Name: an integrated raman spectroscopy and mass spectrometry platform to study single-cell drug uptake, metabolism, and effects
Uploaded: 2020-01-09T14:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects at JoVE.com

ويشكر المؤلفون توشيو ياناغيدا علي دعمه والصناديق التعاونية الداخلية المنسوبة إلى الدكتور أرنو جيرموند.

<ol>
	<li>Altschuler, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity:+do+differences+make+a+difference?.">Cellular heterogeneity: do differences make a difference?.</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+metabolomics+by+mass+spectrometry:+Advances,+challenges,+and+future+applications.">Single-cell metabolomics by mass spectrometry: Advances, challenges, and future applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. , (2019).</li><li>Bunnage, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Screening+of+Tamoxifen+Abundance+and+Effect+Using+Mass+Spectrometry+and+Raman-Spectroscopy.">Single-Cell Screening of Tamoxifen Abundance and Effect Using Mass Spectrometry and Raman-Spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (4), 2710-2718 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+lipidomics+using+single-cell+Raman+spectroscopy.">In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3809-3814 (2011).</li><li>Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+Raman+observation+of+cytochrome+c+dynamics+during+apoptosis.">Label-free Raman observation of cytochrome c dynamics during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 28-32 (2012).</li><li>Palonpon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+SERS+microscopy+for+molecular+imaging+of+live+cells.">Raman and SERS microscopy for molecular imaging of live cells.</a> Nature Protocols. 8 (4), 677-692 (2013).</li><li>Butler, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Raman+spectroscopy+to+characterize+biological+materials.">Using Raman spectroscopy to characterize biological materials.</a> Nature Protocols. 11 (4), 664-687 (2016).</li><li>Mark, H., Workman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemomtrics in Spectroscopy. , (2018).</li><li>Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+subtraction+of+fluorescence+from+biological+Raman+spectra.">Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra.</a> Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).</li><li>Germond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectral+signature+reflects+transcriptomic+features+of+antibiotic+resistance+in+Escherichia+coli.">Raman spectral signature reflects transcriptomic features of antibiotic resistance in Escherichia coli.</a> Communications Biology. 1, 85 (2018).</li><li>Wold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+Least+Squares+Projections+to+Latent+Structures+(PLS)+in+Chemistry.">Partial Least Squares Projections to Latent Structures (PLS) in Chemistry.</a> Encyclopedia of Computational Chemistry. , (2002).</li><li>Chong, I. G., Jun, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+some+variable+selection+methods+when+multicollinearity+is+present.">Performance of some variable selection methods when multicollinearity is present.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 78, (2005).</li><li>Inde, Z., Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+non-genetic+heterogeneity+on+cancer+cell+death.">The impact of non-genetic heterogeneity on cancer cell death.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1), 99-114 (2018).</li><li>Pan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-probe:+a+miniaturized+multifunctional+device+for+single+cell+mass+spectrometry+analysis.">The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis.</a> Analytical chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).</li><li>Rao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+Single-probe:+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Single+Cell+Analysis+under+Ambient+Conditions.">Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e53911 (2016).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Live+Single-cell+Mass+Spectrometry+with+Spatial+Evaluation+by+Three-Dimensional+Holographic+and+Tomographic+Laser+Microscopy.">Quantitative Live Single-cell Mass Spectrometry with Spatial Evaluation by Three-Dimensional Holographic and Tomographic Laser Microscopy.</a> Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (2), 125-127 (2016).</li><li>Abouleila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+single+cell+mass+spectrometry+reveals+cancer-specific+metabolic+profiles+of+circulating+tumor+cells.">Live single cell mass spectrometry reveals cancer-specific metabolic profiles of circulating tumor cells.</a> Cancer Science. 110, 697-706 (2018).</li><li>Hiyama, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Lipido-Metabolomics+of+Single+Floating+Cells+for+Analysis+of+Circulating+Tumor+Cells+by+Live+Single-cell+Mass+Spectrometry.">Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry.</a> Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 31 (12), 1215-1217 (2015).</li><li>Ryabchykov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+MALDI+Spectrometric+Imaging+and+Raman+Spectroscopic+Data+for+the+Analysis+of+Biological+Samples.">Fusion of MALDI Spectrometric Imaging and Raman Spectroscopic Data for the Analysis of Biological Samples.</a> Frontiers in Chemistry. 6, 257 (2018).</li></ol>

