Name: fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations
Uploaded: 2020-05-31T12:30:00
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NTK vorrebbe riconoscere l'Università di Miami Research Awards in Scienze Naturali e Ingegneria per finanziare questa ricerca. BR desidera ringraziare Alex e Ann Lauterbach per aver finanziato il Laboratorio di Immunologia Comparata ed Evoluzione. Il lavoro di BR è stato supportato dai numeri della Israel Science Foundation (ISF): 1416/19 e 2841/19, e HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Ringraziamo la signora Kozhekbaeva e Mike Connelly per l'assistenza tecnica. Vorremmo anche ringraziare la risorsa condivisa Cytometry Flow della Miller School of Medicine presso il Sylvester Comprehensive Cancer Center per l'accesso al citometro FACS e a Shannon Saigh per il supporto tecnico.

1. Dissociazione dei tessuti dallo scheletro del corallo tramite aerografo e compressore
NOTA: Eseguire passi sul ghiaccio e proteggere le mani con i guanti.
<ol><li>Assemblare il kit dell'aerografo collegando il compressore d'aria, il tubo flessibile e l'aerografo (Figura 2). Impostare l'indicatore di pressione tra 276-483 kPa. NOTA: Il compressore e il tubo dell'aria consigliati utilizzati per questo studio sono stati preimpostati a una pressione massima di...

<ol>
	<li>Bellwood, D. R., Hughes, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional-scale+assembly+rules+and+biodiversity+of+coral+reefs.">Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs.</a> Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).</li><li>Ferrario, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effectiveness+of+coral+reefs+for+coastal+hazard+risk+reduction+and+adaptation.">The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation.</a> Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).</li><li>Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+microbial+community+associated+with+the+coral+Porites+astreoides.">Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides.</a> Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).</li><li>Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+stress+causes+host+cell+detachment+in+symbiotic+cnidarians:+implications+for+coral+bleaching.">Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching.</a> Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).</li><li>Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+infectious+diseases+really+killing+corals?+Alternative+interpretations+of+the+experimental+and+ecological+data.">Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).</li><li>Miller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+disease+following+massive+bleaching+in+2005+causes+60%+decline+in+coral+cover+on+reefs+in+the+US+Virgin+Islands.">Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands.</a> Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).</li><li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+reefs+under+rapid+climate+change+and+ocean+acidification.">Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification.</a> Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).</li><li>Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+zooxanthellae+in+the+thermal+tolerance+of+corals:+A+"nugget+of+hope"+for+coral+reefs+in+an+era+of+climate+change.">The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).</li><li>Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+causes+and+consequences+of+symbiont+shuffling+in+a+multi-partner+reef+coral+symbiosis+under+environmental+change.">Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).</li><li>Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy.">Anatomy.</a> Diseases of Coral. , 85-107 (2015).</li><li>Allemand, D., Tambutt&#233;, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutt&#233;, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+calcification,+cells+to+reefs.">Coral calcification, cells to reefs.</a> Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).</li><li>Rinkevich, B., Loya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Reproduction+of+the+Red+Sea+Coral+Stylophora+pistillata.+I.+Gonads+and+Planulae.">The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae.</a> Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).</li><li>Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corals+use+similar+immune+cells+and+wound-healing+processes+as+those+of+higher+organisms.">Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms.</a> PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).</li><li>Hayes, R. L., Bush, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+observations+of+recovery+in+the+reef-building+scleractinian+coral,+Montastrea+annularis,+after+bleaching+on+a+Cayman+reef.">Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef.</a> Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).</li><li>Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarian+Histology.">Cnidarian Histology.</a> Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).</li><li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals.">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).</li><li>Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+environmental+biology:+Cell+biology+informing+conservation.">Translational environmental biology: Cell biology informing conservation.</a> Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).</li><li>Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+cell+separation+and+isolation+by+fluorescence-activated+cell+sorting+(FACS).">Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).</li><li>Rosental, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+mammalian-like+haematopoietic+system+found+in+a+colonial+chordate.">Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate.</a> Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).</li><li>Silva-Lima, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Symbiodinium+Strains+Are+Hosted+by+the+Brazilian+Endemic+Corals+Mussismilia+spp.">Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp.</a> Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).</li><li>Yvan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+enumeration+of+bacterial+in+the+coral+surface+mucus+layer.">Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer.</a> Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).</li><li>Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching+response+of+Symbiodinium+(zooxanthellae):+Determination+by+flow+cytometry.">Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).</li><li>Baumgarten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+Aiptasia,+a+sea+anemone+model+for+coral+symbiosis.">The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).</li><li>Voolstra, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+genomes+of+Stylophora+pistillata+and+Acropora+digitifera+provides+evidence+for+extensive+differences+between+species+of+corals.">Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Pavlov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+control+of+tuna+fins:+A+role+for+the+lymphatic+system+in+vertebrate+locomotion.">Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion.</a> Science. 357 (6348), 310-314 (2017).</li></ol>

