Name: fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations
Uploaded: 2020-05-31T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations at JoVE.com

NTK מעוניין להכיר בפרסי המחקר של אוניברסיטת מיאמי במדעי הטבע והנדסה למימון מחקר זה. BR רוצה להודות לאלכס ואן נשקף על מימון המעבדה השוואתית והאבולוציונית לאימונולוגיה. עבודתו של BR נתמכת על ידי מספרי הקרן הלאומית למדע: 1416/19 ו-2841/19, ו-HFSP מלגת מחקר, RGY0085/2019. אנחנו רוצים להודות לזחנה קוז'קאבה ולמייק קונלי לסיוע טכני. היינו גם רוצים להודות לאוניברסיטת מיאמי, בית הספר מילר של זרימה cy, מחלקת הרפואה של משאבים משותפים במרכז הסרטן סילבסטר מקיף לקבלת גישה לציטוטוטר FACS ו שאנון סאין לתמיכה טכנית.

1. דיסוציאציה של רקמות משלד אלמוג דרך airbrush ו מדחס
הערה: בצע צעדים על הקרח והגן על הידיים עם כפפות.
<ol><li>להרכיב את ערכת airbrush על ידי חיבור מדחס אוויר, צינור, מברשת אוויר (איור 2). הפעילו את מד הלחץ בין 276 ל-483 kPa. הערה: המדחס וצינור האוויר המומלצים המשמשים למחקר זה ה?...

<ol>
	<li>Bellwood, D. R., Hughes, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional-scale+assembly+rules+and+biodiversity+of+coral+reefs.">Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs.</a> Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).</li><li>Ferrario, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effectiveness+of+coral+reefs+for+coastal+hazard+risk+reduction+and+adaptation.">The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation.</a> Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).</li><li>Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+microbial+community+associated+with+the+coral+Porites+astreoides.">Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides.</a> Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).</li><li>Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+stress+causes+host+cell+detachment+in+symbiotic+cnidarians:+implications+for+coral+bleaching.">Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching.</a> Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).</li><li>Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+infectious+diseases+really+killing+corals?+Alternative+interpretations+of+the+experimental+and+ecological+data.">Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).</li><li>Miller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+disease+following+massive+bleaching+in+2005+causes+60%+decline+in+coral+cover+on+reefs+in+the+US+Virgin+Islands.">Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands.</a> Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).</li><li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+reefs+under+rapid+climate+change+and+ocean+acidification.">Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification.</a> Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).</li><li>Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+zooxanthellae+in+the+thermal+tolerance+of+corals:+A+"nugget+of+hope"+for+coral+reefs+in+an+era+of+climate+change.">The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).</li><li>Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+causes+and+consequences+of+symbiont+shuffling+in+a+multi-partner+reef+coral+symbiosis+under+environmental+change.">Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).</li><li>Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy.">Anatomy.</a> Diseases of Coral. , 85-107 (2015).</li><li>Allemand, D., Tambutt&#233;, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutt&#233;, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+calcification,+cells+to+reefs.">Coral calcification, cells to reefs.</a> Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).</li><li>Rinkevich, B., Loya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Reproduction+of+the+Red+Sea+Coral+Stylophora+pistillata.+I.+Gonads+and+Planulae.">The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae.</a> Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).</li><li>Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corals+use+similar+immune+cells+and+wound-healing+processes+as+those+of+higher+organisms.">Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms.</a> PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).</li><li>Hayes, R. L., Bush, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+observations+of+recovery+in+the+reef-building+scleractinian+coral,+Montastrea+annularis,+after+bleaching+on+a+Cayman+reef.">Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef.</a> Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).</li><li>Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarian+Histology.">Cnidarian Histology.</a> Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).</li><li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals.">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).</li><li>Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+environmental+biology:+Cell+biology+informing+conservation.">Translational environmental biology: Cell biology informing conservation.</a> Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).</li><li>Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+cell+separation+and+isolation+by+fluorescence-activated+cell+sorting+(FACS).">Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).</li><li>Rosental, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+mammalian-like+haematopoietic+system+found+in+a+colonial+chordate.">Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate.</a> Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).</li><li>Silva-Lima, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Symbiodinium+Strains+Are+Hosted+by+the+Brazilian+Endemic+Corals+Mussismilia+spp.">Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp.</a> Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).</li><li>Yvan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+enumeration+of+bacterial+in+the+coral+surface+mucus+layer.">Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer.</a> Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).</li><li>Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching+response+of+Symbiodinium+(zooxanthellae):+Determination+by+flow+cytometry.">Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).</li><li>Baumgarten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+Aiptasia,+a+sea+anemone+model+for+coral+symbiosis.">The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).</li><li>Voolstra, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+genomes+of+Stylophora+pistillata+and+Acropora+digitifera+provides+evidence+for+extensive+differences+between+species+of+corals.">Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Pavlov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+control+of+tuna+fins:+A+role+for+the+lymphatic+system+in+vertebrate+locomotion.">Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion.</a> Science. 357 (6348), 310-314 (2017).</li></ol>

