Name: an integrated raman spectroscopy and mass spectrometry platform to study single-cell drug uptake, metabolism, and effects
Uploaded: 2020-01-09T14:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects at JoVE.com

Forfatterne takker Toshio Yanagida for hans støtte og RIKEN interne samarbejds fonde tilskrives Dr. Arno Germond.

1. cellekultur
<ol><li>Kultur celler af interesse i en passende kultur medier. Penicillin-streptomycin kan tilsættes for at undgå kontaminering. I tilfælde af HepG2 celler, kultur celler i en kultur medier, der indeholder Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 10% føtal kvægserum (FBS) og 0,1% penicillin-streptomycin. For at faciltate Raman spektroskopi målinger, celler kan dyrkes på en 0,1% gelatine-coated glas-bund skål eller kvarts slides.</li>
	<li>Inkubér cellerne i 2 dage ved 37 °C og 5% CO2 i en befuret inkubator.</li>
	<li>Synkroniser cellekulturer for at nå 70% confluency.</li>
	<li>Subkultur celler i en 35 mm glasbunden gitter skål eller kvarts glider med samme medium ved en såning tæthed på 0,7 x 106, derefter inkubere ved 37 °c for 24 h. Bemærk: kultur retter eller rutsjebaner kan prælakeres med kollagen eller gelatine belægning opløsning med et kultur overfladeforhold på 5 ug/cm2 for at give dem mulighed for at fastsætte, sikre deres overlevelse under målingen.</li>
</ol>2. behandling af lægemidler
<ol><li>Fjern cellekulturer fra inkubator og vask 2x med forvarmede PBS buffer (37 °c). Bemærk: det er optimalt at fjerne celler til behandling af lægemidler ved en konfluency på 50%-60%.</li>
	<li>Opdel cellerne i stof behandlede og ubehandlede undergrupper i 35 mm kultur retter.</li>
	<li>Bland det foretrukne stof med kultur medierne. For eksempel opløses Tamoxifen i dimethylsulfoxid (DMSO) og blandes med kulturmediet for at opnå et endeligt volumen på 2 mL og Tamoxifen koncentration på 10 μM. Dette vil være den stof-behandlede gruppe.</li>
	<li>Bland et tilsvarende volumen opløsningsmiddel (DMSO) ind i mediet som en kontrol for at undersøge virkningen af DMSO. Dette vil være kontrolgruppen.</li>
	<li>Inkuber begge grupper i 2 mL af de spidsede medier, som er forberedt i trin 2.3-2.4 for 24 timer. Den forventede konfluency efter inkubation bør være 70%-80%.</li>
</ol>3. Raman spektral billeddannelse og spektral bearbejdning
Bemærk: selv om Raman spektroskopi systemer er kommercielt tilgængelige, Raman spektroskopi system, der anvendes her, er et hjem-bygget line-scanning confokale mikroskop tidligere beskrevet7,8. Kort, dette system er udstyret med en 532 nm diode pumpet solid-state laser. Laserlys er formet til et fly ved hjælp af en cylindrisk linse, som tillader måling af 400 spektre i en enkelt eksponering. Raman Spectra blev indspillet ved hjælp af et afkølet CCD-kamera monteret på en polychromator, der bruger en 1.200 riller/mm rist til at maksimere spektral opløsningen af fingeraftryks området (fra 500-1800 cm-1). Dette spektralområde indeholder en høj tæthed af frekvenser, der er specifikke for molekyler, som genererer Raman spredning. En vand-immersionobjektiv linse (NA = 0,95) anvendes også. Den rumlige opløsning af dette system er ~ 300 Nm og spektral opløsningen er 1 cm-1. For at sikre cellens overlevelse under forsøget anvendes et mikrokammer, der er fastgjort på et motoriseret mikroskop stadie.
<ol><li>Før spektral målinger skal du kontrollere optikkens justering. Et 50 μm-pinhul kan bruges til at kontrollere, at pinhullet og laser positionen matcher nøjagtigt. Indtast Spektrofotometer slids når indsnævret så meget som muligt.</li>
	<li>Brug ethanol til at kalibrere spektrofotometeret før hvert eksperiment. For at gøre det skal du placere EtOH i en glasbunden skål, måle spektret ved en given laser intensitet (målt ved prøve) for 1 s, og associere toppen til kendte bølgelængder7.</li>
	<li>Minimer laser intensiteten ved prøven til ~ 2,4 mW/μm2 , så cellerne overlever laser eksponering.</li>
	<li>Indstil mikrokammeret ved 5% CO2 og 37 °c.</li>
	<li>Når mikroskopet er klar, skal du fjerne cellerne fra inkubator og straks skylle cellerne 2x med varmet PBS (37 °C) buffer og derefter tilføje 2 mL varmet PBS (37 °C) eller DMEM for at resuspendere cellerne. BEMÆRKNINGER: både PBS og FluoroBrite DMEM-baserede medier er tilstrækkelige muligheder for målinger af Raman-spektroskopi, fordi de giver et minimalt baggrunds signal.</li>
	<li>Tilsæt 10 μL vand på objektivlinsen til vand sænkning, og Placer forsigtigt den glas baserede celle skål på mikroskop stadiet.</li>
	<li>Mål hver celle ved at fokusere laserlinjen. En 15 s eksponeringstid pr. celle er tilstrækkelig her til at opnå et tværsnit af en celle med et klart Raman-signal. En Galvano spejl tillader scanning af en celle eller en gruppe af celler inden for flere dusin minutter. NOTER: højere opløsning af fuld spektral billeddannelse af celler kræver mere tid og kan føre til foto skade. Her blev cellerne målt ved hjælp af en enkelt linje eksponering for at opnå et tværsnit af hver celle. Denne fremgangsmåde er en god trade-off for at øge gennemløb og indhente tilstrækkelige oplysninger til at diskriminere celler, samtidig med at cellelevedygtighed sikres ved at begrænse foto skader.</li>
</ol>4. forbehandling af spektraldata og multivariat analyser
Bemærk: forbehandling er et nødvendigt skridt forud for yderligere analyse for at fjerne uønskede tekniske variationer inden for spektraldata. På grund af mangfoldigheden af de metoder og software, kan en udtømmende liste ikke gives, og der er mange nyttige anmeldelser findes i litteraturen7,8. I dette afsnit beskriver vi kort den metode, der anvendes til at analysere og fortolke spektral Raman data opnået fra levende enkeltceller.
