Name: fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations
Uploaded: 2020-05-31T12:30:00
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NTK는이 연구에 자금을 조달하기위한 자연 과학 및 공학 마이애미 연구 상 대학을 인정하고 싶습니다. BR은 비교 및 진화 면역학 실험실에 자금을 지원한 알렉스와 앤 라우터바흐에게 감사를 표하고 싶습니다. BR의 작품은 이스라엘 과학 재단 (ISF) 번호에 의해 지원되었다: 1416/19 및 2841/19, HFSP 연구 보조금, RGY0085/2019. 우리는 기술 지원을 위한 잔나 코제바에바와 마이크 코넬리에게 감사드립니다. 우리는 또한 마이애미 대학, 의학의 밀러 학교의 흐름 세포 분석 공유 자원 에 FACS 세포계에 대한 액세스 및 기술 지원을 섀넌 Saigh에 감사드립니다.

1. 에어 브러시와 압축기를 통해 산호 골격에서 조직의 해리
참고 : 얼음에 단계를 수행하고 장갑으로 손을 보호합니다.
<ol><li>에어 컴프레서, 호스 및 에어브러시를 연결하여 에어브러시 키트를 조립합니다(그림2). 압력 게이지를 276-483 kPa 사이로 설정합니다. 참고: 이 연구에 사용된 권장 압축기 및 공기 호스는 최대 압력 393kPa로 미리 설정되었습니?...

<ol>
	<li>Bellwood, D. R., Hughes, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional-scale+assembly+rules+and+biodiversity+of+coral+reefs.">Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs.</a> Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).</li><li>Ferrario, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effectiveness+of+coral+reefs+for+coastal+hazard+risk+reduction+and+adaptation.">The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation.</a> Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).</li><li>Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+microbial+community+associated+with+the+coral+Porites+astreoides.">Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides.</a> Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).</li><li>Gates, R. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+genomes+of+Stylophora+pistillata+and+Acropora+digitifera+provides+evidence+for+extensive+differences+between+species+of+corals.">Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Pavlov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+control+of+tuna+fins:+A+role+for+the+lymphatic+system+in+vertebrate+locomotion.">Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion.</a> Science. 357 (6348), 310-314 (2017).</li></ol>

이 프로토콜은 Rosental 외18에서 적응하고 P. 다미코니스 세포의 식별 및 격리를 위해 개발되었다. 이 방법론은 상대적인 세포 크기, 상대세포 세분성, 세포 자가형광 및 손상되지 않은 세포막의 존재를 포함한 세포 본질적 인자를 검사를 통해 파편, 생존 불가능한 세포 및 Symbiodiniaceae 호스팅 세포를 제거하기 위해 샘플을 필터링하는 과정에 중점을 둡니다. 이러한 기술은 다...

