Name: fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations
Uploaded: 2020-05-31T12:30:00
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A NTK gostaria de reconhecer o Prêmio de Pesquisa da Universidade de Miami em Ciências Naturais e Engenharia por financiar esta pesquisa. A BR agradece a Alex e Ann Lauterbach pelo financiamento do Laboratório de Imunologia Comparativa e Evolutiva. O trabalho da BR contou com o apoio dos números da Fundação Israelia de Ciência (ISF): 1416/19 e 2841/19, e do HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Gostaríamos de agradecer a Zhanna Kozhekbaeva e Mike Connelly por assistência técnica. Também gostaríamos de agradecer à Universidade de Miami, Miller School of Medicine's Flow Cytometry Shared Resource no Sylvester Comprehensive Cancer Center pelo acesso ao citômetro FACS e a Shannon Saigh por suporte técnico.

1. Dissociação de tecidos do esqueleto de coral via escova de ar e compressor
NOTA: Realize passos no gelo e proteja as mãos com luvas.
<ol><li>Monte o kit de aerógrafo conectando o compressor de ar, mangueira e escova de ar(Figura 2). Coloque o medidor de pressão entre 276-483 kPa. NOTA: O compressor recomendado e a mangueira de ar utilizada para este estudo foram predefinidos a uma pressão máxima de 393 kPa. O uso fora desta faixa de 276-483 kPa pode...

<ol>
	<li>Bellwood, D. R., Hughes, T. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+genomes+of+Stylophora+pistillata+and+Acropora+digitifera+provides+evidence+for+extensive+differences+between+species+of+corals.">Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Pavlov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+control+of+tuna+fins:+A+role+for+the+lymphatic+system+in+vertebrate+locomotion.">Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion.</a> Science. 357 (6348), 310-314 (2017).</li></ol>

Este protocolo foi adaptado de Rosental et al.18 e desenvolvido para identificação e isolamento de células P. damicornis. A metodologia se concentra no processo de filtragem de amostras para remover detritos, células não viáveis e células hospedadas por Symbiodiniaceae através do exame de fatores intrínsecos celulares, incluindo tamanho celular relativo, granularidade celular relativa, autofluorescência celular e presença de membranas celulares intactas. Essas técnicas podem s...

