Name: fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations
Uploaded: 2020-05-31T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations at JoVE.com

NTK, Bu araştırmayı finanse etmek için Miami Üniversitesi Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Ödülleri'ni kabul etmek istiyorum. BR, Alex ve Ann Lauterbach'a Karşılaştırmalı ve Evrimsel İmmünoloji Laboratuvarı'nı finanse ettiği için teşekkür etmek istiyorum. BR'nin çalışmaları İsrail Bilim Vakfı (ISF) numaraları: 1416/19 ve 2841/19 ve HFSP Research Grant, RGY0085/2019 tarafından desteklenmiştir. Zhanna Kozhekbaeva ve Mike Connelly'e teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Miami Üniversitesi, Miller School of Medicine's Flow Cytometry Paylaşılan Kaynak Sylvester Kapsamlı Kanser Merkezi'nde FACS sitometre erişim ve Shannon Saigh teknik destek için teşekkür etmek istiyorum.

1. Hava fırçası ve kompresör ile mercan iskeletinden dokuların dissosiyatasyonu
NOT: Buz üzerinde adımlar atın ve eldivenile ellerinizi koruyun.
<ol><li>Hava kompresörü, hortum ve airbrush(Şekil 2)bağlayarak airbrush kiti monte edin. Basınç ölçeri 276−483 kPa arasında ayarlayın. NOT: Bu çalışmada kullanılan önerilen kompresör ve hava hortumu maksimum 393 kPa basınca önceden ayarlanmıştı. Bu 276-483 kPa aralığının dışında ...

<ol>
	<li>Bellwood, D. R., Hughes, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional-scale+assembly+rules+and+biodiversity+of+coral+reefs.">Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs.</a> Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).</li><li>Ferrario, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effectiveness+of+coral+reefs+for+coastal+hazard+risk+reduction+and+adaptation.">The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation.</a> Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).</li><li>Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+microbial+community+associated+with+the+coral+Porites+astreoides.">Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides.</a> Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).</li><li>Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+stress+causes+host+cell+detachment+in+symbiotic+cnidarians:+implications+for+coral+bleaching.">Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching.</a> Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).</li><li>Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+infectious+diseases+really+killing+corals?+Alternative+interpretations+of+the+experimental+and+ecological+data.">Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).</li><li>Miller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+disease+following+massive+bleaching+in+2005+causes+60%+decline+in+coral+cover+on+reefs+in+the+US+Virgin+Islands.">Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands.</a> Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).</li><li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+reefs+under+rapid+climate+change+and+ocean+acidification.">Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification.</a> Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).</li><li>Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+zooxanthellae+in+the+thermal+tolerance+of+corals:+A+"nugget+of+hope"+for+coral+reefs+in+an+era+of+climate+change.">The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).</li><li>Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+causes+and+consequences+of+symbiont+shuffling+in+a+multi-partner+reef+coral+symbiosis+under+environmental+change.">Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).</li><li>Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy.">Anatomy.</a> Diseases of Coral. , 85-107 (2015).</li><li>Allemand, D., Tambutt&#233;, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutt&#233;, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+calcification,+cells+to+reefs.">Coral calcification, cells to reefs.</a> Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).</li><li>Rinkevich, B., Loya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Reproduction+of+the+Red+Sea+Coral+Stylophora+pistillata.+I.+Gonads+and+Planulae.">The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae.</a> Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).</li><li>Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corals+use+similar+immune+cells+and+wound-healing+processes+as+those+of+higher+organisms.">Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms.</a> PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).</li><li>Hayes, R. L., Bush, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+observations+of+recovery+in+the+reef-building+scleractinian+coral,+Montastrea+annularis,+after+bleaching+on+a+Cayman+reef.">Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef.</a> Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).</li><li>Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarian+Histology.">Cnidarian Histology.</a> Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).</li><li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals.">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).</li><li>Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+environmental+biology:+Cell+biology+informing+conservation.">Translational environmental biology: Cell biology informing conservation.</a> Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).</li><li>Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+cell+separation+and+isolation+by+fluorescence-activated+cell+sorting+(FACS).">Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).</li><li>Rosental, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+mammalian-like+haematopoietic+system+found+in+a+colonial+chordate.">Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate.</a> Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).</li><li>Silva-Lima, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Symbiodinium+Strains+Are+Hosted+by+the+Brazilian+Endemic+Corals+Mussismilia+spp.">Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp.</a> Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).</li><li>Yvan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+enumeration+of+bacterial+in+the+coral+surface+mucus+layer.">Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer.</a> Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).</li><li>Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching+response+of+Symbiodinium+(zooxanthellae):+Determination+by+flow+cytometry.">Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).</li><li>Baumgarten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+Aiptasia,+a+sea+anemone+model+for+coral+symbiosis.">The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).</li><li>Voolstra, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+genomes+of+Stylophora+pistillata+and+Acropora+digitifera+provides+evidence+for+extensive+differences+between+species+of+corals.">Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Pavlov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+control+of+tuna+fins:+A+role+for+the+lymphatic+system+in+vertebrate+locomotion.">Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion.</a> Science. 357 (6348), 310-314 (2017).</li></ol>

