Name: fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations
Uploaded: 2020-05-31T12:30:00
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NTK tient à remercier l’Université de Miami Research Awards en sciences naturelles et en génie pour le financement de cette recherche. BR tient à remercier Alex et Ann Lauterbach d’avoir financé le Laboratoire d’immunologie comparative et évolutive. Les travaux de BR ont été soutenus par les numéros de la Fondation scientifique israélienne (FSI) : 1416/19 et 2841/19, et HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Nous tenons à remercier Zhanna Kozhekbaeva et Mike Connelly pour leur assistance technique. Nous tenons également à remercier l’Université de Miami, Miller School of Medicine’s Flow Cytometry Shared Resource au Sylvester Comprehensive Cancer Center pour l’accès au cytomètre FACS et à Shannon Saigh pour le soutien technique.

1. Dissociation des tissus du squelette de corail par aérographe et compresseur
REMARQUE : Effectuez des marches sur la glace et protégez les mains avec des gants.
<ol><li>Assembler le kit d’aérographe en connectant le compresseur d’air, le tuyau et l’aérographe(figure 2). Réglez la jauge de pression entre 276 et 483 kPa. REMARQUE : Le compresseur et le tuyau d’air recommandés pour cette étude ont été prédéfinis à une pression maximale de ...

<ol>
	<li>Bellwood, D. R., Hughes, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional-scale+assembly+rules+and+biodiversity+of+coral+reefs.">Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs.</a> Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).</li><li>Ferrario, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effectiveness+of+coral+reefs+for+coastal+hazard+risk+reduction+and+adaptation.">The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation.</a> Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).</li><li>Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+microbial+community+associated+with+the+coral+Porites+astreoides.">Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides.</a> Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).</li><li>Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+stress+causes+host+cell+detachment+in+symbiotic+cnidarians:+implications+for+coral+bleaching.">Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching.</a> Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).</li><li>Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+infectious+diseases+really+killing+corals?+Alternative+interpretations+of+the+experimental+and+ecological+data.">Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).</li><li>Miller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+disease+following+massive+bleaching+in+2005+causes+60%+decline+in+coral+cover+on+reefs+in+the+US+Virgin+Islands.">Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands.</a> Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).</li><li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+reefs+under+rapid+climate+change+and+ocean+acidification.">Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification.</a> Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).</li><li>Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+genomes+of+Stylophora+pistillata+and+Acropora+digitifera+provides+evidence+for+extensive+differences+between+species+of+corals.">Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Pavlov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+control+of+tuna+fins:+A+role+for+the+lymphatic+system+in+vertebrate+locomotion.">Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion.</a> Science. 357 (6348), 310-314 (2017).</li></ol>

Ce protocole a été adapté de Rosental et coll.18 et développé pour l’identification et l’isolement des cellules de P. damicornis. La méthodologie se concentre sur le processus de filtrage des échantillons pour enlever les débris, les cellules non viables, et les cellules hébergées par Symbiodiniaceae par l’examen de facteurs intrinsèques cellulaires, y compris la taille relative des cellules, la granularité des cellules relatives, l’autofluorescence cellulaire, et la p...