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

في هذه المخطوطة ، تم اختيار حاله بسيطه تعرضت فيها خلايا HepG2 (أو لا) لعقار تاموكسيفين. ومن الواضح ان قدره الطيفية رامان ونظام الطيف الكتلي لرصد اثار تاموكسيفين علي الخلايا. سمح الطيفي رامان تحديد المؤشرات الحيوية المحتملة التي تعكس استجابه عامه من خلايا واحده للتعرض للمخدرات. ولوحظ وجود بعض التباين بين الخلايا المفردة ، مما يوحي بان بعض الخلايا لا تستجيب للتعرض للمخدرات. ومن ناحية أخرى ، كانت اللجنة قادره علي اجراء تحليل مستهدف للدواء والمستقلب الخاص به علي مستوي الخلية الواحدة ، حيث لوحظت درجه عاليه من التغاير في المخدرات ووفره المستقلب. هذا التباين يساعد علي تفسير لماذا تتاثر بعض الخلايا من المخدرات في حين ان البعض الآخر علي ما يبدو لا, علي الرغم من الخلايا الناشئة من السكان موحده يفترض12.
ومن بين جوانب معينه من هذه التقنية التي تتطلب الاهتمام ، من المهم تقييم نوعيه المجهر الاعداد ومعالجه الإشارات لضمان استنساخ البيانات. إذا تم المعالجة المسبقة لأطياف بعناية ، وينبغي تعظيم الاختلافات اشاره في اقصي المحلية لكل ذروه. وعلي النقيض من ذلك ، ينبغي ان يتداخل خط الأساس وحافه الأطياف بين ظروف الخلايا المختبرة. وثمة جانب هام آخر هو النموذج المتعدد المتغيرات المستخدم للتحقيق في الاختلافات بين العلاجات. ويجب علي المرء ان يقيم بعناية النماذج والمعايير النموذجية لضمان تحليل دقيق ودقيق. ميزه واحده من نموذج الثابتة والمتنقلة ، علي عكس الشبكات العصبية ، هو انه يسمح بالوصول إلى الأوزان المرتبطة بكل الطول الموجي (النوبات رامان) التي تميز أفضل الظروف اختبارها من قبل النموذج.
علي الرغم من الطيف الطيفي رامان التمييز بنجاح الاستجابة للمخدرات, وينبغي التاكيد علي ان هذه التقنية محدوده في استخدامها لتوفير التفسير البيولوجي. ويرجع ذلك أساسا إلى تعقيد الاشاره الطيفية ، التي تشمل خليطا من آلاف الجزيئات. ولذلك ، يلزم اجراء مزيد من التحقيقات لتقييم الاختلافات المنهجية بين الكثافة الطيفية لرامان والاختلافات في تركيزات المخدرات. أيضا ، هناك حاجه إلى دراسات مماثله لخطوط الخلايا الأخرى لتقييم تعميم المؤشرات الحيوية الطيفية المرتبطة تاموكسيفين.
وعلاوة علي ذلك ، قد يكون من المهم اجراء قياسات الانسجه الحية لتقييم الدوائي ودراسة كيفيه تغلغل المخدرات وتدفقها داخل كل خليه. وعلاوة علي ذلك ، تجدر الاشاره إلى ان خطوه أخذ العينات في المركز المذكور تعتمد إلى حد كبير علي مهارة المشغل. المعلمات مثل الدقة المكانية ، ووضع الخلية داخل الشعرية بعد أخذ العينات ، وقوه الانتاجيه هي بالبالكامل المشغل التابعة ، والتي تحد من اعتماد واسعه النطاق من LSC-MS. وعلي الرغم من ان نظم أخذ العينات المؤتمتة قد تخفف من هذه المسالة. وعلاوة علي ذلك ، في حين تتفوق LSC-MS في أخذ العينات الملتصقة أو الخلايا العائمة في الدول الاصليه ، فانه يؤدي أكثر سوءا في الخلايا أخذ العينات جزءا لا يتجزا من أقسام الانسجه. ويرجع ذلك إلى ميل الشعيرات الشعرية العينة لكسر إذا كانت كثافة العينة عاليه. ولذلك ، فان نهجا آخر مثل التحقيق الوحيد قد يكون أكثر ملاءمة في مثل هذه الحالات14،15.
منذ يتم أخذ عينات من الخلايا المستخدمة هنا في الظروف المحيطة مع الحد الأدنى من اعداد العينة ، يمكن دمج LSC-MS بسهوله مع التكنولوجيات الأخرى ، كما هو مبين من خلال دمجها مع رامان في هذا البروتوكول. وقد سمح تكامل مماثل آخر مع التصوير الثلاثي الابعاد لتحقيق الكمية المطلقة من نواتج الأيض الخلوية علي مستوي الخلايا الفرعية16. بالاضافه إلى ذلك, التكامل مع تدفق الخلوي سمح للكشف عن المؤشرات الحيوية الايضيه في واحده الخلايا السرطانية المنتشرة من مرضي السرطان الورم الارومي العصبي17,18.
وفي المستقبل ، وبسبب الاهتمام المتزايد مؤخرا بالجمع بين مجموعات البيانات من طرائق التصوير19، قد يكون من المهم أيضا دراسة الاختلافات المنهجية بين إشارات رامان ونتائج قياس الطيف الكتلي (بالاضافه إلى أساليب القياس الأخرى) باستخدام النهج الحسابية التكاملية. ومن المثير للاهتمام ، لقد وجدنا بالفعل العديد من الارتباطات الخطية الضعيفة ولكن الهامه بين كثافة القمم رامان التي حددتها درجات كبار الشخصيات ووفره من تاموكسيفين أو المستقلب في مستوي خليه واحده كما حددت MS4. قد تشير هذه البيانات إلى وجود علاقة ايضيه بين ملفات تعريف MS وأطياف رامان وامكانيه التنبؤ بهذه القيم.