<ol><li>Udtræk og Forbehandl Raman-billeder for at fjerne eventuel kosmisk stråle interferens. Bemærk: spektral akse af spektre opnået i forskellige dage/uger/måneder kan omfatte nogle variationer på grund af små tekniske variationer under kalibrering ved hjælp af ethanol. Dette vil indvirke kraftigt på de efterfølgende multivariat analyser og statistiske sammenligninger. I tilfælde af, at eksperimenter udføres i forskellige uger/måneder, forventes små optiske variationer. I dette tilfælde skal data interpoleres for at korrigere for eventuelle spektral forskydninger af data på tværs af eksperimenter. Interpolation ved hjælp af kubisk spline bruges her. Efter dette trin skal alle spektrakser justeres. Der tages hensyn til en række 500-1800 cm-1 til efterfølgende analyse.</li>
	<li>Uddrag spektraldata af celler og baggrund (fravær af celler) fra hvert billede ved hjælp af en hjemmelavet algoritme. Træk baggrunds signalet fra cellens signal. Derefter gennemsnit spektrene af de resterende pixels, som skal svare til en enkelt celle. Følgende trin udføres ved hjælp af 2D-spektre af celler.</li>
	<li>Udfør en oprindelig korrektion ved hjælp af ModPoly9 eller en anden algoritme, der skønnes at passe tilstrækkeligt. Trim spektral området til 600-1700 cm-1 for at vælge fingeraftryks området og sikre, at der ikke er nogen uønskede kanteffekter på spektrene på grund af dårlig polynomiel montering.</li>
	<li>Udfør et normaliserings trin som vektor normalisering (intensiteten ved hvert wavenumber divideres med den globale L2-norm eller den maksimale ental-værdi for et spektrum) for at normalisere spektral intensiteten10, selvom andre normaliseringer kan overvejes.</li>
	<li>Forbered et datasæt med den relevante etiket for hver klasse/betingelse. Bemærk: sammenlignende spektral analyser kan perforeret for at undersøge karakteren af mulige forskelle mellem celle klasse/betingelser (f. eks. ved at fratrække kontrolgruppens gennemsnitlige spektrum til andre grupper for at identificere områder af interesse [såsom potentielle biomarkører]). ANOVA og Fisher scores beregninger kan også udføres10.</li>
	<li>For at identificere behandlede og ubehandlede celler baseret på spektral egenskaber kan der anvendes multivariat analyser. En normaliseret spektraldata bør bruges som et trænings datasæt, og et ukendt datasæt (uden etiket) fra et replikat eksperiment bør anvendes som testdata, hvis det er muligt. Bemærk: diskriminant analyse udført på nogle vektor af en hovedkomponent analyse (PCA-DA10), projektion på latente scores efterfulgt af diskriminant analyse (pls-da), og støtte vektor maskiner (SVM)11 er modeller ofte anvendes i marken, og hver præsenterer forskellige statistiske overvejelser. Forbehandling af data bør derfor udføres.</li>
	<li>Brug maskinel indlæring, der passer til de eksperimentelle mål. Her er en projektion på latent struktur (PLS) model bygget ved hjælp af spektral fingeraftryks området Raman Spectra (600-1710 cm-1)11,12. Middel-centrer dataene, hvis det er nødvendigt. Ved kryds validering af modellen kan der anvendes forskellige teknikker. Bemærk: her anvendes en venetiansk blind kryds validering med 10 opdelinger. Model kompleksitets kompleksitet (antal komponenter eller latent variabel) skal testes, så den bedste model minimerer værdien for roden af den gennemsnitlige kvadratiske fejl (RMSE). Det konstateredes, at tre latente vektorer (LVs) gav den bedste diskrimination med vores datasæt.</li>
	<li>Identificer hvilke Raman spektral toppe bidrager til diskrimination af cellerne (f. eks. ved at afbilde score af variabel betydning i projektion [VIP] for hver Raman wavenumber eller størrelsen af regressions koefficienten). BEMÆRKNINGER: VIP-scoren for en variabel beregnes som en vægtet sum af de kvadrerede korrelationer mellem PLS-DA-komponenterne og den oprindelige variabel. Detaljer om pls og VIP scores algoritme kan findes i litteraturen11,12.</li>
</ol>5. opsætning af enkelt celle prøvetagning og procedurer
<ol><li>Fastgør celle prøvetagningssystemet på Raman-mikroskop som vist i figur 1. Tilslut 3D micromanipulator til glas kapillar holderen, der er fastgjort til en tom sprøjte til prøve sugende ved at anvende negativt tryk (figur 1).</li>
