Name: fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations
Uploaded: 2020-05-31T12:30:00
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NTK möchte die University of Miami Research Awards in Natural Sciences and Engineering für die Finanzierung dieser Forschung würdigen. Der BR dankt Alex und Ann Lauterbach für die Finanzierung des Comparative and Evolutionary Immunology Laboratory. Die Arbeit des BR wurde von der Israel Science Foundation (ISF) Unterstützt: 1416/19 und 2841/19, und HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Wir danken Zhanna Kozhekbaeva und Mike Connelly für die technische Unterstützung. Wir möchten uns auch bei der University of Miami, der Flow Cytometry Shared Resource der Miller School of Medicine am Sylvester Comprehensive Cancer Center für den Zugang zum FACS-Zytometer und Shannon Saigh für technische Unterstützung bedanken.

1. Trennung von Geweben vom Korallenskelett über Airbrush und Kompressor
HINWEIS: Führen Sie Schritte auf Eis aus und schützen Sie die Hände mit Handschuhen.
<ol><li>Montieren Sie den Airbrush-Kit, indem Sie den Luftkompressor, den Schlauch und die Airbrush anschließen (Abbildung 2). Stellen Sie das Manometer zwischen 276-483 kPa ein. HINWEIS: Der empfohlene Kompressor und Luftschlauch, der für diese Studie verwendet wurde, wurde auf einen maximalen Dru...

<ol>
	<li>Bellwood, D. R., Hughes, T. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+genomes+of+Stylophora+pistillata+and+Acropora+digitifera+provides+evidence+for+extensive+differences+between+species+of+corals.">Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Pavlov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+control+of+tuna+fins:+A+role+for+the+lymphatic+system+in+vertebrate+locomotion.">Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion.</a> Science. 357 (6348), 310-314 (2017).</li></ol>

Dieses Protokoll wurde von Rosental et al.18 adaptiert und zur Identifizierung und Isolierung von P. damicornis Zellen entwickelt. Die Methodik konzentriert sich auf den Prozess der Filterung von Proben, um Trümmer, nicht lebensfähige Zellen und Symbiodiniaceae-gehostete Zellen durch die Untersuchung von zellinintrinen Faktoren, einschließlich der relativen Zellgröße, der relativen Zellgranularität, der Zellautofluoreszenz und des Vorhandenseins intakter Zellmembranen, zu entfernen....

