Name: fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations
Uploaded: 2020-05-31T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations at JoVE.com

NTK vill erkänna University of Miami Research Awards i naturvetenskap och teknik för att finansiera denna forskning. BR vill tacka Alex och Ann Lauterbach för finansieringen av komparativa och evolutionära immunologi laboratory. Arbetet i BR stöddes av Israel Science Foundation (ISF) nummer: 1416/19 och 2841/19, och HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Vi vill tacka Zhanna Kozhekbaeva och Mike Connelly för tekniskt bistånd. Vi vill också tacka University of Miami, Miller School of Medicine's Flow Cytometry Shared Resource vid Sylvester Comprehensive Cancer Center för tillgång till FACS cytometer och Shannon Saigh för teknisk support.

1. Dissociation av vävnader från korallskelett via airbrush och kompressor
OBS: Utför steg på is och skydda händerna med handskar.
<ol><li>Montera airbrushsatsen genom att ansluta luftkompressorn, slangen och airbrushn (figur 2). Ställ in tryckmätaren mellan 276−483 kPa. OBS: Den rekommenderade kompressorn och luftslangen som användes för denna studie var förinställd till ett maximalt tryck på 393 kPa. Användning utanför detta 276-483 kPa-inte...

<ol>
	<li>Bellwood, D. R., Hughes, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional-scale+assembly+rules+and+biodiversity+of+coral+reefs.">Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs.</a> Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).</li><li>Ferrario, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effectiveness+of+coral+reefs+for+coastal+hazard+risk+reduction+and+adaptation.">The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation.</a> Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).</li><li>Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+microbial+community+associated+with+the+coral+Porites+astreoides.">Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides.</a> Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).</li><li>Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+stress+causes+host+cell+detachment+in+symbiotic+cnidarians:+implications+for+coral+bleaching.">Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching.</a> Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).</li><li>Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+infectious+diseases+really+killing+corals?+Alternative+interpretations+of+the+experimental+and+ecological+data.">Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).</li><li>Miller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+disease+following+massive+bleaching+in+2005+causes+60%+decline+in+coral+cover+on+reefs+in+the+US+Virgin+Islands.">Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands.</a> Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).</li><li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+reefs+under+rapid+climate+change+and+ocean+acidification.">Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification.</a> Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).</li><li>Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+zooxanthellae+in+the+thermal+tolerance+of+corals:+A+"nugget+of+hope"+for+coral+reefs+in+an+era+of+climate+change.">The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).</li><li>Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+causes+and+consequences+of+symbiont+shuffling+in+a+multi-partner+reef+coral+symbiosis+under+environmental+change.">Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).</li><li>Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy.">Anatomy.</a> Diseases of Coral. , 85-107 (2015).</li><li>Allemand, D., Tambutt&#233;, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutt&#233;, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+calcification,+cells+to+reefs.">Coral calcification, cells to reefs.</a> Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).</li><li>Rinkevich, B., Loya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Reproduction+of+the+Red+Sea+Coral+Stylophora+pistillata.+I.+Gonads+and+Planulae.">The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae.</a> Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).</li><li>Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corals+use+similar+immune+cells+and+wound-healing+processes+as+those+of+higher+organisms.">Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms.</a> PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).</li><li>Hayes, R. L., Bush, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+observations+of+recovery+in+the+reef-building+scleractinian+coral,+Montastrea+annularis,+after+bleaching+on+a+Cayman+reef.">Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef.</a> Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).</li><li>Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarian+Histology.">Cnidarian Histology.</a> Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).</li><li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals.">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).</li><li>Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+environmental+biology:+Cell+biology+informing+conservation.">Translational environmental biology: Cell biology informing conservation.</a> Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).</li><li>Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+cell+separation+and+isolation+by+fluorescence-activated+cell+sorting+(FACS).">Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).</li><li>Rosental, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+mammalian-like+haematopoietic+system+found+in+a+colonial+chordate.">Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate.</a> Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).</li><li>Silva-Lima, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Symbiodinium+Strains+Are+Hosted+by+the+Brazilian+Endemic+Corals+Mussismilia+spp.">Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp.</a> Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).</li><li>Yvan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+enumeration+of+bacterial+in+the+coral+surface+mucus+layer.">Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer.</a> Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).</li><li>Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching+response+of+Symbiodinium+(zooxanthellae):+Determination+by+flow+cytometry.">Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).</li><li>Baumgarten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+Aiptasia,+a+sea+anemone+model+for+coral+symbiosis.">The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).</li><li>Voolstra, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+genomes+of+Stylophora+pistillata+and+Acropora+digitifera+provides+evidence+for+extensive+differences+between+species+of+corals.">Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Pavlov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+control+of+tuna+fins:+A+role+for+the+lymphatic+system+in+vertebrate+locomotion.">Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion.</a> Science. 357 (6348), 310-314 (2017).</li></ol>