Questo protocollo è stato adattato da Rosental et al.18 e sviluppato per l'identificazione e l'isolamento delle cellule di P. damicornis. La metodologia si concentra sul processo di filtraggio dei campioni per rimuovere detriti, cellule non vitali e cellule ospitate da Symbiodiniaceae attraverso l'esame di fattori intrinseci cellulari, tra cui la dimensione delle cellule relative, la granularità relativa delle cellule, l'autofluorescenza cellulare e la presenza di membrane cellulari int...

Le barriere coralline sono uno degli ecosistemi più importanti della Terra. Facilitano la biodiversità fornendo habitat critici per pesci e invertebrati e sono fondamentali per sostenere le comunità antropogeniche fornendo cibo e sostentamento economico attraverso il turismo1. In qualità di costruttore chiave di barriere coralline, l'animale corallo (Phylum: Cnidaria) aiuta anche le comunità costiere creando grandi quadri di carbonato di calcio che mitigano i danni delle onde e delle tempeste2.
I coralli come adulti sono animali sessili che ospitano una vasta gamma di partner endosimbiotici, tra cui virus, archea, batteri, protisti, funghi, e, in particolare, i membri della famiglia dinoflagellate algalellate Symbiodiniaceae3. I cambiamenti nell'ambiente possono causare squilibri in questa comunità, spesso portando a focolai di malattia e sbiancamento dei coralli in cui le simbiotiche Symbiodiniaceae vengono espulse dalla colonia del corallo, eliminando così la principale fonte di nutrizione per il corallo. Entrambi questi scenari spesso causano la morte dell'ospite corallo4,5,6. Gli effetti dei fattori di stress antropogenici, come il rapido cambiamento climatico, stanno accelerando gli eventi di morte dei coralli di massa, portando ad un declino globale delle barriere coralline7 .
Recentemente, sono stati sviluppati molti metodi diversiper contribuire a mitigare la perdita della barriera corallina. Questi metodi includonollo posizionamento di coralli sulle barriere coralline esistenti, attraversamento genetico con genotipi termalmente tolleranti e manipolazione cellulare delle comunità microbiche e simbiotiche ospitate all'interno del corallo8,9. Nonostante questi sforzi, molto rimane sconosciuto sulla diversità delle cellule coralline e la funzione cellulare10,11,12,13. Una comprensione approfondita della diversità del tipo di cellule coralline e della funzione cellulare è necessaria per capire come l'organismo corallo si comporta in condizioni normative e stressanti. Gli sforzi per massimizzare l'efficienza del ripristino e della conservazione beneficeranno di una migliore comprensione del modo in cui la diversità cellulare e la funzione genica sono accoppiate.
Precedenti lavori sulla diversità e la funzione cellulare si sono concentrati principalmente sugli studi istologici e sul campionamento dell'RNA a tutto tessuto14,15,16,17. Per ottenere maggiori dettagli sulla funzione specifica del tipo di cellula nei coralli, ci devono essere metodi per l'isolamento di specifiche popolazioni di cellule coralline vive. Questo è stato fatto con successo in organismi modello non classici per mezzo di fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) tecnologia di citometria di flusso18. FACS utilizza una combinazione di laser sintonizzati su lunghezze d'onda variabili per misurare diverse proprietà cellulari endogene a livello di singola cellula, come la dimensione relativa delle cellule, la granularità cellulare e l'autofluorescenza. Inoltre, le cellule possono essere contrassegnate da composti fluorescenti etichettati per misurare specifiche proprietà desiderate18,19.
Finora, l'applicazione della citometria di flusso alle cellule coralline è stata principalmente per l'analisi di Symbiodiniaceae simbiotica e altre popolazioni batteriche utilizzando la loro forte, naturale autofluorescenza20,21,22. FACS è stato utilizzato anche per stimare le dimensioni del genoma del corallo utilizzando il segnale marcatore del DNA fluorescente rispetto alle cellule dell'organismo modello di riferimento23,24. L'applicazione efficiente del FACS fornisce tre strumenti distinti che sono utili per gli studi di biologia cellulare: 1) descrizione morfologica e funzionale delle singole cellule; 2) identificazione, separazione e isolamento di specifiche popolazioni di cellule per studi a valle; e 3) l'analisi dei saggi funzionali a livello di singola cellula.
Lo sviluppo e l'applicazione di vari marcatori fluorescenti esogeni per lo studio delle cellule coralline rimane quasi inesplorato. Tali marcatori possono includere proteine taggate, substrati marcati per enzimi o risposte fluorescenti ad altri composti. Questi marcatori possono essere utilizzati per identificare i tipi di cellule che hanno proprietà uniche, come l'evidenziazione di celle che producono quantità variabili di una specifica funzione di raggruppamento cellulare, come i lisosomi. Un ulteriore esempio è l'uso di perline etichettate fluorescentmente per identificare funzionalmente le cellule competenti per la fagocitosi, o l'inghiottimento di un agente patogeno mirato25. Le popolazioni di cellule attive nelle risposte immunitarie possono essere facilmente identificate dalla FACS dopo l'inghiottimento di queste perline applicate esogenamente. Mentre i metodi istologici tradizionali richiedono tessuto conservato e molte ore per approssimare la percentuale di cellule positive per l'inghiottimento del tallone, un saggio funzionale basato su FACS per l'inghiottimento degli agenti patogeni può essere eseguito relativamente rapidamente su cellule vive isolate. Oltre a studiare le risposte specifiche delle cellule allo stress, questa tecnologia ha il potenziale per chiarire l'espressione gene-specifica e illuminare la storia evolutiva e evolutiva dei tipi di cellule interamente unica per i cnidariani, come i calicoblasti e i cnidociti.
Recentemente, abbiamo eseguito uno screening intensivo di oltre 30 marcatori cellulari che ha portato all'identificazione di 24 che sono in grado di etichettare le cellule coralline, 16 delle quali sono utili per distinguere le popolazioni uniche18, rendendole cluster di differenziazione (CD). Qui descriviamo il processo di isolamento delle cellule coralline in Pocillopora damicornis dalla rimozione delle cellule dallo scheletro di carbonato di calcio all'identificazione e isolamento di specifiche popolazioni di cellule con FACS (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Airbrush Kit &#38; Compressor</td>
			<td>TCP Global</td>
			<td>ABD KIT-H-SET</td>
			<td>Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor &#38; Air Hose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Bulk Reef Supply</td>
			<td>205357</td>
			<td>Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10444</td>
			<td>2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection bag</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>38UV35</td>
			<td>Reloc Zippit 6&#34;L x 4&#34;W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-100ML</td>
			<td>Heat-inactivated at 57 &#176;C for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>pH 7.4; 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352063</td>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations

Le barriere coralline sono minacciate da fattori di stress antropogenici. La risposta biologica del corallo a questi fattori di stress può verificarsi a livello cellulare, ma i meccanismi non sono ben compresi. Per studiare la risposta dei coralli ai fattori di stress, abbiamo bisogno di strumenti per analizzare le risposte cellulari. In particolare, abbiamo bisogno di strumenti che facilitino l'applicazione di saggi funzionali per capire meglio come le popolazioni cellulari reagiscono allo stress. Nello studio attuale, utilizziamo lo smistamento delle cellule attivato dalla fluorescenza (FACS) per isolare e separare diverse popolazioni di cellule nei coralli rocciosi. Questo protocollo comprende: (1) la separazione dei tessuti del corallo dallo scheletro, (2) la creazione di una sospensione a singola cella, (3) l'etichettatura delle cellule coralline utilizzando vari marcatori per la citometria di flusso e (4) strategie di gating e smistamento delle cellule. Questo metodo consentirà ai ricercatori di lavorare sui coralli a livello cellulare per analisi, analisi funzionali e studi sull'espressione genica di diverse popolazioni di cellule.

Nel complesso, questo protocollo è utile perché facilita l'identificazione e la raccolta delle popolazioni di cellule coralline vive che possono essere utilizzate per analisi funzionali. Il flusso di lavoro è iniziato con la separazione meccanica dei tessuti corallini dallo scheletro di carbonato di calcio sottostante (Figura 1). Questo è uno dei passi iniziali più importanti perché tecnica impropria si traduce in alta mortalità cellulare e può creare...

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Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

I coralli creano ecosistemi di biodiversità importanti sia per l'uomo che per gli organismi marini. Tuttavia, ancora non comprendiamo il pieno potenziale e la funzione di molte cellule coralline. Qui, presentiamo un protocollo sviluppato per l'isolamento, l'etichettatura e la separazione delle popolazioni di cellule coralline rocciose.

Ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza per l'isolamento delle popolazioni cellulari Scleractiniane

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Questo protocollo facilita l'identificazione e l'isolamento delle popolazioni di cellule coralline vive a un livello di descrizione non precedentemente possibile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'accesso a un livello di specificità cellulare che fino ad ora è stato per lo più irraggiungibile. A dimostrare la procedura sarà la Dott.ssa Shannon Saigh, un'associazione di ricerca della risorsa condivisa di citometria a flusso presso il Sylvester Comprehensive Cancer Center.Per impostare il citometro di flusso per l'ordinamento delle celle di corallo vive, aprire un nuovo modello di progetto nel software del citometro a flusso e selezionare i laser appropriati per l'analisi nel pannello laser. Quindi, create un grafico a dispersione laterale rispetto a quello forward nei grafici appropriati per impostare la strategia di gating e analisi. Per l'analisi citometrica del flusso e lo smistamento delle cellule coralline vive, caricare il campione di cellule non contaminate di controllo nella camera campione del citometro e avviare il processo di lettura.Poiché le cellule coralline sono particolarmente fragili, mantenere bassa la pressione del citometro per prevenire la llisi cellulare. Nel grafico a dispersione, regolare la tensione del moltiplicatore di foto per centrare i punti e iniziare a registrare gli eventi. Nel grafico a dispersione avanti contro laterale, create un gate attorno alle celle intorno al 10-4° segno sull'asse x a dispersione in avanti.Sostituire l'esempio di controllo con il primo campione di celle macchiate e registrare circa 10.000 celle prima di fermarsi. Quindi eseguire il gate degli eventi univoci per il gruppo di campioni macchiato. Per ordinare le cellule coralline vive, dopo aver selezionato la popolazione cellulare di interesse nel software del citometro di flusso, posizionare un tubo di microcentrifugo contenente da 250 a 500 microlitri della soluzione di raccolta appropriata nella camera di raccolta del citometro per ogni popolazione da ordinare.Una volta che è passata una quantità appropriata di tempo per eliminare i detriti, inizia a ordinare la popolazione desiderata da raccogliere ovunque da 10.000 a diversi milioni di cellule. Ogni volta che viene utilizzata una nuova macchia, specie o cernita, ordinare almeno 20.000 cellule di interesse in 500 microlitri di mezzo di colorazione per consentire l'esecuzione di un controllo di purezza sulla popolazione di interesse e rianalizzare le celle ordinate per confermare che gli eventi vengono letti all'interno del cancello utilizzato per lo smistamento iniziale. Per gli studi in vitro, conservare le cellule ordinate sul ghiaccio fino a quando non vengono trasferite in un'incubatrice o in un ambiente sterilizzato.Per introdurre altre particelle non cellulari che non condividono la stessa forma o granularità delle cellule coralline, è possibile rimuovere dall'analisi creando una selezione di gate su un grafico a dispersione avanti e laterale. Le cellule morte possono essere escluse confrontando il segnale DAPI delle sospensioni cellulari non macchiate e macchiate usando un istogramma e snodiando le cellule ad alta esprimezione DAPI. In parallelo, le cellule che ospitano la simbiodeneasia dell'autofluorescenza possono essere rimosse sgando contro le cellule con il segnale alto nel canale rosso lontano.Dopo questo processo di gating iterativo, le cellule rimanenti rappresentano le popolazioni intatte di cellule coralline vive prive di simbiodeneasia. Queste cellule possono quindi essere classificate in sottopopolazioni cellulari diverse macchiando caratteristiche quali l'attività reattiva delle specie di ossigeno e/o il contenuto di lisosomio. È fondamentale ricordare che alcune cellule sono più fragili di altre ed eseguire questo processo con la massima attenzione possibile.Una volta isolate, cellule specifiche possono essere utilizzate per saggi funzionali x-vivo come la creazione di colture cellulari e la creazione di profili trascritomici.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolamento e trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE)

Ricerca

Biologia

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

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Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cella di analisi specifica di<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Foglie usando fluorescenza activated cell sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolamento di fibroblasti normali e tumorali associata da tessuti freschi di fluorescenza activated cell sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Ordinamento dei<em&gt; Streptomyces</em&gt; Pellet cella utilizzando un complesso di oggetti parametrici Analyzer e Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolamento dei vasi sanguigni derivati ​​da Multipotent precursori del muscolo scheletrico umano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...