Bu protokol Rosental ve ark.18'den uyarlanmış ve P. damicornis hücrelerinin tanımlanması ve izole edilmesi için geliştirilmiştir. Metodoloji enkaz kaldırmak için örnekleri filtreleme sürecine odaklanır, cansız hücreler, ve Simbiyodiniaceae barındırılan hücreleri hücre içsel faktörlerin incelenmesi yoluyla, göreceli hücre büyüklüğü de dahil olmak üzere, göreceli hücre granüleritliği, hücre otofloresans, ve bozulmamış hücre zarlarının varlığı. Bu t...

Mercan resifleri dünya üzerindeki en önemli ekosistemlerden biridir. Onlar balık ve omurgasızlar için kritik habitatlar sağlayarak biyolojik çeşitliliği kolaylaştırmak veturizm1 ile gıda ve ekonomik geçim sağlayarak antropojenik toplulukların sürdürülmesi için çok önemlidir. Mercan resifleri anahtar oluşturucu olarak, mercan hayvan (Phylum: Cnidaria) da dalga ve fırtına hasarı azaltmak büyük kalsiyum karbonat çerçeveleri oluşturarak kıyı toplulukları yardımcı olur2.
Yetişkinler gibi Mercanlar virüsler, arkeler, bakteriler, protistler, mantarlar ve en önemlisi, algal dinoflagellate aile Symbiodiniaceae3üyeleri de dahil olmak üzere endosimbiyotik ortakları, geniş bir yelpazede ev sahipliği sessile hayvanlardır. Çevredeki değişiklikler bu toplumda dengesizliklere neden olabilir, genellikle hastalık salgınları ve simbiyotik Simbiyodiniaceae mercan kolonisinden atılır mercan ağartma yol açan, böylece mercan için beslenme önemli kaynağı ortadan kaldırarak. Bu senaryoların her ikisi de genellikle mercan konak4,5,6ölüme neden olur. Antropojenik kaynaklı stres etkileri, hızlı iklim değişikliği gibi, mercan resifleri küresel bir düşüşe yol açan, kitle mercan ölüm olayları hızlandırıyor7.
Son zamanlarda, birçok farklı yöntemler mercan resifi kaybını azaltmak için geliştirilmiştir. Bu yöntemler mevcut resifleri mercan outplanting dahil, termal toleranslı genotipler kullanarak genetik geçiş, ve mikrobiyal ve simbiyotik toplulukların hücresel manipülasyon mercan içinde barındırılan8,9. Bu çabalara rağmen, çok mercan hücre çeşitliliği ve hücre fonksiyonu10,11,,12,13hakkında bilinmemektedir . Mercan hücre tipi çeşitliliği ve hücre fonksiyonu nun tam olarak anlaşılması, mercan organizmasının normatif ve stresli koşullar altında nasıl çalıştığını anlamak için gereklidir. Restorasyon ve koruma verimliliğini en üst düzeye çıkarma çabaları, hücre çeşitliliği ve gen fonksiyonunun nasıl birleştiğinin daha iyi anlaşılmasından yararlanacaktır.
Hücre çeşitliliği ve fonksiyonu üzerinde önceki çalışma öncelikle histolojik çalışmalar ve tam doku RNA örnekleme14, 15,15,16,17odaklanmıştır. Mercanlarda belirli hücre tipi fonksiyonu hakkında daha fazla ayrıntı elde etmek için, canlı mercan hücrelerinin belirli popülasyonlarının izolasyonu için yöntemler olması gerekir. Bu floresan-aktive hücre sıralama (FACS) akış sitometri teknolojisi18ile klasik olmayan model organizmalarda başarıyla yapılmıştır. FACS, göreli hücre boyutu, hücre tanecikliliği ve otofloresans gibi tek hücre düzeyinde farklı endojen hücresel özellikleri ölçmek için değişen dalga boylarına ayarlanmış lazerlerin bir kombinasyonunu kullanır. Ayrıca, hücreler belirli ölçmek için floresan etiketli bileşikler ile işaretlenmiş olabilir, istenen özellikleri18,19.