	<li>Indstil mikroskopet til et felt med høj forstørrelse (40x) for at observere spidsen af glasset kapillær og sørg for, at det ikke er brudt. Kontroller placeringen af glasset kapillær ved hjælp af micromanipulator (x-, y-, z-akser). Sørg for, at kapillar spidsen er centreret i synsfeltet, og flyt derefter kapillær op på z-aksen for at give frihøjde for kultur skålen senere. Bemærk: Mikroprøvetagning af cellerne udføres af glas kapillær for celler med diametre mellem 10-15 μm. En kapillar med en bore størrelse på ~ 5 μm anbefales. Hvis bore størrelsen er for lille, vil kapillar spidsen blive sat i cellen, og hvis den er for stor, kan følsomheden af senere MS-målinger blive kompromitteret.</li>
	<li>Placer prøvepladen/skålen på mikroskop stadiet, Juster forstørrelsen og fokus, Vælg målcellen på gitter skålen, og Flyt den ind i midten af visningen. Derefter skal du forsigtigt sænke glasset kapillar ved hjælp af micromanipulator (z-aksen), indtil spidsen kommer i fokus. Bemærk: Sørg for ikke at flytte kapillær i x-og y-aksen, indtil kapillar er i fokus.</li>
	<li>Under mikroskopisk observation skal du røre målcellen med kapillar spidsen og derefter begynde at anvende negativt tryk ved hjælp af sprøjten for at fælde cellen inde i kapillar spidsen. Optag denne procedure ved at tage et billede eller en video for at kontrollere timingen og suget placering af cellen præcist, hvis det er nødvendigt.</li>
	<li>Flyt kapillær op på z-aksen. Derefter løsnes kapillær fra kapillar holderen ved hjælp af pincet som forberedelse til MS-analyse.</li>
</ol>6. massespektrometri målinger
<ol><li>Kalibrer masse nøjagtigheden for MS-instrumentet i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. Efter kalibrering skal du kontrollere, at masse fejlen ikke er større end 3 ppm.</li>
	<li>Optimer MS-instrumentet til de parametre, der er bedst egnet til analysand af interesse. Bemærk: i tilfælde af Tamoxifen og 4-OHT-analyse er instrumentets parametre indstillet til følgende: indløbs kapillær temperatur: 400 °C, sprøjte spænding: 1500 V, automatisk Gain Control Target (AGC): 5.00 E + 06, S-Lens RF-niveau: 90%, SIM-område: 347-397 m/z, SIM maksimum injektion tid: 200 MS SIM-opløsning: 140.000 FWHM, MS/MS Range: 50-400 m/z, MS/MS AGC Target: 2,00 E + 05, MS/MS maksimal injektionstid: 100 MS, MS/MS resolution: 17.500 FWHM, MS/MS isolation vindue: 1 m/z, MS/MS normaliseret kollision energi (NCE): 35.</li>
	<li>Konfigurer en automatisk anskaffelsesmetode med en varighed på 5 min for SIM-tilstand for at opnå relativ kvantitation og en anden MS/MS-metode til positiv identifikation af stoffet og dets metabolit. Parametrene for anskaffelsesmetoden skal indstilles til de optimerede værdier, der er nævnt i trin 6,2.</li>
	<li>Forbered Ionisation opløsningsmidlet under en røg hætte. Opløsningsmidlets sammensætning afhænger af analysand af interesse. Her består det anvendte organiske opløsningsmiddel af 80% MeOH, 10% DMSO og 0,1% myresyre.</li>
	<li>Bland en passende intern standard med det organiske opløsningsmiddel før målingerne. I dette eksperiment anvendes 5,31 nM af D5-Tamoxifen som en intern standard.</li>
	<li>For at undgå falske positiver, aspirere medierne omkring de celler, der behandles med stoffet ved hjælp af en 1 μm bore-størrelse kapillar med konstant mikroskopisk observation for at undgå prøvetagning af cellulære dele.</li>
	<li>Der tilsættes 2 μL ioniserings opløsningsmiddel til den brede ende af det kapillær, som indeholder mediet, ved hjælp af en pipette, som er fastgjort til læsse spidser. Derefter analysere de indsamlede medier af MS, kontrollere for tilstedeværelsen af analysand af interesse (normalt, det bør ikke kunne påvises).</li>
	<li>Tilsæt 2 μL ioniserings opløsningsmidlet til den kapillar, der indeholder cellen, fastgør kapillar til en nanoelectrospray adapter (Nano-ESI) forbundet med et passende massespektrometer, og start den automatiske anskaffelsesmetode.</li>
</ol>7. massespektrometri databehandling og analyse
Bemærk: enhver egnet software kan bruges til at udføre dataanalyse. Men hvis forskerne ønsker at udføre dataanalyse ved hjælp af en software, der ikke er leveret af MS-leverandøren, så de rå data skal konverteres fra den proprietære leverandør format til et åbent format eller som en tekstfil først (som blev gjort her).