פרוטוקול זה הותאם מרוסנטל ואח 'בן 18 והתפתח לזיהוי ולבידוד של התאים המדמוליים . המתודולוגיה מתמקדת בתהליך של סינון דגימות כדי להסיר פסולת, תאים שאינם קיימא, ו-Symbiodiniaceae תאים מתארחים באמצעות בחינת גורמים פנימיים תא, כולל גודל תא יחסי, צפיפות תא יחסי, התאים האוטומטיים של התא, ו...

שוניות אלמוגים הן אחת. האקולוגיות החשובות בעולם הם מאפשרים ביולוגי על ידי מתן בתי גידול קריטיים לדגים וחסרי חוליות והם חיוניים לקיום קהילות אנתרופוגניים על ידי מתן מזון ופרנסה כלכלית באמצעות התיירות1. כמו בונה המפתח של שוניות אלמוגים, בעלי חיים אלמוג (Phylum: Cנדבך) גם מסייע לקהילות החוף על ידי יצירת מסגרות סידן פחמתי גדול ההקלת הנזק גל וסערה2.
אלמוגים כמו מבוגרים הם בעלי חיים sessile המארחים מגוון רחב של שותפים אנדוסימביוזה, כולל וירוסים, ארכאונים, חיידקים, protists פטריות, ובעיקר, חברים של פריחת אצות dinoflagellate משפחה Symbiodiniaceae3. שינויים בסביבה יכולים לגרום לחוסר איזון בקהילה זו, המובילה לעתים קרובות להתפרצויות של מחלות והלבנת אלמוגים שבה מגורשים הSymbiodiniaceae הסימביוטיים ממושבת האלמוגים, ובכך מבטלים את המקור העיקרי של תזונה לאלמוגים. שני תרחישים אלה לעתים קרובות לגרום למוות של מארח האלמוג4,5,6. השפעות אנתרופוגניים המושרה, כגון שינוי האקלים המהיר, הם האצת אירועי מוות של קורל המוני, המוביל לירידה גלובלית של שוניות האלמוגים7.
לאחרונה, הרבה שיטות שונות פיתחנו לסייע בהפחתת אובדן שונית האלמוגים. שיטות אלה כולל שתילת אלמוגים על שוניות קיימות, מעבר גנטי באמצעות גנוטיפים עמידים בפני חום, ותפעול הסלולר של החיידקים וקהילות סימביוטי אירח בתוך האלמוג8,9. למרות המאמצים הללו, הרבה נשאר לא ידוע על הגיוון תא אלמוגים ותפקוד התא10,11,12,13. הבנה יסודית של סוג תא אלמוגים מגוון ותפקוד התא הוא הכרחי כדי להבין כיצד האורגניזם האלמוג מתנהג בתנאים נורמטיביים ומלחיצים. המאמצים כדי למקסם את יעילות השיקום והשימור ייהנו מהבנה משופרת של איך תאים גיוון ותפקוד גנטי מצמידים.
העבודה הקודמת על תא גיוון ותפקוד התמקד בעיקר במחקרים היסטלוגיים ו-RNA רקמות שלמות בדגימה14,15,16,17. כדי לקבל פרטים רבים יותר על פונקציית סוג תא מסוימת באלמוגים, יש להיות שיטות לבידוד של אוכלוסיות מסוימות של תאי אלמוגים חיים. זה נעשה בהצלחה באורגניזמים שאינם קלאסיים מודל באמצעות מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) זרם cy, לנסות הטכנולוגיה18. FACS מנצל שילוב של לייזרים מכוונים אורכי גל משתנים כדי למדוד תכונות הסלולר שונים ברמת תא בודד כגון גודל התא היחסי, צפיפות התא, ו-פלואורסצנטית אוטומטי. בנוסף, התאים עשויים להיות מסומנים על-ידי התרכובות המסומנות באמצעות פלואורוסקופים כדי למדוד מאפיינים ספציפיים ורצויים18,19.