Şimdiye kadar, mercan hücrelerine akış sitometri uygulaması esas olarak güçlü, doğal otofloresan20,,21,22kullanarak simbiyotik Simbiyodiniaceae ve diğer bakteri popülasyonlarının analizi için olmuştur. FACS ayrıca referans model organizma hücreleri23,24karşılaştırıldığında floresan DNA marker sinyali kullanarak mercan genom boyutunu tahmin etmek için kullanılmıştır. FACS'ın etkin uygulaması hücre biyolojisi çalışmaları için yararlı olan üç farklı araç sağlar: 1) tek hücrelerin morfolojik ve fonksiyonel tanımı; 2) kimlik, ayırma ve downstream çalışmalar için belirli hücre popülasyonlarının izolasyon; ve 3) tek hücre düzeyinde fonksiyonel tahlillerin analizi.
Mercan hücrelerinin incelenmesi için çeşitli eksojen floresan belirteçlerin geliştirilmesi ve uygulanması neredeyse keşfedilmemiş kalır. Bu tür belirteçler etiketli proteinler, enzimler için etiketli substratlar veya diğer bileşiklere floresan yanıtları içerebilir. Bu işaretler, belirli bir hücresel bölmesi özelliğinin farklı miktarlarda üretilmesi gibi benzersiz özelliklere sahip hücre türlerini tanımlamak için kullanılabilir. Buna ek bir örnek, fagositöz için yetkin hücreleri işlevsel olarak tanımlamak için floresan etiketli boncukların kullanılması veya hedeflenen bir patojenin yutulmasıdır 25. Bağışıklık yanıtlarında aktif olan hücre popülasyonları, bu eksojen olarak uygulanan boncukların yutulmasından sonra FACS tarafından kolayca tespit edilebilir. Geleneksel histolojik yöntemler korunmuş doku ve boncuk yutma için pozitif hücrelerin yüzdesini yaklaşık saatlerce gerektirirken, patojen yutma için facs tabanlı fonksiyonel test izole canlı hücreler üzerinde nispeten hızlı bir şekilde yapılabilir. Strese karşı hücreye özgü tepkileri incelemenin yanı sıra, bu teknoloji genlere özgü ifadeyi açıklığa kavuşturma ve kalikoblastlar ve cnidositler gibi cnidarianlara tamamen özgü hücre tiplerinin evrimsel ve gelişimsel tarihini aydınlatma potansiyeline sahiptir.
Son zamanlarda, mercan hücrelerini etiketleme yeteneğine sahip 24 tanımlanması ile sonuçlanan 30'dan fazla hücresel belirteçleri yoğun bir tarama yapıldı, 16 tanesi benzersiz popülasyonları ayırt etmek için yararlıdır18, onları farklılaşma kümeleri yapma (CD). Burada, Pocillopora damicornis'teki mercan hücre izolasyonunun kalsiyum karbonat iskeletinden hücrelerin çıkarılmasından belirli hücre popülasyonlarının FACS ile tanımlanması ve izole edilmesine kadar olan süreci açıklıyoruz (Şekil 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Airbrush Kit &#38; Compressor</td>
			<td>TCP Global</td>
			<td>ABD KIT-H-SET</td>
			<td>Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor &#38; Air Hose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Bulk Reef Supply</td>
			<td>205357</td>
			<td>Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10444</td>
			<td>2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection bag</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>38UV35</td>
			<td>Reloc Zippit 6&#34;L x 4&#34;W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-100ML</td>
			<td>Heat-inactivated at 57 &#176;C for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>pH 7.4; 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352063</td>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting for the isolation of scleractinian cell populations