Korallenriffe sind eines der wichtigsten Ökosysteme der Erde. Sie erleichtern die biologische Vielfalt, indem sie kritische Lebensräume für Fische und wirbellose Tiere schaffen, und sind von entscheidender Bedeutung für die Erhaltung anthropogener Gemeinschaften durch die Bereitstellung von Nahrungsmitteln und wirtschaftlicher Existenzgrundlage durch Den Tourismus1. Als wichtiger Erbauer von Korallenriffen unterstützt das Korallentier (Phylum: Cnidaria) auch Küstengemeinden, indem es große Kalziumkarbonatgerüste schafft, die Wellen- und Sturmschäden mildern2.
Korallen als Erwachsene sind sessile Tiere, die eine breite Palette von endosymbiotischen Partnern beherbergen, einschließlich Viren, Archaeen, Bakterien, Protisten, Pilze, und vor allem, Mitglieder der Algendinoflagellate Familie Symbiodiniaceae3. Veränderungen in der Umwelt können zu Ungleichgewichten in dieser Gemeinschaft führen, die oft zu Krankheitsausbrüchen und Korallenbleiche führen, bei denen die symbiotischen Symbiodiniaceae aus der Korallenkolonie vertrieben werden, wodurch die Hauptnahrungsquelle für die Korallen beseitigt wird. Beide Szenarien führen oft zum Tod des Korallenwirts4,5,6. Die Auswirkungen anthropogen-induzierter Stressoren, wie der schnelle Klimawandel, beschleunigen die Massensterben von Korallen, was zu einem globalen Rückgang der Korallenriffe führt7.
In jüngster Zeit wurden viele verschiedene Methoden entwickelt, um den Verlust von Korallenriffen zu mildern. Diese Methoden umfassen die Auspflanzung von Korallen auf bestehenden Riffen, genetische Kreuzung enthäute Genotypen und zelluläre Manipulation der mikrobiellen und symbiotischen Gemeinschaften, die innerhalb derKorallen8,9gehostet werden. Trotz dieser Bemühungen, viel bleibt unbekannt über Korallenzellvielfalt und Zellfunktion10,11,12,13. Ein gründliches Verständnis der Vielfalt und Zellfunktion von Korallenzellen ist notwendig, um zu verstehen, wie sich der Korallenorganismus unter normativen und stressigen Bedingungen verhält. Die Bemühungen, die Wiederherstellungs- und Konservierungseffizienz zu maximieren, werden von einem verbesserten Verständnis der Kopplung von Zellvielfalt und Genfunktion profitieren.
Frühere Arbeiten über Zellvielfalt und Funktion konzentrierten sich in erster Linie auf histologische Studien und Ganzgewebe-RNA-Sampling14,15,16,17. Um mehr Details über die spezifische Zelltypfunktion in Korallen zu erhalten, muss es Methoden für die Isolierung bestimmter Populationen lebender Korallenzellen geben. Dies wurde bei nichtklassischen Modellorganismen mit Hilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortiertechnologie (FACS) erfolgreich durchgeführt18. FACS verwendet eine Kombination von Lasern, die auf unterschiedliche Wellenlängen abgestimmt sind, um verschiedene endogene zelluläre Eigenschaften auf Einzelzellebene zu messen, wie z. B. relative Zellgröße, Zellgranularität und Autofluoreszenz. Zusätzlich können die Zellen durch fluoreszierend markierte Verbindungen gekennzeichnet werden, um spezifische, gewünschte Eigenschaften18,19zu messen.
Bisher war die Anwendung der Durchflusszytometrie auf Korallenzellen hauptsächlich für die Analyse symbiotischer Symbiodiniaceae und anderer Bakterienpopulationen unter Verwendung ihrer starken, natürlichen Autofluoreszenz20,21,22. FACS wurde auch verwendet, um die Größe des Korallengenoms zu schätzen, indem das fluoreszierende DNA-Markersignal im Vergleich zu den Zellen des Referenzmodellorganismus23,24verwendet wurde. Die effiziente Anwendung von FACS bietet drei verschiedene Werkzeuge, die für zellbiologische Studien nützlich sind: 1) morphologische und funktionelle Beschreibung einzelner Zellen; 2) Identifizierung, Trennung und Isolierung spezifischer Zellpopulationen für nachgelagerte Studien; und 3) die Analyse von funktionellen Assays auf Einzelzellebene.
Die Entwicklung und Anwendung verschiedener exogener Fluoreszenzmarker für die Untersuchung von Korallenzellen bleibt nahezu unerforscht. Solche Marker können markierte Proteine, markierte Substrate für Enzyme oder fluoreszierende Reaktionen auf andere Verbindungen umfassen. Diese Marker können verwendet werden, um Zelltypen zu identifizieren, die eindeutige Eigenschaften aufweisen, z. B. das Hervorheben von Zellen, die unterschiedliche Mengen eines bestimmten Zellkompartiment-Features erzeugen, z. B. Lysosomen. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von fluoreszierend gekennzeichneten Perlen zur funktionellen Identifizierung von Zellen, die für die Phagozytose zuständig sind, oder die Verschleierung eines gezielten Erregers25. Populationen von Zellen, die in Immunitätsreaktionen aktiv sind, können von FACS leicht identifiziert werden, nachdem diese exogen aufgetragenen Perlen verschlungen wurden. Während traditionelle histologische Methoden konserviertes Gewebe und viele Stunden benötigen, um den Prozentsatz der Zellen, die positiv für die Perlenverschlangen sind, anzunähern, kann ein FACS-basierter funktioneller Test für die Pathogeneinschließung relativ schnell an isolierten lebenden Zellen durchgeführt werden. Neben der Untersuchung zellspezifischer Reaktionen auf Stress hat diese Technologie das Potenzial, die genspezifische Expression zu klären und die Evolutions- und Entwicklungsgeschichte von Zelltypen zu beleuchten, die für Cnidarier völlig einzigartig sind, wie Calicoblasten und Cnidozyten.
Kürzlich führten wir ein intensives Screening von über 30 zellulären Markern durch, das zur Identifizierung von 24, die Korallenzellen kennzeichnen können, führte, von denen 16 nützlich sind, um einzigartige Populationen18zu unterscheiden, was sie zu Differenzierungsclustern (CD) macht. Hier beschreiben wir den Prozess der Korallenzellisolierung in Pocillopora damicornis von der Entfernung von Zellen aus dem Calciumcarbonat-Skelett bis zur Identifizierung und Isolierung spezifischer Zellpopulationen mit FACS (Abbildung 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Airbrush Kit &#38; Compressor</td>
			<td>TCP Global</td>
			<td>ABD KIT-H-SET</td>
			<td>Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor &#38; Air Hose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Bulk Reef Supply</td>
			<td>205357</td>
			<td>Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10444</td>
			<td>2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection bag</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>38UV35</td>
			<td>Reloc Zippit 6&#34;L x 4&#34;W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-100ML</td>
			<td>Heat-inactivated at 57 &#176;C for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>pH 7.4; 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352063</td>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations

Korallenriffe sind durch anthropogene Stressoren bedroht. Die biologische Reaktion der Korallen auf diese Stressoren kann auf zellulärer Ebene auftreten, aber die Mechanismen sind nicht gut verstanden. Um die Reaktion von Korallen auf Stressoren zu untersuchen, benötigen wir Werkzeuge zur Analyse zellulärer Reaktionen. Insbesondere brauchen wir Werkzeuge, die die Anwendung von funktionellen Assays erleichtern, um besser zu verstehen, wie Zellpopulationen auf Stress reagieren. In der aktuellen Studie verwenden wir fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um verschiedene Zellpopulationen in Steinkorallen zu isolieren und zu trennen. Dieses Protokoll umfasst: (1) die Trennung von Korallengeweben vom Skelett, (2) die Schaffung einer Einzelzellsuspension, (3) die Kennzeichnung der Korallenzellen mit verschiedenen Markern für die Durchflusszytometrie sowie (4) Gating- und Zellsortierstrategien. Diese Methode wird es Forschern ermöglichen, auf zellulärer Ebene an Korallen für Analysen, funktionelle Assays und Genexpressionsstudien verschiedener Zellpopulationen zu arbeiten.

Insgesamt ist dieses Protokoll nützlich, da es die Identifizierung und Sammlung von lebenden Korallenzellpopulationen erleichtert, die für funktionelle Analysen verwendet werden können. Der Arbeitsablauf begann mit der mechanischen Trennung von Korallengeweben vom darunter liegenden Calciumcarbonatskelett (Abbildung 1). Dies ist einer der wichtigsten ersten Schritte, da unsachgemäße Technik zu einer hohen Zellsterblichkeit führt und große Mengen an Sch...