Les récifs coralliens sont l’un des écosystèmes les plus importants sur Terre. Ils facilitent la biodiversité en fournissant des habitats essentiels pour les poissons et les invertébrés et sont essentiels pour soutenir les communautés anthropiques en fournissant des moyens de subsistance alimentaires et économiques grâce au tourisme1. En tant que principal constructeur de récifs coralliens, l’animal corallien (Phylum: Cnidaria) aide également les communautés côtières en créant de grands cadres de carbonate de calcium qui atténuent les dommages causés par les vagues et les tempêtes2.
Les coraux à l’âge adulte sont des animaux sessiles qui accueillent un large éventail de partenaires endosymbiotiques, y compris les virus, l’archaea, les bactéries, les protistes, les champignons, et plus particulièrement, les membres de la famille algale dinoflage Symbiodiniaceae3. Les changements dans l’environnement peuvent causer des déséquilibres dans cette communauté, entraînant souvent des épidémies et le blanchiment des coraux dans lesquels les Symbiodiniaceae symbiotiques sont expulsés de la colonie de corail, éliminant ainsi la principale source de nutrition pour le corail. Ces deux scénarios causent souvent la mort de l’hôte corallien4,5,6. Les effets des facteurs de stress induits par l’anththénie, tels que le changement climatique rapide, accélèrent les décès massifs de coraux, ce qui entraîne un déclin mondial des récifs coralliens7.
Récemment, de nombreuses méthodes différentes ont été développées pour aider à atténuer la perte de récifs coralliens. Ces méthodes comprennent l’aménagement de coraux sur les récifs existants, la traversée génétique à l’aide de génotypes tolérants thermiquement, et la manipulation cellulaire des communautés microbiennes et symbiotiques hébergées dans le corail8,9. Malgré ces efforts, beaucoup reste inconnu sur la diversité des cellules coralliennes et la fonction cellulaire10,11,12,13. Une compréhension approfondie de la diversité de type de cellules coralliennes et de la fonction cellulaire est nécessaire pour comprendre comment l’organisme corallien se comporte dans des conditions normatives et stressantes. Les efforts visant à maximiser l’efficacité de la restauration et de la préservation bénéficieront d’une meilleure compréhension de la façon dont la diversité cellulaire et le fonctionnement des gènes sont couplés.
Les travaux antérieurs sur la diversité et la fonction cellulaires ont principalement porté sur les études histologiques et l’échantillonnage de l’ARN de tissu entier14,15,16,17. Pour obtenir plus de détails sur la fonction spécifique de type cellulaire dans les coraux, il doit y avoir des méthodes pour l’isolement de populations spécifiques de cellules coralliennes vivantes. Ceci a été fait avec succès dans les organismes modèles non classiques au moyen de la technologie de cytométrie de débit activée par fluorescence (FACS)18. FACS utilise une combinaison de lasers réglés à différentes longueurs d’onde pour mesurer différentes propriétés cellulaires endogènes au niveau de la cellule unique comme la taille relative des cellules, la granularité cellulaire et l’autofluorescence. En outre, les cellules peuvent être marquées par des composés étiquetés fluorescents pour mesurer les propriétés spécifiques et souhaitées18,19.
Jusqu’à présent, l’application de la cytométrie des débits aux cellules coralliennes a été principalement pour l’analyse de Symbiodiniaceae symbiotique et d’autres populations bactériennes en utilisant leur forte, autofluorescence naturelle20,21,22. FACS a également été utilisé pour estimer la taille du génome corallien en utilisant le signal fluorescent marqueur d’ADN par rapport aux cellules d’organisme modèle de référence23,24. L’application efficace du FACS fournit trois outils distincts qui sont utiles pour les études de biologie cellulaire : 1) la description morphologique et fonctionnelle des cellules simples ; 2) l’identification, la séparation et l’isolement de populations cellulaires spécifiques pour des études en aval; et 3) l’analyse des tests fonctionnels au niveau de la cellule unique.
Le développement et l’application de divers marqueurs fluorescents exogènes pour l’étude des cellules coralliennes restent presque inexplorés. Ces marqueurs peuvent inclure des protéines étiquetées, des substrats marqués pour les enzymes ou des réponses fluorescentes à d’autres composés. Ces marqueurs peuvent être utilisés pour identifier les types de cellules qui ont des propriétés uniques, telles que la mise en évidence des cellules qui produisent des quantités variables d’une fonction spécifique compartiment cellulaire, comme les lysosomes. Un autre exemple est l’utilisation de perles étiquetées fluorescentes pour identifier fonctionnellement les cellules compétentes pour la phagocytose, ou l’engloutissement d’un agent pathogène ciblé25. Les populations de cellules actives dans les réponses immunitaires peuvent être facilement identifiées par FACS après l’engloutissement de ces perles exogènement appliquées. Tandis que les méthodes histologiques traditionnelles exigent le tissu préservé et beaucoup d’heures pour approximativer le pourcentage de cellules positives pour l’engloutissement de perle, un essai fonctionnel de FACS pour l’engloutissement d’agent pathogène peut être exécuté relativement rapidement sur des cellules vivantes isolées. En plus d’étudier les réponses spécifiques aux cellules au stress, cette technologie a le potentiel de clarifier l’expression spécifique aux gènes et d’éclairer l’histoire évolutive et développementale des types cellulaires entièrement uniques aux cnidarians, tels que les calicoblastes et les cnidocytes.
Récemment, nous avons effectué un dépistage intensif de plus de 30 marqueurs cellulaires qui ont abouti à l’identification de 24 qui sont capables d’étiqueter les cellules coralliennes, dont 16 sont utiles pour distinguer les populations uniques18, ce qui en fait des grappes de différenciation (CD). Ici, nous décrivons le processus d’isolement des cellules coralliennes dans pocillopora damicornis de l’enlèvement des cellules du squelette de carbonate de calcium à l’identification et l’isolement de populations cellulaires spécifiques avec FACS (figure 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Airbrush Kit &#38; Compressor</td>
			<td>TCP Global</td>
			<td>ABD KIT-H-SET</td>
			<td>Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor &#38; Air Hose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Bulk Reef Supply</td>
			<td>205357</td>
			<td>Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10444</td>
			<td>2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection bag</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>38UV35</td>
			<td>Reloc Zippit 6&#34;L x 4&#34;W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-100ML</td>
			<td>Heat-inactivated at 57 &#176;C for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>pH 7.4; 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352063</td>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations

Les récifs coralliens sont menacés en raison de facteurs de stress anthropiques. La réponse biologique du corail à ces facteurs de stress peut se produire au niveau cellulaire, mais les mécanismes ne sont pas bien compris. Pour étudier la réponse des coraux aux facteurs de stress, nous avons besoin d’outils pour analyser les réponses cellulaires. En particulier, nous avons besoin d’outils qui facilitent l’application d’essais fonctionnels pour mieux comprendre comment les populations cellulaires réagissent au stress. Dans la présente étude, nous utilisons le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) pour isoler et séparer différentes populations cellulaires dans les coraux pierreux. Ce protocole comprend : (1) la séparation des tissus coralliens du squelette, (2) la création d’une suspension à cellule unique, (3) l’étiquetage des cellules coralliennes à l’aide de divers marqueurs pour la cytométrie des débits, et (4) les stratégies de gating et de tri cellulaire. Cette méthode permettra aux chercheurs de travailler sur les coraux au niveau cellulaire pour l’analyse, les essais fonctionnels et les études d’expression génique de différentes populations cellulaires.

Dans l’ensemble, ce protocole est utile parce qu’il facilite l’identification et la collecte des populations vivantes de cellules coralliennes qui peuvent être utilisées pour des analyses fonctionnelles. Le flux de travail a commencé avec la séparation mécanique des tissus coralliens du squelette sous-jacent de carbonate de calcium(figure 1). Il s’agit de l’une des étapes initiales les plus importantes parce que la technique incorrecte entraî...

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Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Les coraux créent des écosystèmes de biodiversèses importants pour les humains et les organismes marins. Cependant, nous ne comprenons toujours pas le plein potentiel et la fonction de nombreuses cellules coralliennes. Ici, nous présentons un protocole développé pour l’isolement, l’étiquetage et la séparation des populations de cellules coralliennes pierreuses.

Tri cellulaire activée par fluorescence pour l’isolement des populations de cellules sclérosiennes