تستجيب الخلايا بشكل مختلف للتغيرات في بيئتها الصغرى علي مستوي الخلية الواحدة ، وهي ظاهره تسمي التغاير الخلوي1. وعلي الرغم من هذا ، فان دراسات اكتشاف المخدرات الحالية تستند إلى قياسات متوسطه لسكان الخلايا ، والتي تشوش المعلومات حول السكانالفرعيين المحتملينوكذلك الاختلافات في الخلية الواحدة 2. قد تفسر هذه المعلومات المفقودة لماذا بعض الخلايا أكثر عرضه للادويه بينما البعض الآخر مقاوم. ومن المثير للاهتمام ، ان نقص المعلومات أحاديه الخلية عن الاستجابة للمخدرات هو سبب محتمل لفشل المرحلة الثانية التجارب السريرية للمخدرات3. لذلك ، لمعالجه هذه المشكلة ، يجب قياس التفاعلات الخلوية مع الدواء (اي ، الامتصاص ، الأيض ، والاستجابة) علي مستوي الخلية الواحدة.
ولتحقيق ذلك ، قمنا بتصميم نظام فريد من نوعه يتم فيه فحص الخلايا الحية الوحيدة باستخدام الطيف الطيفي رامان الخالي من التسمية ، ثم يتميز باستخدام الطيف الكتلي4. الطيفي رامان يوفر بصمه الجزيئية للدولة الخلوية, طيف معقده الناتجة عن مساهمات العديد من الجزيئات داخل الخلية. علي الرغم من هذا تعقيد, هو يستطيع كنت اعتبرت ان [رامان] بصمات يعكس بنيه خليه كامله وأيض5,6. الطيفي رامان تتفوق في قياس الدول الخلوية في طريقه الانتاجيه غير الغازية وعاليه نسبيا ، مما يجعل من المفيد لفحص وتقييم الاستجابة للمخدرات علي مستوي خليه واحده.
وعلي النقيض من ذلك ، توفر الMS الحساسية المطلوبة والانتقائية لقياس امتصاص المخدرات علي مستوي الخلية الواحدة. بما ان MS هو مدمر (يتم استهلاك عينه [خليه] عاده اثناء التحليل) ، ودمجها مع غير تدميري ، والتصنيف الطيفي رامان الخالية من التسمية يمكن ان توفر إنتاجيه عاليه ونظام حساس. هذه المنصة مجتمعه قادره علي توفير المزيد من المعلومات حول امتصاص المخدرات, الأيض, والآثار علي مستوي خليه واحده.
توضح هذه المخطوطة بروتوكولا يستخدم لدراسة التفاعلات الخلوية مع المخدرات علي مستوي الخلية الواحدة باستخدام الثقافات الانبوبيه باستخدام منصة رامان-MS متكاملة. للقيام بذلك ، يتم استخدام خلايا سرطان الخلية الكبدية (HepG2) و تاموكسيفين كنموذج. تم اختيار الخلايا HepG2 لأنها تاخذ تاموكسيفين واستقلاب المخدرات, وتتاثر في وقت واحد بسبب اثارها سميه كبديه. وتستخدم دولتان في هذه المخطوطة: الخلايا المعالجة بالمخدرات مقابل الخلايا غير المعالجة (السيطرة).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% penicillin-streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass bottom grid dish</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxy Tamoxifen standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm diode pumped solid-state laser</td>
			<td>Ventus, Laser Quantum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOS-L101T-S motorized microscope stage</td>
			<td>OptoSigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-2 cellomics coated sampling capillaries</td>
			<td>HUMANIX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d5-Tamoxifen standard</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide LC-MS grade</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf GELoader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone laboratories</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cell line (RCB1886)</td>
			<td>RIKEN cell bank center</td>
			<td>RCB1886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC0-19A1C Incubator</td>
			<td>Sanyo Electric Co.</td>
			<td>MC0-19A1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1060352500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMO-203 3-D Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MMO-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoflex nano-ESI adaptor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-stage incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce LTQ Velos ESI calibration solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIXIS BR400 cooled CCD camera</td>
			<td>Princeton Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail collagen coating solution</td>
			<td>Cell Applications Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85256</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated raman spectroscopy and mass spectrometry platform to study single-cell drug uptake, metabolism, and effects