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Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Korallen schaffen biodiverse Ökosysteme, die sowohl für Den Menschen als auch für Meeresorganismen wichtig sind. Allerdings verstehen wir immer noch nicht das volle Potenzial und die Funktion vieler Korallenzellen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung, Kennzeichnung und Trennung von Steinkorallenzellpopulationen vor.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Dieses Protokoll erleichtert die Identifizierung und Isolierung lebender Korallenzellpopulationen auf einer Beschreibungsebene, die bisher nicht möglich war. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie den Zugriff auf eine Ebene der Zellspezifität ermöglicht, die bisher meist unerreichbar war. Demonstriert wird das Verfahren von Dr. Shannon Saigh, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter der gemeinsam genutzten Ressource der Durchflusszytometrie am Sylvester Comprehensive Cancer Center.Um das Durchflusszytometer für die Sortierung von lebenden Korallenzellen einzurichten, öffnen Sie eine neue Projektvorlage in der Durchflusszytometer-Software und wählen Sie die entsprechenden Laser für die Analyse im Laserpanel aus. Erstellen Sie dann ein Seitenstreuungs- oder Vorwärtsstreudiagramm in den entsprechenden Plots zum Einrichten der Gating- und Analysestrategie. Für die zytometrische Analyse und Sortierung der lebenden Korallenzellen laden Sie die Kontrollzelle unbefleckte Zellprobe in die Probenkammer des Zytometers und starten Sie den Lesevorgang.Da Korallenzellen besonders zerbrechlich sind, halten Sie den Zytometerdruck niedrig, um eine Zelllyse zu verhindern. Passen Sie im Streudiagramm die Fotomultiplikatorspannung an, um die Punkte zu zentrieren, und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Ereignisse. Erstellen Sie im nach vorne gegen seitlichen Streudiagramm ein Tor um die Zellen um die 10 bis 4. Markierung auf der vorwärts streuenden x-Achse.Ersetzen Sie die Kontrollprobe durch die erste Probe von gebeizten Zellen, und zeichnen Sie vor dem Anhalten etwa 10 000 Zellen auf. Dann richten Sie die Ereignisse, die für die befleckte Probengruppe einzigartig sind. Um lebende Korallenzellen zu sortieren, legen Sie nach der Auswahl der Zellpopulation, die für die Durchflusszytometer-Software von Interesse ist, ein Mikrozentrifugenrohr mit 250 bis 500 Mikrolitern der entsprechenden Sammellösung in die Zytometer-Sammlungskammer für jede zu sortierende Population.Sobald eine angemessene Zeit vergangen ist, um Schutt auszuspülen, beginnen Sie mit der Sortierung der gewünschten Population, um irgendwo von 10.000 bis mehrere Millionen Zellen zu sammeln. Jedes Mal, wenn ein neuer Fleck, eine neue Art oder ein Sortierer verwendet wird, sortieren Sie mindestens 20.000 von Interesse sindde Zellen in 500 Mikroliter Färbemedium, damit eine Reinheitsprüfung auf der Interessenpopulation durchgeführt werden kann, und analysieren Sie die sortierten Zellen neu, um zu bestätigen, dass die Ereignisse innerhalb des Für die anfängliche Sortierung verwendeten Tores gelesen werden. Für In-vitro-Studien lagern Sie die sortierten Zellen auf Eis, bis sie in einen Inkubator oder eine sterilisierte Umgebung übertragen werden.Um andere nichtzelluläre Partikel einzubauen, die nicht die gleiche Form oder Granularität wie die Korallenzellen haben, können Sie aus der Analyse entfernt werden, indem eine Torauswahl auf einem vorwärts- und seitlichen Streudiagramm erstellt wird. Die abgestorbenen Zellen können ausgeschlossen werden, indem das DAPI-Signal der ungefärbten und gefärbten Zellsuspensionen mit einem Histogramm verglichen und die hohen DAPI-exemitten Zellen ausgegoben werden. Parallel dazu können Zellen, die Autofluoreszenzsymbiodenesie ausrichten, durch Gating gegen Zellen mit dem hohen Signal im weit roten Kanal entfernt werden.Nach diesem iterativen Gating-Prozess stellen die verbleibenden Zellen die intakten lebenden Korallenzellpopulationen ohne Symbiodenasie dar. Diese Zellen können dann in verschiedene Zellsubpopulationen eingeteilt werden, indem Sie Merkmale wie die Aktivität reaktiver Sauerstoffspezies und/oder den Lysomgehalt färben. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass einige Zellen zerbrechlicher sind als andere, und diesen Prozess so sorgfältig wie möglich durchzuführen.Sobald bestimmte Zellen isoliert wurden, können sie für x-vivo-Funktionstests wie das Aufstellen von Zellkulturen und das Erstellen von transkriptomischen Profilen verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Forschung

Biologie

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling und anschließende Fluorescence Activated Cell Sorting für Kultur-unabhängige Identifizierung von gelöstem organischem Kohlenstoff abbauenden Bakterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Zellspezifische Analyse<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blätter mit Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sortierung der<em&gt; Streptomyces</em&gt; Zell Pellets mit einem komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...