עד כה, היישום של הזרמת cy, לתאי אלמוגים הייתה בעיקר לניתוח של שיתופי Symbiodiniaceae ואוכלוסיות בקטריאלי אחרות על ידי ניצול חזק, טבעי שלהם האוטוקטנטית20,21,22. Facs יש גם שימש כדי להעריך את גודל הגנום אלמוג באמצעות אות ה-DNA הפלורסנט סמן לעומתהתייחסות מודלאורגניזם תאים23,24. היישום היעיל של FACS מספק שלושה כלים ברורים השימושיים עבור לימודי ביולוגיה של התא: 1) תיאור מורפולוגיים ופונקציונלי של תאים בודדים; 2) זיהוי, הפרדה ובידוד של אוכלוסיות תאים ספציפיות עבור לימודי במורד הזרם; ו-3) ניתוח ההסכמה הפונקציונלית במפלס התא הבודד.
פיתוח ויישום של סמני פלורסנט שונים לחקר התאים האלמוגים נשאר כמעט נחקרו. סמנים כאלה עשויים לכלול חלבונים מתויגים, מתויג מצעים עבור אנזימים, או תגובות פלורסנט לתרכובות אחרות. ניתן להשתמש בסמנים אלה כדי לזהות סוגי תאים בעלי מאפיינים ייחודיים, כגון הדגשת תאים המייצרים כמויות שונות של תכונה מסוימת של תא תאי, כמו ליסוזומים. דוגמה נוספת היא השימוש בחרוזים בעלי תוויות פלואורוסקופים כדי לזהות מבחינה פונקציונלית תאים המוסמכים עבור phagocyציטוזה, או הבשלה של הפתוגן ממוקד25. אוכלוסיות של תאים הפעילים בתגובות חסינות ניתן לזהות בקלות על ידי FACS לאחר שתבלע את החרוזים האלה להחיל באופן שלאחר. בעוד שיטות היסטולוגית מסורתיות דורשות רקמה שנשמרה ושעות רבות כדי לקירוב אחוז התאים חיובי עבור חרוז השחב, מבוסס FACS מבוססי פונקציונליות תפקודית עבור הפתוגן שתבלע ניתן לבצע במהירות יחסית על תאים חיים מבודדים. בנוסף ללימוד תגובות התאים הספציפיים ללחץ, טכנולוגיה זו יש פוטנציאל להבהיר ביטוי גנטי ספציפי ולהאיר את ההיסטוריה ההתפתחותית של סוגי תאים ייחודיים לחלוטין לקטענים, כגון calicoblasts חזיק ו cnidocציטים.
לאחרונה, ביצעו הקרנה אינטנסיבית של מעל 30 סמנים סלולריים שגרמו לזיהוי 24 כי הם מסוגלים לתייג תאים אלמוג, 16 מהם שימושיים להבחנה בין אוכלוסיות ייחודיות18, מה שהופך אותם אשכולות של בידול (CD). כאן אנו מתארים את התהליך של בידוד תא אלמוגים ב Pocillopora damicornis מהסרת תאים משלד סידן פחמתי לזיהוי ובידוד של אוכלוסיות תאים ספציפיות עם facs (איור 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Airbrush Kit &#38; Compressor</td>
			<td>TCP Global</td>
			<td>ABD KIT-H-SET</td>
			<td>Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor &#38; Air Hose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Bulk Reef Supply</td>
			<td>205357</td>
			<td>Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10444</td>
			<td>2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection bag</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>38UV35</td>
			<td>Reloc Zippit 6&#34;L x 4&#34;W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-100ML</td>
			<td>Heat-inactivated at 57 &#176;C for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>pH 7.4; 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352063</td>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations

שוניות אלמוגים נמצאות תחת איום. עקב אנתרופוגניים שתוקפים התגובה הביולוגית של האלמוג לאותם לחצים עלולה להתרחש ברמה התאית, אך המנגנונים אינם מובנים היטב. כדי לחקור את תגובת האלמוגים לתוקפים, אנו זקוקים לכלים לניתוח תגובות סלולריות. במיוחד, אנחנו צריכים כלים המאפשרים את היישום של מוסר פונקציונלי להבין טוב יותר כיצד אוכלוסיות תאים מגיבים ללחץ. במחקר הנוכחי, אנו משתמשים במיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) כדי לבודד ולהפריד אוכלוסיות תאים שונות באלמוגים אבן. פרוטוקול זה כולל: (1) הפרדת רקמות האלמוגים מן השלד, (2) היצירה של השעיית תא יחיד, (3) תיוג התאים האלמוגים באמצעות סמנים שונים עבור הזרמת cy, ו (4) מיון ואסטרטגיות המיון תאים. שיטה זו תאפשר לחוקרים לעבוד על אלמוגים ברמה התאית לניתוח, משפט פונקציונלי, ולימודי גנים של אוכלוסיות תאים שונות.

באופן כללי, פרוטוקול זה שימושי משום שהוא מסייע לזיהוי ולאיסוף של אוכלוסיות של תאי אלמוגים חיים שניתן להשתמש בהן לניתוחים פונקציונליים. זרימת העבודה החלה עם הפרדה מכנית של רקמות אלמוגים מן השלד סידן פחמתי הבסיסית (איור 1). זהו אחד השלבים הראשוניים החשובים ?...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations at JoVE.com

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

האלמוגים יוצרים מערכות אקולוגיות ביושונות החשובות הן לבני אדם והן לאורגניזמים ימיים. עם זאת, אנו עדיין לא מבינים את מלוא הפוטנציאל והתפקוד של תאי אלמוגים רבים. כאן אנו מציגים פרוטוקול שפותח עבור הבידוד, התיוג וההפרדה של אוכלוסיות של תאי אלמוגים מאבן.

תא מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית לבידוד של אוכלוסיות תאים בלובן המין