<ol><li>Normalisere dataene ved at dividere toparealet af den eller de pågældende analysand (r) med den interne standard fra den samme MS-scanning. Derefter, log omdanne peak nøgletal for at reducere skævheden.</li>
	<li>Plot den normaliserede intensitet af stoffet eller dets metabolit som en interval eller tæthed kurve for at visualisere fordelingen på tværs af enkeltceller. Her bruges R statistisk software sammen med ggplot2-pakken.</li>
	<li>Beregn det metaboliserede lægemiddel til umetaboliseret lægemiddel forhold ved at dividere den overflod af metabolitten af stoffet med den umetaboliserede forælder molekyle i hver celle (dvs., 4-OHT og Tamoxifen, hhv. Bemærk: sammenhængen mellem variationer af specifikke Raman toppe af interesse og variationer i MS toppe af stoffet eller dets metabolitter kan undersøgt. Dette er en tilføjelse til den mulige sammenhæng mellem stoffet selv og dets metabolit i enkeltceller. Dette kan gøres ved at beregne Pearsons korrelationskoefficient ved hjælp af en tosidet test. Mere avancerede Integrative tilgange bør også overvejes.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Altschuler, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity:+do+differences+make+a+difference?.">Cellular heterogeneity: do differences make a difference?.</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+metabolomics+by+mass+spectrometry:+Advances,+challenges,+and+future+applications.">Single-cell metabolomics by mass spectrometry: Advances, challenges, and future applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. , (2019).</li><li>Bunnage, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Screening+of+Tamoxifen+Abundance+and+Effect+Using+Mass+Spectrometry+and+Raman-Spectroscopy.">Single-Cell Screening of Tamoxifen Abundance and Effect Using Mass Spectrometry and Raman-Spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (4), 2710-2718 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+lipidomics+using+single-cell+Raman+spectroscopy.">In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3809-3814 (2011).</li><li>Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+Raman+observation+of+cytochrome+c+dynamics+during+apoptosis.">Label-free Raman observation of cytochrome c dynamics during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 28-32 (2012).</li><li>Palonpon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+SERS+microscopy+for+molecular+imaging+of+live+cells.">Raman and SERS microscopy for molecular imaging of live cells.</a> Nature Protocols. 8 (4), 677-692 (2013).</li><li>Butler, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Raman+spectroscopy+to+characterize+biological+materials.">Using Raman spectroscopy to characterize biological materials.</a> Nature Protocols. 11 (4), 664-687 (2016).</li><li>Mark, H., Workman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemomtrics in Spectroscopy. , (2018).</li><li>Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+subtraction+of+fluorescence+from+biological+Raman+spectra.">Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra.</a> Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).</li><li>Germond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectral+signature+reflects+transcriptomic+features+of+antibiotic+resistance+in+Escherichia+coli.">Raman spectral signature reflects transcriptomic features of antibiotic resistance in Escherichia coli.</a> Communications Biology. 1, 85 (2018).</li><li>Wold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+Least+Squares+Projections+to+Latent+Structures+(PLS)+in+Chemistry.">Partial Least Squares Projections to Latent Structures (PLS) in Chemistry.</a> Encyclopedia of Computational Chemistry. , (2002).</li><li>Chong, I. G., Jun, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+some+variable+selection+methods+when+multicollinearity+is+present.">Performance of some variable selection methods when multicollinearity is present.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 78, (2005).</li><li>Inde, Z., Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+non-genetic+heterogeneity+on+cancer+cell+death.">The impact of non-genetic heterogeneity on cancer cell death.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1), 99-114 (2018).</li><li>Pan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-probe:+a+miniaturized+multifunctional+device+for+single+cell+mass+spectrometry+analysis.">The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis.</a> Analytical chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).</li><li>Rao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+Single-probe:+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Single+Cell+Analysis+under+Ambient+Conditions.">Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e53911 (2016).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Live+Single-cell+Mass+Spectrometry+with+Spatial+Evaluation+by+Three-Dimensional+Holographic+and+Tomographic+Laser+Microscopy.">Quantitative Live Single-cell Mass Spectrometry with Spatial Evaluation by Three-Dimensional Holographic and Tomographic Laser Microscopy.</a> Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (2), 125-127 (2016).</li><li>Abouleila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+single+cell+mass+spectrometry+reveals+cancer-specific+metabolic+profiles+of+circulating+tumor+cells.">Live single cell mass spectrometry reveals cancer-specific metabolic profiles of circulating tumor cells.</a> Cancer Science. 110, 697-706 (2018).</li><li>Hiyama, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Lipido-Metabolomics+of+Single+Floating+Cells+for+Analysis+of+Circulating+Tumor+Cells+by+Live+Single-cell+Mass+Spectrometry.">Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry.</a> Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 31 (12), 1215-1217 (2015).</li><li>Ryabchykov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+MALDI+Spectrometric+Imaging+and+Raman+Spectroscopic+Data+for+the+Analysis+of+Biological+Samples.">Fusion of MALDI Spectrometric Imaging and Raman Spectroscopic Data for the Analysis of Biological Samples.</a> Frontiers in Chemistry. 6, 257 (2018).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

I dette manuskript blev der valgt et enkelt tilfælde, hvor HepG2 celler blev eksponeret (eller ikke) for Tamoxifen. Evnen af en Raman spektroskopi og massespektrometri system er påvist at overvåge virkningerne af Tamoxifen på celler. Raman spectroskopi tillod identifikation af potentielle biomarkører, der afspejlede en generel respons af enkeltceller til lægemiddeleksponering. Der blev observeret en vis heterogenitet mellem enkeltceller, hvilket tyder på, at nogle celler ikke reagerede på lægemiddel eksponeringen. På den anden side var LSC-MS i stand til at foretage en målrettet analyse af stoffet og dets metabolit på enkelt celleniveau, hvor der blev observeret en høj grad af heterogenitet i lægemidlet og dets metabolits overflod. Denne heterogenitet hjælper med at forklare, hvorfor nogle celler påvirkes af stoffet, mens andre tilsyneladende ikke, på trods af cellerne stammer fra en angiveligt ensartet befolkning12.