ومن المعروف ان الخلايا غير متجانسة بطبيعتها في ردودها علي المخدرات. ولذلك ، فانه من الضروري ان يتم احتساب تغاير أحاديه الخلية في دراسات اكتشاف المخدرات. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق قياس عدد كبير من التفاعلات الخلوية بين الخلية والمخدرات علي مستوي خليه واحده (اي امتصاص المخدرات ، والأيض ، والتاثير) بدقه. تصف هذه الورقة نظاما طيفيا أحادي الخلية من رامان والطيف الكتلي (MS) لرصد التغيرات الايضيه في الخلايا ردا علي المخدرات. باستخدام هذا النظام الأساسي ، يمكن قياس التغيرات الايضيه في الاستجابة للدواء بواسطة الطيفي رامان ، في حين ان المخدرات والمستقلب لها يمكن تحديدها كميا باستخدام الطيف الكتلي في نفس الخلية. وتشير النتائج إلى انه من الممكن الوصول إلى المعلومات حول امتصاص المخدرات, الأيض, والاستجابة علي مستوي خليه واحده.

تحليل خليه واحده من التفاعلات المخدرات (امتصاص, الأيض, والآثار) أمر ضروري في الكشف عن اي السكان الفرعية الخفية أو مقاومه للادويه ، فضلا عن فهم اثار التغاير الخلوي. في هذا البروتوكول ، تم استخدام اثنين من التقنيات التكميلية لقياس التفاعلات المذكورة أعلاه في خلايا واحده: الطيفي رامان والتصلب البيولوجي MS راما يحدد بسرعة الخلايا المتضررة من المخدرات استنادا إلى المؤشرات الحيوية الطيفية للاستجابة للمخدرات. تستخدم MS لمراقبه امتصاص المخدرات واستقلابها بطريقه انتقائية وشبه كميه. تم فحص الخلايا أولا بواسطة التحليل الطيفي رامان ثم عينات فرديه للتحليل من قبل MS.
ويرد في الشكل 2تحليل مقارن لمتوسط طيف كل حاله (مع المعالجة بالعقاقير وبدونها). الطيف المتوسط للظروف اثنين تختلف بوضوح في قمم مختلفه ، والتي تم تحديدها سابقا وتعيينها إلى المركبات الجزيئية2. علي وجه الخصوص ، وقمم في 1000 سم-(المخصصة للمركبات العطرية مثل فينيلالانين والتيروزين) تظهر اختلافات قويه. وينبغي تقييم اهميه الفرق الإحصائي باجراء المزيد من التحليلات المتعددة المتغيرات.
ثم استخدمت مجموعه البيانات لتدريب نموذج الثابتة والمتنقلة (الخطوات 4.5-4.8) تهدف إلى التمييز بين العلاجات الخلية اثنين (مع المخدرات: ن = 290 ، دون المخدرات: ن = 115). بلغت القدرة التنبؤيه لتصنيف الخلايا المستزرعة في وجود تاموكسيفين 100 ٪ حساسية و 72 ٪ خصوصية في بيانات الاختبار (غير معروف من النموذج المدرب عبر التحقق من صحة). الحساسية هي مقياس لإيجابيات حقيقية التي يتم تحديدها بشكل صحيح من قبل النموذج ، في حين ان الخصوصية هي مقياس لسلبيات الفعلية التي يتم تحديدها من قبل النموذج. النماذج البديلة مثل SVMs ، LDAs ، والشبكات العصبية قد توفر نتائج مماثله أو أفضل ، علي الرغم من انه لم يتم اجراء مقارنه شامله في هذه الدراسة.