산호초는 지구상에서 가장 중요한 생태계 중 하나입니다. 그들은 물고기와 무척추 동물에 대한 중요한 서식지를 제공함으로써 생물 다양성을 촉진하고 관광1을통해 음식과 경제적 생계를 제공함으로써 인류 공동체를 유지하는 데 중요합니다. 산호초의 주요 빌더인 산호동물(Phylum: Cnidaria)은 파도와 폭풍 피해를 완화하는 대형 탄산칼슘 프레임워크를 만들어 해안 지역사회를 돕습니다2.
산호는 성인으로서 바이러스, 고고학, 박테리아, 프로티스트, 곰팡이, 그리고 특히 조류 디노플라젤레이트 패밀리 심비오디니아과3의구성원을 포함하는 다양한 내분비파트너를 호스트하는 세실 동물이다. 환경의 변화는 종종 질병 발발과 공생 Symbiodiniaceae따라서 산호 식민지에서 추방되는 산호 표백으로 이어지는이 지역 사회에서 불균형을 일으킬 수 있습니다, 따라서 산호에 대한 영양의 주요 소스를 제거. 이 두 가지 시나리오는 종종산호 호스트4,5,,6의죽음을 일으킵니다. 급속한 기후 변화와 같은 인위적인 유발 스트레스의 영향은 대량 산호 사멸 사건을 가속화하여 산호초의 세계적인 쇠퇴로 이어지고 있습니다7.
최근에는 산호초 손실을 완화하기 위해 다양한 방법이 개발되었습니다. 이러한 방법은 기존 산호초에 산호의 식재, 열 내성 유전형을 사용하여 유전 횡단, 산호 내에서 호스팅 미생물 및 공생 지역 사회의 세포조작을포함8,9. 이러한 노력에도 불구하고, 산호세포의 다양성과세포기능(10,,11,,12,,13)에대해서는 아직 알려지지 않은 것들이 많다. 산호 세포 유형 다양성과 세포 기능에 대한 철저한 이해는 산호 유기체가 규범적이고 스트레스가 많은 조건에서 어떻게 작동하는지 이해하는 데 필요합니다. 복원 및 보존 효율성을 극대화하기 위한 노력은 세포 다양성과 유전자 기능이 결합되는 방식에 대한 이해를 높이는 데 도움이 될 것입니다.
세포 다양성 및 기능에 대한 이전 연구는 주로 조직학 연구 및 전체 조직 RNA 샘플링14,,15,,16,,17에초점을 맞추고 있다. 산호의 특정 세포 유형 기능에 대한 자세한 내용을 얻으려면, 살아있는 산호 세포의 특정 인구의 격리를위한 방법이 있을 필요가있다. 이는 형광 활성화 세포 선별(FACS) 유세포 분석 기술18에의해 비고전적 모델 유기체에서 성공적으로 수행되었다. FACS는 상대적인 세포 크기, 세포 세분성 및 자동 형광과 같은 단일 세포 수준에서 다른 내인성 세포 특성을 측정하기 위해 다양한 파장으로 조정된 레이저의 조합을 이용합니다. 부가적으로, 세포는 특정, 원하는 특성 을 측정하기 위해 형광 표지 화합물에 의해 표시 될 수있다18,,19.
지금까지 산호세포에 대한 유세포분석의 적용은 주로 그들의 강하고 자연적인자가형광(20,,21,,22)을이용하여 공생공생과 및 기타 세균 집단의 분석을 위한 것이되었다. FACS는 또한 참조 모델 유기체 세포23,,24에비해 형광 DNA 마커 신호를 사용하여 산호 게놈 크기를 추정하는 데 사용되어 왔다. FACS의 효율적인 응용 프로그램은 세포 생물학 연구에 유용한 세 가지 뚜렷한 도구를 제공합니다 : 1) 단일 세포의 형태학적 및 기능적 설명; 2) 다운스트림 연구를 위한 특정 세포 집단의 식별, 분리 및 격리; 및 3) 단일 세포 수준에서 기능성 분석의 분석.
산호 세포의 연구를위한 다양한 외인성 형광 마커의 개발 및 적용은 거의 탐험되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이러한 마커는 태그가 지정된 단백질, 효소에 대한 태그가 지정된 기질, 또는 다른 화합물에 대한 형광 반응을 포함할 수 있다. 이 마커는 리소좀같이 특정 세포 구획 특징의 다양한 양을 생성하는 세포를 강조하는 것과 같은 독특한 특성이 있는 세포 모형을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다. 추가적인 예는 형광표지된 비드를 사용하여 식세포증또는 표적병원균(25)의침형성에 유능한 세포를 기능적으로 식별한다. 면역 반응에서 활성 세포의 집단은 외인성 적용 비드의 침몰 후 FACS에 의해 쉽게 식별 될 수있다. 전통적인 조직학적 방법은 비드 침윤에 대해 양성 세포의 백분율을 근사하기 위해 보존 된 조직과 많은 시간을 필요로하지만, 병원체 침윤에 대한 FACS 기반 기능 분석법은 고립 된 살아있는 세포에서 상대적으로 빠르게 수행 될 수 있습니다. 이 기술은 스트레스에 대한 세포 특이적 반응을 연구하는 것 외에도 유전자 특이적 발현을 명확히 하고 칼리코블라스트 및 자각세포와 같은 세포체에 완전히 고유한 세포 유형의 진화 및 발달 역사를 조명할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
최근에는 30개 이상의 세포 마커를 집중적으로 선별하여 산호 세포에 라벨을 붙일 수 있는 24개의 세포를 식별했으며, 그 중 16개는 고유 집단18을구별하는 데 유용하며, 이를 차별화(CD)의 클러스터로 만들었습니다. 여기에서 우리는 POCILlopora damicornis에 있는 산호 세포 격리의 프로세스를 FACS를 가진 특정 세포 인구의 확인 그리고 격리에 탄산칼슘 골격에서 세포를 제거하기에서 기술합니다(그림 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Airbrush Kit &#38; Compressor</td>
			<td>TCP Global</td>
			<td>ABD KIT-H-SET</td>
			<td>Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor &#38; Air Hose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Bulk Reef Supply</td>
			<td>205357</td>
			<td>Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10444</td>
			<td>2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection bag</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>38UV35</td>
			<td>Reloc Zippit 6&#34;L x 4&#34;W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-100ML</td>
			<td>Heat-inactivated at 57 &#176;C for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>pH 7.4; 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352063</td>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations

산호초는 인위적 스트레스로 인해 위협을 받고 있습니다. 이러한 스트레스에 산호의 생물학적 반응은 세포 수준에서 발생할 수 있습니다,하지만 메커니즘은 잘 이해되지 않습니다. 스트레스에 산호 응답을 조사 하려면, 우리는 세포 응답을 분석 하기 위한 도구가 필요. 특히, 우리는 세포 집단이 스트레스에 반응하는 방법을 더 잘 이해하기 위하여 기능적인 측정법의 응용을 촉진하는 공구가 필요합니다. 현재 연구에서는, 우리는 돌산호에 있는 다른 세포 인구를 격리하고 분리하기 위하여 형광 활성화 세포 선별 (FACS)를 이용합니다. 이 프로토콜은 다음을 포함한다: (1) 골격으로부터 산호 조직의 분리, (2) 단일 세포 현탁액의 생성, (3) 유세포 측정을 위한 다양한 마커를 사용하여 산호 세포를 표지하는 것, 및 (4) 게이팅 및 세포 선별 전략. 이 방법은 연구원이 분석, 기능 분석 및 다른 세포 집단의 유전자 발현 연구를 위한 세포 수준에서 산호에 작동하도록 가능하게 할 것입니다.

전반적으로, 이 프로토콜은 기능적 분석에 사용될 수 있는 살아있는 산호 세포 집단의 식별 및 수집을 용이하게 하기 때문에 유용합니다. 워크플로우는 산호 조직을 탄산칼슘 골격에서 기계적으로 분리하는 것으로시작되었습니다(그림 1). 이것은 부적당한 기술이 높은 세포 사망을 초래하고 많은 양의 파편을 만들 수 있기 때문에 가장 중요한 초기 ?...

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Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

산호는 인간과 해양 생물 모두에게 중요한 생물 다양성 생태계를 만듭니다. 그러나, 우리는 아직도 많은 산호 세포의 완전한 잠재력과 기능을 이해하지 못합니다. 여기에서, 우리는 돌로 된 산호 세포 인구의 격리, 표지 및 분리를 위해 개발된 프로토콜을 제시합니다.