Blandt særlige aspekter af denne teknik, der kræver opmærksomhed, er det vigtigt at evaluere kvaliteten af mikroskop opsætning og signalbehandling for at sikre reproducerbarhed af dataene. Hvis forbehandling af spektrene udføres omhyggeligt, skal signal variationerne maksimeres ved det lokale maksimum for hver spids. Derimod bør spektrens grundlinje og kant overlappe hinanden mellem de testede celle betingelser. Et andet vigtigt aspekt er den multivariat model, der anvendes til at undersøge forskelle mellem behandlinger. Man skal omhyggeligt evaluere modellerne og model parametrene for at sikre en præcis og præcis analyse. En fordel ved PLS-modellen, i modsætning til neurale netværk, er, at det giver adgang til de vægte, der er forbundet med hver bølgelængde (Raman Skift), som bedst adskiller de betingelser testet af modellen.
Trods Raman spektroskopi med held diskriminere narkotika respons, det skal understreges, at denne teknik er begrænset i dens anvendelse til at give biologisk fortolkning. Dette skyldes primært kompleksiteten af spektral signalet, som omfatter en blanding af tusindvis af molekyler. Der er derfor behov for yderligere undersøgelser for at evaluere systematiske variationer mellem Raman-spektral intensiteter og variationer i lægemiddel koncentrationerne. Også, lignende undersøgelser af andre cellelinjer er forpligtet til at evaluere generalisering af spektral biomarkører forbundet med Tamoxifen.
Desuden kan det være af interesse at udføre levende væv målinger til at vurdere farmakodynamik og studere, hvordan narkotika trænge ind og flyde inden for hver celle. Det skal desuden bemærkes, at prøvetagnings trinnet i LSC-MS i høj grad afhænger af operatørens dygtighed. Parametre som rumlig opløsning, celle position inde i kapillar efter prøvetagning og overførsels styrke er udelukkende operatør afhængige, hvilket begrænser storstilet vedtagelse af LSC-MS. Selv om automatiserede prøvetagningssystemer kan afhjælpe dette problem. Mens LSC-MS udmærker sig ved prøvetagning af overtrædende eller flydende celler i deres oprindelige stater, klarer det sig mere dårligt i prøvetagnings celler indlejret i vævs sektioner. Dette skyldes, at prøveudtagnings kapillar spidsen er tilbøjelig til at knække, hvis prøve tætheden er høj. Derfor kan en anden fremgangsmåde som single-Probe være mere egnet i sådanne tilfælde14,15.
Da de celler, der anvendes her, udtages under omgivende forhold med minimal Prøvetilberedning, kan LSC-MS let integreres med andre teknologier, som det fremgår af integrationen med Raman i denne protokol. En anden lignende integration med 3D-holografi har gjort det muligt at opnå absolut kvantitation af cellulære metabolitter på det subcellulære niveau16. Desuden har integration med flow cytometri tilladt for afdækningen af metaboliske biomarkører i enkelt cirkulerende tumorceller af neuroblastom cancerpatienter17,18.
I fremtiden, på grund af den seneste stigende interesse i at kombinere datasæt fra Imaging metoder19, kan det også være af interesse at studere de systematiske variationer mellem Raman signaler og massespektrometri resultater (såvel som andre omic'er) ved hjælp af Integrative beregningsmæssige tilgange. Interessant, vi har allerede fundet flere svage, men signifikant lineær korrelationer mellem intensiteten af Raman toppe identificeret ved VIP scores og overflod af Tamoxifen eller dets metabolit på enkelt celleniveau som identificeret ved MS4. Disse data kan foreslå en metabolisk sammenhæng mellem MS-profiler og Raman Spectra og muligheden for at forudsige disse værdier.

Cellerne reagerer forskelligt på ændringer i deres mikromiljø på enkelt celleniveau, et fænomen kaldet cellulær heterogenitet1. På trods af dette, nuværende Drug Discovery undersøgelser er baseret på gennemsnitlige målinger af cellepopulationer, som sløre oplysninger om potentielle delpopulationer samt enkelt-celle variationer2. Disse manglende oplysninger kan forklare, hvorfor nogle celler er mere modtagelige for stoffer, mens andre er resistente. Interessant, manglen på enkelt celleoplysninger om narkotika respons er en mulig årsag til svigt i fase II kliniske forsøg med narkotika3. For at løse dette problem skal cellulære interaktioner med lægemidlet (dvs. optagelse, metabolisme og respons) derfor måles på enkelt celleniveau.