Detta protokoll anpassades från Rosental et al.18 och utvecklades för identifiering och isolering av P. damicornis celler. Metoden fokuserar på processen att filtrera prover för att ta bort skräp, nonviable celler, och Symbiodiniaceae-hosted celler genom undersökning av cell inneboende faktorer, inklusive relativ cellstorlek, relativ cell granularitet, cell autofluorescens, och förekomsten av intakta cellulära membran. Dessa tekniker kan tillämpas på andra korallarter. FACS-stra...

Korallrev är ett av de viktigaste ekosystemen på jorden. De underlättar den biologiska mångfalden genom att tillhandahålla kritiska livsmiljöer för fisk och ryggradslösa djur och är avgörande för att upprätthålla antropogena samhällen genom att tillhandahålla livsmedel och ekonomisk försörjning genom turism1. Som den viktigaste byggaren av korallrev, korall djur (Phylum: Cnidaria) hjälper också kustsamhällen genom att skapa stora kalciumkarbonat ramar som mildrar våg och storm skador2.
Koraller som vuxna är sessile djur som är värd för ett brett spektrum av endosymbiotiska partner, inklusive virus, arkéer, bakterier, protister, svampar, och framför allt, medlemmar av den alg dinoflagellate familjen Symbiodiniaceae3. Förändringar i miljön kan orsaka obalanser i detta samhälle, ofta leder till sjukdomsutbrott och korall blekning där symbiotiska Symbiodiniaceae utvisas från korallkolonin, vilket eliminerar den viktigaste näringskällan för korall. Båda dessa scenarier orsakar ofta död korall värd4,5,6. Effekter av antropogena-inducerad stressfaktorer, såsom snabba klimatförändringar, accelererar massa korall död händelser, vilket leder till en global nedgång av korallrev7.
På senare tid har många olika metoder utvecklats för att lindra korallrev förlust. Dessa metoder inkluderarutplantering av koraller på befintliga rev, genetisk korsning med termiskt toleranta genotyper, och cellulär manipulation av mikrobiella och symbiotiska samhällen värd inom korall8,9. Trots dessa ansträngningar, mycket är fortfarande okänt om korallcell mångfald och cellfunktion10,11,12,13. En grundlig förståelse av korall cell typ mångfald och cellfunktion är nödvändigt att förstå hur korallorganismen beter sig under normativa och stressiga förhållanden. Arbetet med att maximera restaurerings- och bevarandeeffektiviteten kommer att gynnas av en ökad förståelse för hur cellmångfald och genfunktion kopplas ihop.
Tidigare arbete med cellmångfald och cellfunktion har främst fokuserat på histologiska studier och RNA-provtagning i helavävnaden 14,,15,,16,17. För att få mer detaljer om specifika celltyp funktion i koraller, det måste finnas metoder för isolering av specifika populationer av levande korallceller. Detta har gjorts framgångsrikt i icke-klassificerade modellorganismer med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) flödescytometriteknik18. FACS använder en kombination av lasrar inställda på varierande våglängder för att mäta olika endogena cellulära egenskaper på encellig nivå som relativ cellstorlek, cellgranularitet och autofluorescens. Dessutom kan cellerna markeras med fluorescerande märkta föreningar för att mäta specifika, önskade egenskaper18,19.
Hittills har tillämpningen av flödescytometri till korallceller främst varit för analys av symbiotiska Symbiodiniaceae och andra bakteriepopulationer genom att utnyttja deras starka, naturliga autofluorescens20,21,22. FACS har också använts för att uppskatta korallgenomstorlek med hjälp av fluorescerande DNA-markörsignal jämfört med referensmodellorganismcellerna23,24. Effektiv tillämpning av FACS ger tre distinkta verktyg som är användbara för cellbiologi studier: 1) morfologiska och funktionell beskrivning av enskilda celler; 2) Identifiering, separation och isolering av specifika cellpopulationer för studier nedströms; och 3) analys av funktionella analyser på encellig nivå.
Utveckling och tillämpning av olika exogena fluorescerande markörer för studier av korallceller är fortfarande nästan outforskade. Sådana markörer kan innehålla taggade proteiner, taggade substrat för enzymer, eller fluorescerande svar på andra föreningar. Dessa markörer kan användas för att identifiera celltyper som har unika egenskaper, till exempel markera celler som producerar varierande mängder av en specifik cellulär fackfunktion, till exempel lysosomer. Ett ytterligare exempel är användningen av fluorescerande märkta pärlor för att funktionellt identifiera celler som är behöriga för fagocytos, eller uppslukandet av en riktad patogen25. Populationer av celler som är aktiva i immunitet svar kan lätt identifieras av FACS efter uppslukande av dessa exogent tillämpas pärlor. Medan traditionella histologiska metoder kräver bevarad vävnad och många timmar att approximera andelen celler positiva för pärla uppslukande, en FACS-baserad funktionell analys för patogen engulfment kan utföras relativt snabbt på isolerade levande celler. Förutom att studera cellspecifika reaktioner på stress har denna teknik potential att klargöra genspecifika uttryck och belysa celltypernas evolutionära och utvecklingsmässiga historia som är helt unik för cnidarianer, såsom calicoblaster och cnidocyter.
Nyligen utförde vi en intensiv screening av över 30 cellulära markörer som resulterade i att identifiera 24 som kan märka korallceller, varav 16 är användbara för att skilja unika populationer18, vilket gör dem kluster av differentiering (CD). Här beskriver vi processen för korallcell isolering i Pocillopora damicornis från att ta bort celler från kalciumkarbonat skelett till identifiering och isolering av specifika cellpopulationer med FACS (Figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Airbrush Kit &#38; Compressor</td>
			<td>TCP Global</td>
			<td>ABD KIT-H-SET</td>
			<td>Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor &#38; Air Hose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Bulk Reef Supply</td>
			<td>205357</td>
			<td>Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10444</td>
			<td>2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection bag</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>38UV35</td>
			<td>Reloc Zippit 6&#34;L x 4&#34;W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-100ML</td>
			<td>Heat-inactivated at 57 &#176;C for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>pH 7.4; 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352063</td>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations

Korallrev hotas på grund av antropogena stressfaktorer. Den biologiska reaktionen av korall till dessa stressfaktorer kan uppstå på cellnivå, men mekanismerna är inte väl förstådda. För att undersöka korall svar på stressfaktorer, vi behöver verktyg för att analysera cellulära svar. Framför allt behöver vi verktyg som underlättar tillämpningen av funktionella analyser för att bättre förstå hur cellpopulationer reagerar på stress. I den aktuella studien använder vi fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att isolera och separera olika cellpopulationer i steniga koraller. Detta protokoll innehåller: (1) separation av korallvävnader från skelettet, (2) skapandet av en enda cell suspension, (3) märkning korallcellerna med hjälp av olika markörer för flöde cytometri, och (4) gating och cell sortering strategier. Denna metod kommer att göra det möjligt för forskare att arbeta med koraller på cellnivå för analys, funktionella analyser och genuttrycksstudier av olika cellpopulationer.

Sammantaget är detta protokoll användbart eftersom det underlättar identifiering och insamling av levande korallcellpopulationer som kan användas för funktionella analyser. Arbetsflödet började med mekanisk separation av korallvävnader från det underliggande kalciumkarbonatskelettet (figur 1). Detta är en av de viktigaste inledande stegen eftersom felaktig teknik resulterar i hög celldödlighet och kan skapa stora mängder skräp. Enzymatisk separa...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations at JoVE.com

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Koraller skapar biologisk mångfald ekosystem viktiga för både människor och marina organismer. Men vi förstår fortfarande inte den fulla potentialen och funktionen hos många korallceller. Här presenterar vi ett protokoll som utvecklats för isolering, märkning och separation av steniga korallcellpopulationer.