Recifes de corais são um dos ecossistemas mais importantes da Terra. Eles facilitam a biodiversidade fornecendo habitats críticos para peixes e invertebrados e são cruciais para sustentar comunidades antropogênicas, fornecendo alimentos e meios de subsistência econômicas através do turismo1. Como principal construtor de recifes de corais, o animal de coral (Phylum: Cnidaria) também auxilia as comunidades costeiras, criando grandes estruturas de carbonato de cálcio que mitigam os danos causados por ondas e tempestades2.
Corais como adultos são animais sessil que hospedam uma ampla gama de parceiros endossímbios, incluindo vírus, arqueias, bactérias, protistas, fungos e, mais notavelmente, membros da família algal dinoflagellate Symbiodiniaceae3. Mudanças no ambiente podem causar desequilíbrios nesta comunidade, muitas vezes levando a surtos de doenças e branqueamento de corais em que os simbióticos Simbióticos Simbiodiniaceae são expulsos da colônia de corais, eliminando assim a principal fonte de nutrição para os corais. Ambos os cenários costumam causar a morte do hospedeiro coral4,,5,6. Os efeitos dos estressores induzidos por antropogênicos, como as rápidas mudanças climáticas, estão acelerando os eventos de morte em massa de corais, levando a um declínio global dos recifes de coral7.
Recentemente, muitos métodos diferentes foram desenvolvidos para ajudar a mitigar a perda de recifes de coral. Esses métodos incluem o não planejamento de corais nos recifes existentes, a travessia genética usando genótipos termicamente tolerantes e a manipulação celular das comunidades microbianas e simbióticas hospedadas dentro do coral8,,9. Apesar desses esforços, muito ainda é desconhecido sobre a diversidade celular coral e a função celular10,11,12,13. Uma compreensão completa da diversidade do tipo celular coral e da função celular é necessária para entender como o organismo coral se comporta sob condições normativas e estressantes. Os esforços para maximizar a eficiência de restauração e preservação se beneficiarão de uma compreensão aprimorada de como a diversidade celular e a função genética são acopladas.
Trabalhos anteriores sobre diversidade e função celular tem focado principalmente em estudos histológicos e amostragem de RNA de tecido inteiro14,,15,,16,,17. Para obter maior detalhe sobre a função específica do tipo celular nos corais, é necessário que haja métodos para o isolamento de populações específicas de células de corais vivos. Isso tem sido feito com sucesso em organismos de modelos não clássicos por meio da tecnologia de citometria de fluxo ativada pela fluorescência (FACS)18. O FACS utiliza uma combinação de lasers sintonizados em diferentes comprimentos de onda para medir diferentes propriedades celulares endógenas no nível de célula única, como tamanho relativo da célula, granularidade celular e autofluorescência. Além disso, as células podem ser marcadas por compostos fluorescentes rotulados para medir propriedades específicas e desejadas18,19.
Até agora, a aplicação da citometria de fluxo às células de coral tem sido principalmente para a análise de simbióticos simbiodiníacease e outras populações bacterianas utilizando sua forte autofluorescência natural20,21,,22. O FACS também tem sido usado para estimar o tamanho do genoma do coral usando sinal de marcador de DNA fluorescente comparado com células do organismo modelo de referência23,24. A aplicação eficiente do FACS fornece três ferramentas distintas que são úteis para estudos de biologia celular: 1) descrição morfológica e funcional de células únicas; 2) identificação, separação e isolamento de populações celulares específicas para estudos a jusante; e 3) a análise de ensaios funcionais no nível de célula única.
O desenvolvimento e a aplicação de vários marcadores fluorescentes exógenos para o estudo de células de coral permanece quase inexplorado. Tais marcadores podem incluir proteínas marcadas, substratos marcados para enzimas ou respostas fluorescentes a outros compostos. Esses marcadores podem ser usados para identificar tipos de células que possuem propriedades únicas, como destacar células que produzem quantidades variadas de um compartimento celular específico, como lysososomes. Um exemplo adicional é o uso de contas fluorescentes rotuladas para identificar funcionalmente células competentes para fagocitose, ou o engolfamento de um patógeno direcionado25. Populações de células ativas em respostas de imunidade podem ser facilmente identificadas pelo FACS após o engolfamento dessas contas exógenas aplicadas. Enquanto os métodos histológicos tradicionais requerem tecido preservado e muitas horas para aproximar a porcentagem de células positivas para o engolfamento de contas, um ensaio funcional baseado em FACS para o engolfamento de patógenos pode ser realizado relativamente rapidamente em células vivas isoladas. Além de estudar respostas específicas das células ao estresse, essa tecnologia tem o potencial de esclarecer a expressão específica de genes e iluminar a história evolutiva e de desenvolvimento de tipos celulares inteiramente exclusivos dos cnidários, como calicoblasts e cnidocytes.
Recentemente, realizamos uma triagem intensiva de mais de 30 marcadores celulares que resultou na identificação de 24 capazes de rotular células de coral, das quais 16 são úteis para distinguir populações únicas18,tornando-as clusters de diferenciação (CD). Aqui descrevemos o processo de isolamento das células de coral em Pocillopora damicornis desde a remoção de células do esqueleto de carbonato de cálcio até a identificação e isolamento de populações celulares específicas com FACS (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Airbrush Kit &#38; Compressor</td>
			<td>TCP Global</td>
			<td>ABD KIT-H-SET</td>
			<td>Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor &#38; Air Hose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Bulk Reef Supply</td>
			<td>205357</td>
			<td>Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10444</td>
			<td>2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection bag</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>38UV35</td>
			<td>Reloc Zippit 6&#34;L x 4&#34;W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-100ML</td>
			<td>Heat-inactivated at 57 &#176;C for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>pH 7.4; 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352063</td>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations

Recifes de coral estão sob ameaça devido a estressores antropogênicos. A resposta biológica dos corais a esses estressores pode ocorrer a nível celular, mas os mecanismos não são bem compreendidos. Para investigar a resposta dos corais aos estressores, precisamos de ferramentas para analisar as respostas celulares. Em particular, precisamos de ferramentas que facilitem a aplicação de ensaios funcionais para entender melhor como as populações celulares estão reagindo ao estresse. No presente estudo, utilizamos a triagem celular ativada por fluorescência (FACS) para isolar e separar diferentes populações celulares em corais pedregosos. Este protocolo inclui: (1) a separação dos tecidos de coral do esqueleto, (2) a criação de uma única suspensão celular, (3) rotular as células de coral usando vários marcadores para citometria de fluxo, e (4) estratégias de gating e classificação celular. Esse método permitirá que os pesquisadores trabalhem em corais no nível celular para análise, ensaios funcionais e estudos de expressão genética de diferentes populações celulares.