For at opnå dette har vi designet et unikt system, hvor levende enkeltceller screenes ved hjælp af Label-fri Raman spektroskopi og derefter yderligere karakteriseret ved hjælp af massespektrometri4. Raman spectroskopi giver et Molekylær fingeraftryk af den cellulære tilstand, et komplekst spektrum som følge af bidragene fra mange molekyler inde i cellen. På trods af denne kompleksitet, kan det betragtes som Raman fingeraftryk afspejler en hel cellestruktur og metabolisme5,6. Raman spectroskopi udmærker sig ved at måle cellulære stater i en ikke-invasiv og relativt høj gennemløb måde, hvilket gør det nyttigt for screening og vurdering af narkotika respons på enkelt celleniveau.
I modsætning hertil giver MS den krævede følsomhed og selektivitet for måling af stof optagelsen på enkelt celleniveau. Da MS er destruktiv (prøven [celle] er typisk forbruges under analyse), integrere det med ikke-destruktiv, etiket-fri Raman spektroskopi kan give en høj gennemløb og følsomt system. Denne kombinerede platform er i stand til at give mere information om stof optagelse, metabolisme, og effekter på enkelt celleniveau.
Dette manuskript belyse en protokol, der anvendes til at studere cellulære interaktioner med lægemidler på enkelt celleniveau ved hjælp af in vitro-kulturer ved hjælp af en integreret Raman-MS-platform. For at gøre det, hepatocellulære karcinom celler (HepG2) og Tamoxifen anvendes som en model. HepG2 celler blev valgt, fordi de tager op Tamoxifen og metabolisere stoffet, og de er samtidig påvirket på grund af dets hepatotoksiske virkninger. To stater anvendes i dette manuskript: stof behandlede celler vs. ikke-behandlede celler (kontrol).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% penicillin-streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass bottom grid dish</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxy Tamoxifen standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm diode pumped solid-state laser</td>
			<td>Ventus, Laser Quantum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOS-L101T-S motorized microscope stage</td>
			<td>OptoSigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-2 cellomics coated sampling capillaries</td>
			<td>HUMANIX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d5-Tamoxifen standard</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide LC-MS grade</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf GELoader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone laboratories</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cell line (RCB1886)</td>
			<td>RIKEN cell bank center</td>
			<td>RCB1886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC0-19A1C Incubator</td>
			<td>Sanyo Electric Co.</td>
			<td>MC0-19A1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1060352500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMO-203 3-D Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MMO-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoflex nano-ESI adaptor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-stage incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce LTQ Velos ESI calibration solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIXIS BR400 cooled CCD camera</td>
			<td>Princeton Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail collagen coating solution</td>
			<td>Cell Applications Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85256</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated raman spectroscopy and mass spectrometry platform to study single-cell drug uptake, metabolism, and effects

Celler er kendt for at være iboende heterogene i deres reaktioner på narkotika. Det er derfor vigtigt, at der tages højde for heterogenitet af enkeltceller i undersøgelser af lægemiddel opdagelse. Dette kan opnås ved nøjagtigt at måle over floden af cellulære interaktioner mellem en celle og et lægemiddel på enkelt celleniveau (dvs. stof optagelse, metabolisme og effekt). Dette papir beskriver en enkelt-celle Raman spektroskopi og massespektrometri (MS) platform til at overvåge metaboliske ændringer af celler som reaktion på narkotika. Ved hjælp af denne platform, metaboliske ændringer som reaktion på stoffet kan måles ved Raman spektroskopi, mens stoffet og dets metabolit kan kvantificeres ved hjælp af massespektrometri i samme celle. Resultaterne tyder på, at det er muligt at få adgang til oplysninger om stof optagelse, metabolisme og respons på et enkelt celleniveau.

En enkelt celle analyse af lægemiddelinteraktioner (optagelse, metabolisme og effekter) er afgørende for at afdække enhver skjult eller lægemiddel resistent delpopulation samt forstå virkningerne af cellulære heterogenitet. I denne protokol, to komplementære teknikker blev anvendt til at måle de førnævnte interaktioner i enkeltceller: Raman spektroskopi og MS Raman massespektrometri hurtigt identificerer celler påvirket af narkotika baseret på spektral biomarkører af narkotika respons. MS bruges til at overvåge optagelsen og metabolismen af lægemidlet på en selektiv og semi-kvantitativ måde. Celler blev først screenet af Raman spektroskopi derefter individuelt udtaget til analyse af MS.
Figur 2viser en komparativ analyse af det gennemsnitlige spektrum af hver betingelse (med og uden stofbehandling). Det gennemsnitlige spektrum af de to betingelser adskiller sig klart fra forskellige toppe, som tidligere blev identificeret og tildelt molekylære forbindelser2. Især toppe på 1000 cm- (henføres til aromatiske forbindelser såsom phenylalanin og tyrosin) viser stærke forskelle. Betydningen af den statistiske forskel bør vurderes ved yderligere multivariat analyser.
Datasættet blev derefter brugt til at træne en PLS-model (trin 4.5-4.8), der havde til formål at skelne mellem de to celle behandlinger (med lægemiddel: n = 290, uden lægemiddel: n = 115). Den forudsigende evne til at klassificere de celler, som dyrkes i nærværelse af Tamoxifen, nåede 100% følsomhed og 72% specificitet i testdata (ukendt fra den kryds validerede uddannede model). Følsomhed er et mål for de sande positiver, der er korrekt identificeret af modellen, mens specificitet er et mål for de faktiske negativer, der identificeres af modellen. Alternative modeller såsom SVM'er, Lda'er og neurale netværk kan give tilsvarende eller bedre resultater, selv om der ikke er udført en omfattende sammenligning i dette studie.