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

פרוטוקול זה מאפשר זיהוי ובידוד של אוכלוסיות תאי אלמוגים חיים ברמה תיאורית שלא הייתה אפשרית קודם לכן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת גישה לרמה של ספציפיות תאים שעד כה הייתה ברובה בלתי ניתנת להשגה. הדגמת ההליך תהיה ד"ר שאנון סיי, עמיתת מחקר מהמשאב המשותף של ציטומטריית הזרימה במרכז הסרטן המקיף סילבסטר.כדי להגדיר את ציטומטר הזרימה למיון תאי אלמוגים חיים, פתח תבנית פרוייקט חדשה בתוכנת ציטומטר הזרימה ובחר את הלייזרים המתאימים לניתוח בלוח הלייזר. לאחר מכן, צור פיזור צדדי לעומת חלקת פיזור קדימה בחלקות המתאימות לקביעת אסטרטגיית הגתה והניתוח. לצורך ניתוח ציטומטרי זרימה ומיון של תאי האלמוגים החיים, טען את דגימת התאים שאינם נגועים בתא הדגימה של הציטומטר והתחל את תהליך הקריאה.מאז תאי האלמוגים הם שבירים במיוחד, לשמור על לחץ ציטומטר נמוך כדי למנוע תמוגה התא. בעלילה פיזור, להתאים את מתח מכפיל התמונה למרכז הנקודות ולהתחיל להקליט את האירועים. בחלקת פיזור קדימה לעומת צד, ליצור שער סביב התאים בסביבות 10 עד 4 סימן על ציר x פיזור קדימה.החלף את דגימת הבקרה בדגימה הראשונה של תאים מוכתמים והקליט כ- 10,000 תאים לפני ההושהות. לאחר מכן שער את האירועים הייחודיים לקבוצת המדגם המוכתמת. כדי למיין תאי אלמוגים חיים, לאחר בחירת אוכלוסיית התאים המעניינים את תוכנת ציטומטר הזרימה, מקם צינור מיקרוצנטריפוגה אחד המכיל 250 עד 500 מיקרוליטרים של פתרון האיסוף המתאים לתא איסוף הציטרומטר עבור כל אוכלוסייה למיון.לאחר פרק זמן מתאים עבר כדי לשטוף את הפסולת, להתחיל למיין את האוכלוסייה הרצויה לאסוף בכל מקום מ 10, 000 עד כמה מיליוני תאים. בכל פעם נעשה שימוש בכתם, מינים או סדרן חדשים, מיין לפחות 20, 000 תאים בעלי עניין ל-500 מיקרוליטרים של מדיום מכתים כדי לאפשר בדיקת טוהר על אוכלוסיית העניין ולניתוח מחדש של התאים ממוינים כדי לאשר שהאירועים נקראים בתוך השער המשמש למיון הראשוני. למחקרי במבחנה, אחסן את התאים ממוינים על הקרח עד שהם יועברו לאנקובטור או לסביבה מעקרת.כדי להביא חלקיקים אחרים שאינם תאיים שאינם חולקים את אותה צורה או צפיפות כמו תאי האלמוגים ניתן להסיר מהניתוח על ידי יצירת בחירת שער על חלקת פיזור קדימה וצד. ניתן לא לכלול את התאים המתים על-ידי השוואת אות ה- DAPI של מתלי התאים שאינם מוכתמים ומוכתמים באמצעות היסטוגרמה ו- gating החוצה את התאים הגבוהים המבטאים DAPI. במקביל, תאים המארחים סימביודזיה של שפעת אוטומטית ניתן להסיר על ידי gating נגד תאים עם האות הגבוה בערוץ האדום הרחוק.לאחר תהליך גתים איטרטיבי זה, התאים הנותרים מייצגים את אוכלוסיות תאי האלמוגים החיים ללא פגע חסרי סימביודזיה. תאים אלה יכולים להיות מסווגים לאחר מכן תת-כפילויות תאים שונים על ידי כתמים עבור תכונות כגון פעילות מיני חמצן תגובתי ו / או תוכן lysosome. זה קריטי לזכור כי תאים מסוימים הם שבירים יותר מאחרים ולהפעיל את התהליך הזה בזהירות רבה ככל האפשר.לאחר שתאים מסוימים בודדו, ניתן להשתמש בהם עבור בדיקות פונקציונליות של x-vivo כגון יצירת תרבויות תאים ויצירת פרופילים תעתיקים.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) תיוג ומיון לאחר פלואורסצנטי תא פעיל עבור זיהוי, תרבות עצמאית של פחמן אורגני מומסים משפיל Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

מיון של<em&gt; Streptomyces</em&gt; פלטות ניידים באמצעות אובייקט מורכב פרמטריים מנתח וסדרן

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...