استنادا إلى نموذج الثابتة والمتنقلة ، تم حساب عشرات كبار الشخصيات ، والتي تمثل اهميه الأطوال الموجية (التحولات رامان) في التمييز بين الظروف التجريبية (الشكل 3). والاهم من ذلك ، كانت اعلي قمم الملفات الشخصية للشخصيات الهامه تناظر قمم رامان التي شهدت اختلافات قويه بين العلاجين. وهذا يؤكد الاختلافات الجزيئية المحددة بين الخلايا المعالجة وغير المعالجة. التالي ، يمكن للباحثين تحديد المؤشرات البيولوجية الطيفية المحتملة التي تعكس استجابه الخلايا المفردة لعلاج المخدرات. ويمكن اختبار هذه المؤشرات الحيوية بشكل أكبر للتحقق من أهميتها البيولوجية وتعميمها عبر مختلف الظروف وخطوط الخلايا.
وكان نظام قياس الطيف الكتلي (LSC-MS) الحي وحيد الخلية قادرا علي الكشف عن كل من المخدرات ونواتجها في خلايا HepG2 الوحيدة المعالجة بالمخدرات التي كانت تقاس سابقا بواسطة الطيفي رامان. الاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام MS ترادفي لتاكيد بنيه كل من الجزيئات. بعد التحديد الإيجابي ، تم قياس الوفرة النسبية للدواء ونواتجه في كل خليه ومقارنه بالقمم الخلفية في الخلايا غير المعالجة. لوحظ اختلاف قوي في وفره تاموكسيفين ، وكانت هذه الظاهرة أكثر وضوحا في حاله المستقلب ، 4-OHT (الشكل 4). ودرست أيضا العلاقة بين وفره تاموكسيفين ونواتجه ، والتي تم العثور علي ارتباط إيجابي كبير بين الاثنين (r = 0.54 ، p = 0.0001 ، n = 31).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig1.jpg"> الشكل 1: نظام انتقاء الخلايا المثبت علي مرحله المجهر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig2.jpg"> الشكل 2: متوسط طيف الخلايا المعالجة بالمخدرات (مع تاموكسيفين: n = 295) والخلايا غير المعالجة (بدون تاموكسيفين: n = 115). ويمكن تحديد قمم رامان من الأدب. معظم الاختلافات الطيفية القوية ذات دلاله احصائيه (ANOVA ، p ≤ 0.5) كما هو موضح سابقا4. وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig3.jpg"> الشكل 3: علامات كبار الشخصيات المستخرجة من نموذج الثابتة والمتنقلة التنبؤيه. علامات كبار الشخصيات تعكس الأطوال الموجية التي تسهم في التمييز بين فئتين في النموذج. وتتوافق معظم القمم مع الجزيئات المحددة التي تلاحظ كمؤشرات بيولوجية طيفيه لأثار المخدرات علي الخلايا المعالجة بالمخدرات. وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig4.jpg"> الشكل 4: توزيع وفره تاموكسيفين والمستقلب. توزيع الوفرة تاموكسيفين والمستقلب ، 4-OHT (تقاس علي مستوي خليه واحده) بالمقارنة مع القمم الذاتية في الخلايا غير المعالجة (السيطرة). وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects at JoVE.com

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

هذا البروتوكول يقدم متكاملة رامان الطيفي-كتله الطيف (MS) المنصة التي هي قادره علي تحقيق دقه خليه واحده. يمكن استخدام التحليل الطيفي لرامان لدراسة الاستجابة الخلوية للادويه ، في حين يمكن استخدام MS للتحليل الكمي والمستهدف لامتصاص المخدرات والأيض.