No geral, esse protocolo é útil porque facilita a identificação e coleta de populações de células de corais vivos que podem ser utilizadas para análises funcionais. O fluxo de trabalho começou com a separação mecânica dos tecidos de coral do esqueleto de carbonato de cálcio subjacente(Figura 1). Este é um dos passos iniciais mais importantes porque a técnica inadequada resulta em alta mortalidade celular e pode criar grandes quantidades de detr...

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Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Os corais criam ecossistemas biodiversos importantes para humanos e organismos marinhos. No entanto, ainda não entendemos todo o potencial e função de muitas células de coral. Aqui, apresentamos um protocolo desenvolvido para o isolamento, rotulagem e separação de populações de células de corais pedregosos.

Classificação celular ativada pela fluorescência para o isolamento de populações celulares escleracianas

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Este protocolo facilita a identificação e isolamento de populações de células de coral vivos em um nível de descrição não possível anteriormente. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o acesso a um nível de especificidade celular que até agora tem sido quase inatingível. Demonstrando o procedimento estará a Dra.Para configurar o citômetro de fluxo para classificação de células de coral ao vivo, abra um novo modelo de projeto no software do citrômetro de fluxo e selecione os lasers apropriados para a análise no painel laser. Em seguida, crie um gráfico de dispersão lateral versus dispersão para a frente nas parcelas apropriadas para configurar a estratégia de gating e análise. Para análise citométrica de fluxo e triagem das células de coral vivos, carregue a amostra celular não manchada de controle na câmara amostral do cítômetro e inicie o processo de leitura.Como as células de coral são particularmente frágeis, mantenha a pressão do cítômetro baixa para evitar a lise celular. No gráfico de dispersão, ajuste a tensão multiplicadora de fotos para centralizar os pontos e comece a registrar os eventos. No gráfico de dispersão dianteira versus lateral, crie um portão ao redor das células em torno da marca 10 até a 4ª marca no eixo x de dispersão dianteira.Substitua a amostra de controle pela primeira amostra de células manchadas e registou aproximadamente 10.000 células antes de fazer uma pausa. Em seguida, portão os eventos que são exclusivos para o grupo amostral manchado. Para classificar as células de coral vivas, depois de selecionar a população celular de interesse no software do citómetro de fluxo, coloque um tubo de microcentrifusagem contendo 250 a 500 microliters da solução de coleta apropriada na câmara de coleta de cítmetros para cada população classificar.Uma vez que uma quantidade apropriada de tempo tenha passado para eliminar os detritos, comece a classificar a população desejada para coletar entre 10.000 e vários milhões de células. Cada vez que uma nova mancha, espécie ou classificador é usado, classifique pelo menos 20.000 células de interesse em 500 microliters de meio de coloração para permitir que uma verificação de pureza seja realizada na população de interesse e reanalisar as células classificadas para confirmar que os eventos estão sendo lidos dentro do portão usado para a triagem inicial. Para estudos in vitro, armazene as células classificadas no gelo até que sejam transferidas para uma incubadora ou ambiente esterilizado.Para trazer outras partículas não celulares que não compartilham a mesma forma ou granularidade que as células de coral podem ser removidas da análise criando uma seleção de portão em um gráfico de dispersão para frente e lateral. As células mortas podem ser excluídas comparando o sinal DAPI das suspensões celulares não manchadas e manchadas usando um histograma e gating as células altas expressas por DAPI. Em paralelo, as células que hospedam a simbiodeneasia de autofluorescência podem ser removidas gating contra células com o sinal alto no canal vermelho distante.Após esse processo de gating iterativo, as células remanescentes representam as populações de células de coral vivas intactas que carecem de simbiodeneasia. Essas células podem então ser classificadas em diferentes subpopulações celulares por coloração para características como atividade reativa de espécies de oxigênio e/ou conteúdo líssomo. É fundamental lembrar que algumas células são mais frágeis do que outras e executar esse processo com o mais cuidado possível.Uma vez que células específicas tenham sido isoladas, elas podem ser usadas para ensaios funcionais x-vivo, como estabelecer culturas celulares e criar perfis transcriômicos.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

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Isolamento e Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (HSCs)

Biologia

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxiuridina Labeling (BrdU) e separação de células subseqüentes Fluorescence Activated de Cultura independente de Identificação de carbono orgânico dissolvido de degradação bacterioplâncton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

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Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

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Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolamento de fibroblastos normais e associados ao câncer de tecidos frescos, classificando células activadas por fluorescência (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Classificando de<em&gt; Streptomyces</em&gt; pellets de células usando um objeto complexo Parametric Analyzer e Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...