Baseret på PLS-modellen blev VIP-pointene beregnet, hvilket repræsenterer betydningen af bølgelængder (Raman-forskydninger) i at diskriminere forsøgsbetingelserne (figur 3). Vigtigst af alt svarede de højeste toppe af VIP-profilerne til Raman Peaks, hvor der blev set stærke forskelle mellem de to behandlinger. Dette bekræftede de specifikke molekylære forskelle mellem behandlede og ubehandlede celler. Derfor kan forskerne identificere mulige spektral biomarkører, der afspejler reaktionen af enkeltceller til narkotikabehandling. Disse biomarkører kan testes yderligere for at verificere deres biologiske relevans og generalisering på tværs af forskellige forhold og cellelinjer.
En levende single-celle massespektrometri (LSC-MS) system var i stand til at detektere både stoffet og dets metabolitter i enkelt, stof-behandlede HepG2 celler, der tidligere blev målt ved Raman spektroskopi. Desuden kan tandem MS bruges til at bekræfte strukturen af begge molekyler. Efter positiv identifikation blev den relative overflod af lægemidlet og dets metabolitter målt i hver celle og sammenlignet med baggrunds toppe i ubehandlede celler. Stærk variation blev observeret i forekomsten af Tamoxifen, og dette fænomen var endnu mere udtalt i tilfælde af dets metabolit, 4-OHT (figur 4). Forholdet mellem forekomsten af Tamoxifen og dets metabolitter blev også undersøgt, hvor der blev fundet en signifikant positiv korrelation mellem de to (r = 0,54, p = 0,0001, n = 31).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig1.jpg"> Figur 1: celle pluk system monteret på et mikroskop stadie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig2.jpg"> Figur 2: gennemsnitligt spektrum af de stof behandlede celler (med Tamoxifen: n = 295) og ubehandlede celler (uden Tamoxifen: n = 115). Raman Peaks kan identificeres fra litteraturen. De fleste af de kraftige spektral forskelle er statistisk signifikante (ANOVA, p ≤ 0,5) som beskrevet tidligere4. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig3.jpg"> Figur 3: VIP-scorer udtrukket fra den forudsigende pls-model. VIP scores afspejler de bølgelængder, der bidrager til at skelne mellem de to klasser i modellen. De fleste af toppene svarer til specifikke molekyler, der observeres som spektral biomarkører af narkotika effekter på stof-behandlede celler. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig4.jpg"> Figur 4: fordeling af forekomsten af Tamoxifen og dets metabolit. Fordeling af forekomsten af Tamoxifen og dets metabolit, 4-OHT (målt ved enkelt celleniveau) sammenlignet med endogene toppe i de ubehandlede celler (kontrol). Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects at JoVE.com

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Denne protokol præsenterer en integreret Raman spektroskopi-Mass massespektrometri (MS) platform, der er i stand til at opnå en enkelt celle opløsning. Raman spektroskopi kan bruges til at studere cellulære respons på lægemidler, mens MS kan bruges til målrettet og kvantitativ analyse af stof optagelse og metabolisme.

En integreret Raman spektroskopi og massespektrometri platform til at studere enkelt-celle stof optagelse, metabolisme, og effekter

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Vi udviklede en innovativ metode til metabolomics. Vi kombinerede Belfry spektral billeddannelse af levende celler med encellede massespektrometri. Vores teknik kan overvåge og forudsige de metaboliske ændringer af enkelte celler mod narkotika.Og det åbner en masse ansøgning om grundlæggende forskning og industri. Vores metode tilføjer encellede opløsning til nuværende drug evaluering teknikker, som i høj grad vil støtte fremtidige drug discovery indsats. Vores teknik kan også hjælpe os med at forstå den rolle, som cellulære heterogenitet i kræftresistens.Enkeltcelleprøvetagning og dataanalyse er de mest udfordrende aspekter i dette eksperiment. Vi arbejder i øjeblikket på at automatisere disse to trin, især prøvetagningsdelen. Vi anbefaler, at du praktiserer enkeltcelletagningen i god tid før eksperimentet, da hver mikromanipulatoropsætning er lidt anderledes, og du bør tage dig tid til at blive fortrolig med kontrollerne.Efter inkubering celler for at nå 70% sammenløb, kulturceller af interesse i en passende kultur medier, tilsæt Penicillin-Streptomycin at undgå forurening. Efter måling af celletæthed på et hæmocytometer, subkultur celler i en 35 millimeter glas bund gitter fad eller kvarts dias, ved hjælp af samme medium på en såning tæthed på 0,7 gange 10 til den sjette. Derefter inkuberes ved 37 grader celsius i 24 timer.Den næste dag når cellerne et sammenløb på 50 til 60%Vask cellerne to gange med forvardt PBS-buffer ved 37 grader celsius. Del cellerne op i lægemiddelbehandlede og ubehandlede undergrupper i 35 millimeter kulturretter. Tamoxifen opløses i dimethylsulfoxid sammen med kulturmediet for at opnå et endeligt volumen på to milliliter og Tamoxifen-koncentration på 10 mikromolar.Dette er den stofbehandlede gruppe. Bland en tilsvarende mængde DMSO i mediet som en kontrolgruppe for at undersøge virkningerne