والتحليل الطيفي رامان المتكاملة وكتله الطيف الكتلي لدراسة امتصاص المخدرات خليه واحده, الأيض, والآثار

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

قمنا بتطوير طريقة مبتكرة لمتقلبات الاستقلاب. جمعنا التصوير الطيفي لخلايا حيّة مع قياس الطيف الكتلي أحادي الخلية. يمكن لتقنيتنا مراقبة وتنبؤ التغيرات الأيضية للخلايا الفردية ضد الأدوية.وهذا يفتح الكثير من التطبيق لأساسيات البحوث والصناعة. طريقتنا يضيف القرار خلية واحدة لتقنيات تقييم المخدرات الحالية التي سوف تساعد كثيرا في المستقبل جهود اكتشاف المخدرات. ويمكن أن تساعدنا تقنيتنا أيضًا على فهم الدور الذي تلعبه التجانس الخلوي في مقاومة السرطان.إن أخذ العينات من خلية واحدة وتحليل البيانات هما أكثر الجوانب تحدياً في هذه التجربة. ونحن نعمل حاليا على أتمتة هاتين الخطوتين، وخاصة جزء أخذ العينات. نوصي بممارسة أخذ عينات الخلية الواحدة قبل التجربة، حيث أن كل إعداد ميكرومانيبولاتور مختلف قليلاً ويجب أن تأخذ الوقت للتعرف على عناصر التحكم.بعد احتضان الخلايا للوصول إلى التقاء 70٪، والخلايا الثقافة من الفائدة في وسائل الإعلام المناسبة الثقافة، إضافة البنسلين-ستريبتوميسين لتجنب التلوث. بعد قياس كثافة الخلايا على مقياس الهيموسيت، خلايا الزراعة الفرعية في طبق شبكة قاع الزجاج 35 ملليمتر أو شرائح الكوارتز، باستخدام نفس المتوسطة بكثافة البذر من 0.7 مرة 10 إلى السادس. ثم احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.في اليوم التالي، الخلايا تصل إلى التقاء 50 إلى 60٪ غسل الخلايا مرتين مع العازلة برنامج تلفزيوني قبل warmed في 37 درجة مئوية. تقسيم الخلايا إلى مجموعات فرعية المخدرات المعالجة وغير المعالجة في أطباق ثقافة 35 ملليمتر. مزيج تاموكسيفين حل في ثنائيثيل السلفوكسيد مع وسائل الإعلام الثقافة للحصول على حجم النهائي من ملليلتر اثنين وتركيز تاموكسيفين من 10 ميكرومولار.هذه هي المجموعة المعالجة من المخدرات امزج حجم المقابلة من DMSO في المتوسط كمجموعة مراقبة لدراسة آثار DMSO. احتضان كلتا المجموعتين في مليلترين من الوسائط ارتفعت لمدة 24 ساعة للوصول إلى التقاء 70 إلى 80٪ قبل القياسات الطيفية، والتحقق من ثقب الثقب ومباراة الليزر باستخدام هدف.لمعايرة مقياس الطيف قبل كل تجربة، ضع الإيثانول في طبق قاع زجاجي، وقياس الطيف بكثافة ليزر معينة لثانية واحدة، وربط الذروة لأطوال موجية معروفة. ثم قم بإعداد الغرفة الدقيقة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية. مرة واحدة في نظام المجهر جاهز، وإزالة الخلايا من الحاضنة وشطف الخلايا على الفور مرتين مع عازلة برنامج تلفزيوني دافئ في 37 درجة مئوية.ثم أضف ملليلترين من برنامج تلفزيوني دافئ أو فلوروبريت DMEM. إضافة 10 ميكرولترات من الماء على عدسة الهدف الغمر المياه. ووضع بدقة طبق الخلية أسفل الزجاج على مرحلة المجهر.إصلاح نظام أخذ عينات الخلايا على المجهر رامان. قم بتوصيل المايكرو مانايبولاتور ثلاثي الأبعاد بصاحب الشعر الشعري الزجاجي الذي يتم إرفاقه بحقنة فارغة لمص العينة. تعيين المجهر إلى حقل التكبير عالية من 40 مرات لمراقبة غيض من الشعرية الزجاجية، وتأكد من أنها ليست مكسورة.السيطرة على موقف من الشعرية الزجاجية باستخدام micromanipulator. تأكد من أن رأس الشعيرات الدموية يتركز في مجال الرؤية. ثم نقل الشعيرات الدموية على محور Z لإعطاء إزالة طبق الثقافة في وقت لاحق.