Fluorescensaktiverad cellsortering för isolering av scleractinian cell populationer

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Detta protokoll underlättar identifiering och isolering av levande korall cell populationer på en descriptional nivå inte tidigare möjligt. Den största fördelen med denna teknik är att den ger tillgång till en nivå av cell specificitet som hittills har varit mestadels ouppnåelig. Visar förfarandet kommer att Dr.Shannon Saigh, en forskarassistent från flödet cytometri delade resurs vid Sylvester Comprehensive Cancer Center.För att ställa in flödescytometern för levande korallcellsortering öppnar du en ny projektmall i flödescytmeterns programvara och väljer lämpliga lasrar för analysen i laserpanelen. Skapa sedan en sidospridd kontra framåtspridd plot i lämpliga tomter för att ställa in gating- och analysstrategin. För flödescytmetrisk analys och sortering av de levande korallcellerna, ladda kontrollofläckiga cellprovet i provkammaren på cytometern och starta läsprocessen.Eftersom korallceller är särskilt ömtåliga, hålla cytometertrycket lågt för att förhindra celllys. I scatter-plotten justerar du fotomultiplikatorspänningen så att den centreras med punkterna och börjar registrera händelserna. I den framåt kontra sidan scatter tomt, skapa en grind runt cellerna på runt 10 till 4: e märket på framåt scatter x-axeln.Ersätt kontrollprovet med det första provet av färgade celler och registrera ungefär 10, 000 celler innan du pausar. Därefter grind de händelser som är unika för den färgade provgruppen. För att sortera levande korallceller, efter att ha valt cellpopulationen av intresse i flödet cytometer programvara, placera en mikrocentrifug rör som innehåller 250 till 500 mikroliter av lämplig insamlingslösning i cytometer insamlingskammaren för varje population att sortera.När en lämplig tid har gått att spola ut skräp, börja sortera den önskade befolkningen att samla allt från 10, 000 till flera miljoner celler. Varje gång en ny fläck, art eller sorterare används, sortera minst 20, 000 celler av intresse i 500 mikroliter av färgning medium för att möjliggöra en renhet kontroll som skall utföras på befolkningen av intresse och omanalysera de sorterade cellerna för att bekräfta att händelserna läses inom porten som används för den inledande sortering. För in vitro-studier, lagra sorterade celler på is tills de överförs till en inkubator eller steriliserad miljö.Att ta in andra icke-cellulära partiklar som inte delar samma form eller granularitet som korallcellerna kan tas bort från analysen genom att skapa en grindval på en framåt och sida scatter plot. De döda cellerna kan uteslutas genom att jämföra DAPI-signalen av de obefläckade och färgade cellupphängningar med hjälp av ett histogram och gating ut de höga DAPI-uttrycker celler. Parallellt kan celler som är värd för autofluorescens symbiodeneasia tas bort genom att gating mot celler med den höga signalen i den långt röda kanalen.Efter denna iterativa gating process, de återstående cellerna representerar intakt levande korall cell populationer saknar symbiodeneasia. Dessa celler kan sedan klassificeras i olika cell subpopulationer genom färgning för funktioner som reaktiva syreradikanaktivitet och / eller lysosomen innehåll. Det är viktigt att komma ihåg att vissa celler är mer ömtåliga än andra och att köra denna process så noggrant som möjligt.När specifika celler har isolerats kan de användas för x-vivo funktionella analyser som att etablera cellkulturer och skapa transkriptomiska profiler.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolering och transplantation av hematopoetiska stamceller (HSCs)

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescens Aktiverade cellsortering för växt Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) märkning och Efterföljande Fluorescens Aktiverat cellsortering för kultur-oberoende identifiering av löst organiskt kol-nedbrytande bakterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust generationens Hepatocyte-liknande celler från mänskliga embryonala patientgrupper Stem Cell

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell särskild analys av<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blad Använda fluorescensaktiverad cellsortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Studera Proteolys av cyklin B på den inre cellnivå i hela cellpopulationer

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimerade färgning och spridning modelleringsmetoder för celldelning övervakning med hjälp Färgämnen Cell Tracking

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolering av normala och cancer-associerade fibroblaster från färska vävnader genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sortering av<em&gt; Streptomyces</em&gt; Cell Pellets Använda en komplex Object parametrisk Analyzer och Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering av blod-kärl-härledda multi prekursorer från Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...