Mercan resifleri antropojenik stres nedeniyle tehdit altındadır. Bu streslere mercan biyolojik tepki hücresel düzeyde oluşabilir, ancak mekanizmaları iyi anlaşılamamıştır. Mercanların strese karşı tepkisini araştırmak için hücresel tepkileri analiz etmek için araçlara ihtiyacımız var. Özellikle, hücre popülasyonlarının strese nasıl tepki verdiğini daha iyi anlamak için fonksiyonel tahlillerin uygulanmasını kolaylaştıran araçlara ihtiyacımız vardır. Mevcut çalışmada, taşlı mercanlarda farklı hücre popülasyonlarını izole etmek ve ayırmak için floresan aktive hücre sıralama (FACS) kullanıyoruz. Bu protokol şunları içerir: (1) mercan dokularının iskeletten ayrılması, (2) tek bir hücre süspansiyonunun oluşturulması, (3) mercan hücrelerinin akış sitometrisi için çeşitli belirteçler kullanarak etiketleme sitometrisi ve (4) gating ve hücre sıralama stratejileri. Bu yöntem, araştırmacıların farklı hücre popülasyonlarının analizi, fonksiyonel tahlilleri ve gen ekspresyonu çalışmaları için hücresel düzeyde mercanlar üzerinde çalışmalarına olanak sağlayacaktır.

Genel olarak, bu protokol, fonksiyonel analizler için kullanılabilecek canlı mercan hücresi popülasyonlarının tanımlanmasını ve toplanmasını kolaylaştırdığı için yararlıdır. İş akışı, mercan dokularının altta yatan kalsiyum karbonat iskeletinden mekanik olarak ayrılması ile başlamıştır (Şekil 1). Bu en önemli ilk adımlardan biridir, çünkü yanlış teknik yüksek hücre mortalitesi ile sonuçlanır ve büyük miktarda enk...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations at JoVE.com

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Mercanlar hem insanlar hem de deniz canlıları için önemli olan biyoçeşitlilik ekosistemleri oluştururlar. Ancak, hala tam potansiyel ve birçok mercan hücrelerinin fonksiyonu anlamıyorum. Burada, taşlı mercan hücre popülasyonlarının izolasyonu, etiketlemi ve ayrılması için geliştirilmiş bir protokol salıyoruz.

Skleraktin Hücre Popülasyonlarının İzolasyoniçin Floresan-Aktive Hücre Sıralaması