ضع طبق العينة على خشبة المجهر، وضبط التكبير والتركيز، وحدد الخلية المستهدفة على طبق الشبكة، ونقلها إلى مركز الرؤية. قياس كل خلية من خلال التركيز على خط الليزر. ويكفي الوقت الذي يُعاني منه كل خلية 15 ثانية للحصول على مقطع عرضي من خلية مع إشارة Raman واضحة.مرآة غالفانو يسمح المسح الضوئي لخلية واحدة أو مجموعة من الخلايا في غضون عدة عشرات من الدقائق. ثم خفض بعناية أسفل الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام micromanipulator حتى تلميح يأتي في التركيز. تحت المراقبة المجهرية، المس الخلية المفردة المستهدفة مع طرف الشعيرات الدموية.ثم ابدأ في تطبيق الضغط السلبي باستخدام الحقنة لاعتراض الخلية داخل طرف الشعيرات الدموية. تسجيل هذا الإجراء عن طريق اتخاذ شريط فيديو للتحقق من توقيت وموقع امتص من الخلية على وجه التحديد. نقل الشعرية على محور Z.ثم فصل الشعرية من حامل الشعيرات الدموية باستخدام ملقط استعدادا لتحليل الطيف الشامل. بعد إعداد أداة قياس الطيف الشامل وتحليل الوسائط ، أضف اثنين من ميكرولترات المذيبات المؤينة إلى الشعيرات الدموية التي تحتوي على الخلية. إصلاح الشعيرات الدموية إلى محول نانو كهربية متصلة بمطياف الكتلة مناسبة وبدء أسلوب الاستحواذ التلقائي.ويرد هنا تحليل مقارن لمتوسط طيف كل حالة، مع العلاج من المخدرات أو بدونه. ويختلف متوسط طيف الشرطين بوضوح عند قمم مختلفة. على وجه الخصوص، فإن القمم في 1،000 في سنتيمتر واحد، وهو علامة على المركبات العطرية مثل الفينيلالين والتيروزين، تظهر اختلافات قوية.واستناداً إلى الإسقاط على نموذج الهيكل الكامن، تم حساب درجات كبار الشخصيات التي تمثل أهمية الأطوال الموجية في التمييز بين الظروف التجريبية. الأهم من ذلك، تتوافق أعلى قمم ملفات تعريف كبار الشخصيات مع قمم رامان التي شوهدت اختلافات قوية بين العلاجين. وهذا ما أكد الاختلافات الجزيئية المحددة بين الخلايا المعالجة وغير المعالجة.بعد تحديد إيجابي ، تم قياس الوفرة النسبية للدواء واستقلابه في كل خلية ومقارنتها بالذرات الخلفية في الخلايا غير المعالجة. لوحظ تباين قوي في وفرة تاموكسيفين. وكانت هذه الظاهرة أكثر وضوحا في حالة المستقلب 4-هيدروكسي تاموكسيفين.يمكن للباحثين أن يكونوا مهتمين باستكشاف الصلة بين الصور الطيفية وملامح التمثيل الغذائي للخلايا. كما أن أبحاثنا لها تطبيقات صناعية لأنها تسمح بالفحص المحلي للخلايا لتصنيع الأدوية. يجب توخي الحذر أثناء إعداد المذيبات المؤينة لقياسات مطياف الكتلة.يجب أن تكون مستعدة تحت غطاء الدخان. أيضا، يجب الحرص على عدم لمس مصدر أيون من جهاز مطياف الشامل لتجنب التعرض للصعق بالكهرباء. وأخيراً، فإن الشعيرات الدموية المستخدمة في جميع أنحاء القياس حادة جداً، لذلك تعامل معها بعناية لتجنب الإصابة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless شعري الكهربائي-الطيف الكتلي لالاستقلابية من التنميط العينات البيولوجية

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

افتعال أشعة فوق البنفسجية فيس ورامان الطيفي المناعية منصة

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

إعداد عينة البلازما لقياس الطيف الكتلي باستخدام محطة عمل آلية

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...