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Ce protocole facilite l’identification et l’isolement des populations vivantes de cellules coralliennes à un niveau descriptionnel qui n’était pas possible auparavant. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’accès à un niveau de spécificité cellulaire jusqu’à présent pour la plupart inaccessible. La Dre Shannon Saigh, associée de recherche à la ressource partagée de cytométrie de débit au Sylvester Comprehensive Cancer Center, démontrera la procédure.Pour configurer le cytomètre d’écoulement pour le tri vivant des cellules coralliennes, ouvrez un nouveau modèle de projet dans le logiciel de cytomètre à flux et sélectionnez les lasers appropriés pour l’analyse dans le panneau laser. Ensuite, créez une parcelle de dispersion latérale par rapport à une parcelle de dispersion vers l’avant dans les parcelles appropriées pour la mise en place de la stratégie de gating et d’analyse. Pour l’analyse cytométrique de flux et le tri des cellules coralliennes vivantes, chargez l’échantillon de cellules non tachées de contrôle dans la chambre d’échantillon du cytomètre et commencez le processus de lecture.Comme les cellules coralliennes sont particulièrement fragiles, maintenez la pression du cytomètre basse pour prévenir la lyse cellulaire. Dans l’intrigue scatter, réglez la tension multiplicatrice photo pour centrer les points et commencer à enregistrer les événements. Dans la parcelle de dispersion avant contre côté, créez une porte autour des cellules autour de la 10 à la 4ème marque sur l’axe x de dispersion vers l’avant.Remplacez l’échantillon de contrôle par le premier échantillon de cellules tachées et enregistrez environ 10 000 cellules avant de faire une pause. Ensuite, portez les événements qui sont uniques au groupe d’échantillons tachés. Pour trier les cellules coralliennes vivantes, après avoir sélectionné la population cellulaire d’intérêt pour le logiciel de cytomètre à flux, placez un tube de microcentrifugeuse contenant de 250 à 500 microlitres de la solution de collecte appropriée dans la chambre de collecte des cytomètres pour que chaque population trie.Une fois qu’un temps approprié s’est écoulé pour éliminer les débris, commencez à trier la population désirée pour recueillir entre 10 000 et plusieurs millions de cellules. Chaque fois qu’une nouvelle tache, espèce ou trieur est utilisé, triez au moins 20 000 cellules d’intérêt en 500 microlitres de milieu de coloration pour permettre un contrôle de pureté sur la population d’intérêt et réanalysez les cellules triées pour confirmer que les événements sont lus à l’intérieur de la porte utilisée pour le tri initial. Pour les études in vitro, stockez les cellules triées sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient transférées dans un incubateur ou un environnement stérilisé.Pour apporter d’autres particules non cellulaires qui ne partagent pas la même forme ou granularité que les cellules coralliennes peuvent être retirés de l’analyse en créant une sélection de porte sur une parcelle de dispersion avant et latérale. Les cellules mortes peuvent être exclues en comparant le signal DAPI des suspensions cellulaires non tachées et tachées à l’aide d’un histogramme et en tachant les cellules à haut taux d’expression dapi. En parallèle, les cellules hébergeant la symbioseasia d’autofluorescence peuvent être enlevées en gating contre des cellules avec le signal élevé dans le canal rouge lointain.Après ce processus itératif de gating, les cellules restantes représentent les populations vivantes intactes de cellules coralliennes manquant de symbioseasia. Ces cellules peuvent ensuite être classées en différentes sous-populations cellulaires en soudant des caractéristiques telles que l’activité réactive des espèces d’oxygène et/ou la teneur en lysosome. Il est essentiel de se rappeler que certaines cellules sont plus fragiles que d’autres et d’exécuter ce processus aussi soigneusement que possible.Une fois que des cellules spécifiques ont été isolées, elles peuvent être utilisées pour des analyses fonctionnelles x-vivo telles que l’établissement de cultures cellulaires et la création de profils transcriptomiques.

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JoVE Journal

Biology

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L&#39;isolement et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH)

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Biologie

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Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodésoxyuridine (BrdU) l&#39;étiquetage et ultérieures de tri cellulaire activé par fluorescence de la culture indépendante Identification de carbone organique dissous dégradants bactérioplancton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Analyse cellulaire spécifique de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

L&#39;étude de la protéolyse de la cycline B au niveau de la cellule unique dans les populations de cellules entières

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolation des fibroblastes normales et cancéreuses associées à partir de tissus frais par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Tri des<em&gt; Streptomyces</em&gt; culots cellulaires à l&#39;aide d&#39;un objet complexe paramétrique Analyzer et trieuse

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolement des vaisseaux sanguins dérivés multipotentes précurseurs du muscle squelettique humain

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...