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Bu protokol, canlı mercan hücre popülasyonlarının daha önce mümkün olmayan bir açıklama düzeyinde tanımlanmasını ve izole edilmesini kolaylaştırır. Bu tekniğin en büyük avantajı, şimdiye kadar çoğunlukla ulaşılmaz olan hücre özgüllüğü düzeyine erişim sağlar. Prosedürü gösteren Dr Shannon Saigh, sitometri sitometri paylaşılan kaynak Sylvester Kapsamlı Kanser Merkezi'nde bir araştırma görevlisi olacaktır.Canlı mercan hücre sıralaması için akış sitometresini ayarlamak için, akış sitometre yazılımında yeni bir proje şablonu açın ve lazer panelindeki analiz için uygun lazerleri seçin. Daha sonra, gating ve analiz stratejisini ayarlamak için uygun arsalarda bir yan dağılım avere karşı ileri dağılım çizimi oluşturun. Akış sitometrik analizi ve canlı mercan hücrelerinin sıralanması için, kontrol lekesiz hücre örneğini sitometrenin örnek odasına yükleyin ve okuma işlemini başlatın.Mercan hücreleri özellikle kırılgan olduğundan, hücre lisisini önlemek için sitometre basıncını düşük tutun. Dağılım çiziminde, noktaları ortalamak ve olayları kaydetmeye başlamak için fotoğraf çarpanı gerilimini ayarlayın. İleriye karşı yan dağılım çiziminde, hücrelerin etrafında, ileri dağılım x ekseninde 10 ila 4.Kontrol örneğini lekeli hücrelerin ilk örneğiyle değiştirin ve duraklamadan önce yaklaşık 10.000 hücre kaydedin. Daha sonra lekeli örnek grubuna özgü olayları geçit. Canlı mercan hücrelerini sıralamak için, akış sitometre yazılımındaki ilgi hücre popülasyonundan birini seçtikten sonra, her popülasyonun sıralaması için sitometre toplama odasına uygun toplama çözeltisinin 250 ila 500 mikrolitresini içeren bir mikrosantrifüj tüpü yerleştirin.Bir kez zaman uygun bir miktar enkaz dışarı floş geçti, her yerde toplamak için istenilen nüfus sıralama başlar 10, 000 için birkaç milyon hücre. Her yeni leke, tür veya ayıklayıcı kullanıldığında, en az 20.000 ilgi hücresini 500 mikrolitre boyama ortamına sıralayarak ilgi popülasyonu üzerinde saflık kontrolü yapılmasını sağlar ve sıralamalı hücreleri yeniden analiz ederek olayların ilk sıralama için kullanılan kapıda okunduğunu onaylayın. In vitro çalışmalar için, bir kuvöz veya sterilbir ortama transfer edilene kadar buz üzerinde sıralanmış hücreleri saklayın.Mercan hücreleri ile aynı şekil veya tanecikliliği paylaşmayan diğer hücresel olmayan parçacıkları getirmek için, ileri ve yan dağılım çiziminde bir geçit seçimi oluşturarak analizden çıkarılabilir. Ölü hücreler, lekesiz ve lekeli hücre süspansiyonlarının DAPI sinyalini histogram kullanarak karşılaştırarak ve yüksek DAPI ifade eden hücreleri gating ile dışlanabilir. Buna paralel olarak, otofloresan simbiyodenaziyi barındıran hücreler uzak kırmızı kanalda yüksek sinyal ile hücrelere karşı gating tarafından kaldırılabilir.Bu yinelemeli gating işleminden sonra, kalan hücreler simbiyodenazisi eksik bozulmamış canlı mercan hücre popülasyonları temsil eder. Bu hücreler daha sonra reaktif oksijen türleri aktivitesi ve/veya lizozom içeriği gibi özelliklerle boyanarak farklı hücre alt popülasyonlarına sınıflandırılabilirler. Bazı hücrelerin diğerlerinden daha kırılgan olduğunu hatırlamak ve bu işlemi mümkün olduğunca dikkatli bir şekilde yürütmek çok önemlidir.Belirli hücreler izole edildikten sonra, hücre kültürleri oluşturma ve transkripsiyonomik profiller oluşturma gibi x-vivo fonksiyonel denemeler için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

İzolasyon ve Hematopoetik Kök Hücre Transplantasyonu (HKH&#39;lerin)

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) Etiketleme ve Çözünmüş Organik Kültür bağımsız Kimlik sonraki Floresan Aktive Hücre Sıralama Karbon-aşağılayıcı Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Floresans Aktif Hücre Ayırma (FACS) Taze Dokular Normal ve Kanser ilişkili Fibroblastlar İzolasyonu

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sıralanması<em&gt; Streptomyces</emKarmaşık bir nesne Parametrik Analiz ve Ayırıcı Kullanma&gt; Hücre Peletleri

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...