweefsels van het onderliggende calciumcarbonaatskelet(figuur 1). Dit is een van de belangrijkste eerste stappen, omdat onjuiste techniek resulteert in een hoge celsterfte en kan leiden tot grote hoeveelheden puin. Enzymat...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations at JoVE.com

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Koralen creëren biodiverse ecosystemen die belangrijk zijn voor zowel mensen als mariene organismen. We begrijpen echter nog steeds niet het volledige potentieel en de functie van veel koraalcellen. Hier presenteren we een protocol ontwikkeld voor de isolatie, etikettering en scheiding van steenachtige koraalcelpopulaties.

Fluorescentie-geactiveerde celsorde voor de isolatie van scleractinische celpopulaties

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Dit protocol vergemakkelijkt de identificatie en isolatie van levende koraalcelpopulaties op een beschrijvingsniveau dat voorheen niet mogelijk was. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het toegang geeft tot een niveau van celspecificiteit dat tot nu toe meestal onbereikbaar was. Het aantonen van de procedure zal Dr.Shannon Saigh, een onderzoeksmedewerker van de stroom cytometrie gedeelde bron op de Sylvester Comprehensive Cancer Center.Als u de stroomcytometer wilt instellen voor het sorteren van levende koraalcellen, opent u een nieuwe projectsjabloon in de stroomcytometersoftware en selecteert u de juiste lasers voor de analyse in het laserpaneel. Maak vervolgens een side scatter versus forward scatter plot in de juiste plots voor het opzetten van de gating en analyse strategie. Voor de stromingscytometrische analyse en het sorteren van de levende koraalcellen, laad het controle-niet-gekleurde celmonster in de monsterkamer van de cytometer en start u het leesproces.Aangezien koraalcellen bijzonder kwetsbaar zijn, houdt u de cytometerdruk laag om cellyse te voorkomen. Pas in de spreidingsplot de spanning van de fotomultiplier aan om de punten te centreren en begin met het registreren van de gebeurtenissen. In de voorwaartse versus zijverstrooiingsplot, maak een poort rond de cellen rond de 10 tot de 4e markering op de voorwaartse scatter x-as.Vervang het controlemonster door het eerste monster van gekleurde cellen en neem ongeveer 10.000 cellen op voordat u pauzeert. Bek je vervolgens over de gebeurtenissen die uniek zijn voor de gekleurde steekproefgroep. Om levende koraalcellen te sorteren, plaats na het selecteren van de celpopulatie van belang in de stroomcytometersoftware één microcentrifugebuis met 250 tot 500 microliters van de juiste inzamelingsoplossing in de cytometer-verzamelkamer voor elke te sorteren populatie.Zodra een geschikte hoeveelheid tijd is verstreken om puin weg te spoelen, beginnen met het sorteren van de gewenste populatie om overal te verzamelen van 10.000 tot enkele miljoenen cellen. Elke keer dat een nieuwe vlek, soort of sorteerder wordt gebruikt, sorteren ten minste 20,000 cellen van belang in 500 microliters van kleuring medium om een zuiverheidscontrole uit te voeren op de populatie van belang en reanalyze de gesorteerde cellen om te bevestigen dat de gebeurtenissen worden gelezen binnen de poort gebruikt voor de eerste sortering. Voor in vitro studies, bewaar de gesorteerde cellen op ijs totdat ze worden overgebracht naar een incubator of gesteriliseerde omgeving.Om andere niet-cellulaire deeltjes binnen te brengen die niet dezelfde vorm of granulariteit delen als de koraalcellen, kunnen ze uit de analyse worden verwijderd door een poortselectie te maken op een voorwaartse en zijverstrooiingsplot. De dode cellen kunnen worden uitgesloten door het dapi-signaal van de onbevlekte en gekleurde celsuspensies te vergelijken met behulp van een histogram en het uit elkaar halen van de hoge DAPI-uitdrukkende cellen. Tegelijkertijd kunnen cellen die autofluorescentie symbiodeneasia hosten worden verwijderd door tegen cellen met het hoge signaal in het verre rode kanaal te gating.Na dit iteratieve gatingproces vertegenwoordigen de resterende cellen de intacte levende koraalcelpopulaties die symbiodeneasia missen. Deze cellen kunnen vervolgens worden ingedeeld in verschillende celsubpopulaties door vlekken op kenmerken zoals reactieve zuurstofsoorten activiteit en / of lysosoom gehalte. Het is van cruciaal belang om te onthouden dat sommige cellen kwetsbaarder zijn dan andere en om dit proces zo zorgvuldig mogelijk uit te voeren.Zodra specifieke cellen zijn geïsoleerd, kunnen ze worden gebruikt voor x-vivo functionele tests, zoals het vaststellen van celculturen en het maken van transcriptomische profielen.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolatie en transplantatie van hematopoietische stamcellen (HSC)

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Broomdeoxyuridine (BrdU) etikettering en Latere Fluorescentie Activated Cell Sorting voor cultuur-onafhankelijke Identificatie van opgeloste organische koolstof-afbrekende bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten van verse weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorteren van<em&gt; Streptomyces</em&gt; Cel Pellets behulp van een complex object Parametric Analyzer en Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...