Scleractinian 세포 인구의 격리를 위한 형광 활성화 세포 분류

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

이 프로토콜은 이전에는 불가능했던 설명 수준에서 살아있는 산호 세포 집단의 식별 및 격리를 용이하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 지금까지 대부분 달성 할 수없는 세포 특이성의 수준에 대한 액세스를 허용한다는 것입니다. 절차를 보여주는 것은 박사 섀넌 사이, 실베스터 포괄적 인 암 센터에서 흐름 세포 측정 공유 자원에서 연구 동료가 될 것입니다.라이브 산호 셀 정렬을 위한 유동 사이토미터를 설정하려면 유량 사이토미터 소프트웨어에 새 프로젝트 템플릿을 열고 레이저 패널의 분석에 적합한 레이저를 선택합니다. 그런 다음 게이팅 및 분석 전략을 설정하기 위한 적절한 플롯에서 측면 분산 대 전방 분산 플롯을 만듭니다. 살아있는 산호 세포의 흐름 세포 측정 분석 및 정렬을 위해, 세포계의 샘플 챔버에 제어 미염색 세포 샘플을 로드하고 판독 과정을 시작합니다.산호 세포는 특히 깨지기 때문에 세포 리시를 방지하기 위해 세포계 압력을 낮게 유지하십시오. 분산 플롯에서 사진 승수 전압을 조정하여 점을 중앙으로 조정하고 이벤트 기록을 시작합니다. 전방 및 측면 분산 플롯에서, 전방 분산 x 축의 10에서 4번째 마크 주위의 셀 주위게이트를 만듭니다.제어 샘플을 스테인드 셀의 첫 번째 샘플로 교체하고 일시 중지하기 전에 약 10, 000 세포를 기록합니다. 그런 다음 스테인드 샘플 그룹에 고유한 이벤트를 게이트합니다. 살아있는 산호 세포를 정렬하려면, 유동 세포계 소프트웨어에 대한 관심의 세포 집단을 선택한 후, 각 집단에 대한 세포계 수집 챔버에 적절한 수집 용액의 250 ~ 500 마이크로 리터를 포함하는 하나의 미세 원심 분리기 튜브를 배치정렬합니다.적절한 시간이 경과하여 잔해를 씻어내고, 원하는 인구를 분류하여 10, 000에서 수백만 개의 세포로 수집합니다. 새로운 얼룩, 종 또는 선별기가 사용될 때마다, 적어도 20, 000개의 관심 있는 세포를 500 마이크로리터로 분류하여 관심 집단에서 순도 검사를 수행하고 선별된 세포를 재분석하여 초기 선별에 사용되는 게이트 내에서 이벤트가 읽혀지고 있는지 확인한다. 시험관 내 연구의 경우 정렬된 세포를 인큐베이터 또는 살균 된 환경으로 옮겨질 때까지 얼음에 보관하십시오.산호 세포와 동일한 모양이나 세분성을 공유하지 않는 다른 비세포 입자를 가져오기 위해 전방 및 측면 산란 플롯에 게이트 선택을 만들어 분석에서 제거할 수 있다. 죽은 세포는 히스토그램을 이용하여 염색되지 않은 세포 현탁액의 DAPI 신호를 비교하고 높은 DAPI 표현 세포를 제거함으로써 배제될 수 있다. 병렬로, 자동 형광 공생을 호스팅하는 세포는 먼 적색 채널에서 높은 신호로 세포에 대해 게이팅하여 제거 할 수 있습니다.이 반복 게이팅 과정 후, 나머지 세포는 공생증이 부족한 그대로 살아있는 산호 세포 집단을 나타낸다. 이러한 세포는 반응성 산소 종 활성 및/또는 리소솜 함량과 같은 특징을 염색하여 상이한 세포 하위 집단으로 분류될 수 있다. 일부 세포는 다른 세포보다 더 연약하다는 것을 기억하고 가능한 한 신중하게이 과정을 실행하는 것이 중요합니다.일단 특정 세포가 격리되면, 세포 배양을 확립하고 전사 성단을 만드는 것과 같은 x-vivo 기능적 소사에 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

분리 및 조혈 줄기 세포의 이식 (HSCs)

연구

생물학

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) 레이블과 녹아 유기 문화 독립적인 확인을위한 후속 형광 활성 세포 정렬 탄소 굴욕 Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

의 세포 구체적인 분석<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

형광 활성 세포 정렬 (FACS)에 의해 신선한 조직으로부터 정상 및 암 관련 섬유 아세포의 분리

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

의 정렬<em&gt; 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)</em복잡한 개체 파라 메트릭 분석기 및 분류기를 사용하여&gt; 셀 펠렛

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...