af DMSO. Inkuber begge grupper i to milliliter af de spidse medier i 24 timer for at nå et sammenløb på 70 til 80%Før spektrale målinger, kontrollere pinhole og laser position match ved hjælp af et mål.For at kalibrere spektrofotometeret før hvert eksperiment skal ethanol i en glasbundskål måles ved en given laserintensitet i et sekund og knytte toppen til kendte bølgelængder. Derefter setup mikro-kammer på 5% kuldioxid og 37 grader celsius. Når mikroskopsystemet er klar, fjernes cellerne fra inkubatoren, og cellerne skylles straks to gange med opvarmet PBS-buffer ved 37 grader celsius.Derefter tilsættes to milliliter opvarmet PBS eller FluoroBrite DMEM. Tilføj 10 mikroliter vand på vand nedsænkning objektiv. Og forsigtigt placere glas bund celle parabol på mikroskopet fase.Fastgør celleprøvetagningssystemet på Raman-mikroskopet. Tilslut 3D-mikromanipulatoren til glaskapillærholderen, der er fastgjort til en tom sprøjte til prøvesugelse. Indstil mikroskopet til et højt forstørrelsesfelt på 40 gange for at observere spidsen af glaskapillæren, og sørg for, at det ikke er i stykker.Glaskapillaryens position styres ved hjælp af mikromanipulatoren. Sørg for, at kapillærspidsen er centreret i synsfeltet. Flyt derefter kapillæren op på Z-aksen for at give tilladelse til kulturskålen senere.Placer prøveskålen på mikroskopets stade, juster forstørrelsen, og fokuser, marker målcellen på gitterskålen, og flyt den til midten af visningen. Mål hver celle ved at fokusere laserlinjen. En eksponeringstid på 15 sekunder pr. celle er tilstrækkelig til at opnå et tværsnit af en celle med et klart Raman-signal.En galvano-spejl tillader scanning af en celle eller en gruppe af celler inden for flere dusin minutter. Sænk derefter forsigtigt ned i glaskapillæren ved hjælp af mikromanipulator, indtil spidsen kommer i fokus. Under mikroskopisk observation skal du trykke på målet enkelt celle med kapillær spidsen.Start derefter med undertryk ved hjælp af sprøjten til at fange cellen inde i kapillær spidsen. Optag denne procedure ved at tage en video for at kontrollere timingen og suget placering af cellen præcist. Flyt kapillæren op på Z-aksen.Fjern derefter kapillæren fra kapillærholderen ved hjælp af snaft som forberedelse til massespektrometrianalyse. Efter opsætning af massespektrometriinstrumentet og analyse af mediet tilsættes to mikroliter af ioniseringsopløsningsmidlet til kapillæren, der indeholder cellen. Fastgør kapillæren til en nanoelektroprayadapter, der er tilsluttet et egnet massespektrometer, og start den automatiske anskaffelsesmetode.En sammenlignende analyse af det gennemsnitlige spektrum af hver tilstand, med og uden narkotikabehandling, er vist her. Det gennemsnitlige spektrum af de to forhold er klart forskelligt på forskellige toppe. Især toppe på 1, 000 per centimeter, som er et tegn på aromatiske forbindelser såsom phenylalanin og tyrosin, viser stærke forskelle.På grundlag af fremskrivningen af latente strukturmodel blev VIP-scorene beregnet, hvilket repræsenterer betydningen af bølgelængder for at diskriminere de eksperimentelle forhold. Det er vigtigt, at de højeste toppe af VIP-profilerne svarede til Raman-toppe, hvor der blev set store forskelle mellem de to behandlinger. Dette bekræftede de specifikke molekylære forskelle mellem behandlede og ubehandlede celler.Efter positiv identifikation blev den relative forekomst af lægemidlet og dets metabolitter målt i hver celle og sammenlignet med baggrundstoppe i ubehandlede celler. Der blev observeret stærk variation i Tamoxifen-forekomsten. Og dette fænomen var endnu mere udtalt i tilfælde af sin metabolit 4-hydroxy-tamoxifen.Forskere kan være interesseret i at udforske forbindelsen mellem spektrale billeder og de metaboliske profiler af celler. Vores forskning har også industrielle anvendelser, fordi det giver mulighed for lokal screening af celler til farmaceutisk fremstilling. Der skal være forsigtighed ved klargøring af ioniseringsopløsningsmidlet til massespektrometermålingerne.Det skal forberedes under en røghætte. Pas også på ikke at røre ved ionkilden til massespektrometerinstrumentet for at undgå at blive elektrisk stød. Endelig er de prøvetagningskapillærer, der anvendes under hele målingen, meget skarpe, så håndter dem med forsigtighed for at undgå skader.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless kapillarelektroforese-massespektrometri for Metabolic profilering biologiske prøver

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Fremstilling af en UV-Vis og Raman spektroskopi Immunoassay Platform

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation for Kvantitativ massespektrometri Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning af proteinubiquitinationssteder ved peptidberigelse og massespektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

En forberedelse til plasmaprøve til massespektrometri ved hjælp af en automatiseret arbejdsstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til Sonde Elektrospray Ionization Mass Spektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...