Name: an integrated raman spectroscopy and mass spectrometry platform to study single-cell drug uptake, metabolism, and effects
Uploaded: 2020-01-09T14:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects at JoVE.com

De auteurs bedanken Toshio Yanagida voor zijn steun en RIKEN interne samenwerkings fondsen toegeschreven aan Dr. Arno Germond.

1. celcultuur
<ol><li>Cultuur cellen van belang in een geschikte cultuur media. Penicillaire-streptomycine kan worden toegevoegd om besmetting te voorkomen. In het geval van HepG2 cellen, cultuur cellen in een cultuur media met Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 0,1% penicillaire-streptomycine. Voor de metingen van de Raman-spectroscopie kunnen cellen worden geteeld op een 0,1% Gelatin-gecoate glazen bodem schotel of kwarts platen.</li>
	<li>Incuberen cellen gedurende 2 dagen bij 37 °C en 5% CO2 in een bevoficeerde incubator.</li>
	<li>Synchroniseer celculturen om 70% confluency te bereiken.</li>
	<li>Subcultuurcellen in een 35 mm glasbodem schotel of kwarts dia's met behulp van hetzelfde medium bij een zaaien dichtheid van 0,7 x 106, vervolgens inbroed bij 37 °c gedurende 24 uur. Let op: Cultuur gerechten of glijbanen kunnen vooraf worden gecoat met een collageen-of gelatine coating oplossing met een cultuur oppervlak ratio van 5 UG/cm2 om ze te laten repareren, zodat ze kunnen overleven tijdens het meten.</li>
</ol>2. medicamenteuze behandeling
<ol><li>Verwijder celculturen uit de incubator en was 2x met voorverwarmde PBS-buffer (37 °C). Opmerking: het is optimaal om cellen te verwijderen voor medicamenteuze behandeling met een confluentie van 50%-60%.</li>
	<li>Verdeel cellen in drugs behandelde en onbehandelde subgroepen in 35 mm cultuur gerechten.</li>
	<li>Meng het medicijn naar keuze met de cultuur media. Los bijvoorbeeld Tamoxifen op in dimethylsulfoxide (DMSO) en meng met de kweekmedia om een eindvolume van 2 mL en Tamoxifen-concentratie van 10 μM te verkrijgen. Dit wordt de met drugs behandelde groep.</li>
	<li>Meng een overeenkomend volume oplosmiddel (DMSO) in het medium als een controle om de effecten van DMSO te bestuderen. Dit wordt de controlegroep.</li>
	<li>Inincuberen beide groepen in 2 mL van de spiked media bereid in stappen 2.3-2.4 voor 24 h. De verwachte confluentie na incubatie moet 70%-80% zijn.</li>
</ol>3. Raman spectrale beeldvorming en spectrale verwerking
Opmerking: Hoewel Raman-spectroscopie-systemen commercieel beschikbaar zijn, is het Raman-spectroscopie-systeem dat hier wordt gebruikt een zelf gebouwde lijn Scanning-confocale Microscoop die eerder werd beschreven7,8. Kort, dit systeem is uitgerust met een 532 nm diode gepompt Solid-State Laser. Het laserlicht wordt in een vlak gevormd met behulp van een cilindrische lens, waarmee de meting van 400 spectra in één blootstelling mogelijk is. Raman spectra werden opgenomen met behulp van een gekoelde CCD camera gemonteerd op een polychromator die gebruik maakt van een 1.200 groeven/mm roosters om de spectrale resolutie van de vingerafdruk regio te maximaliseren (van 500-1800 cm-1). Dit spectrale gebied bevat een hoge dichtheid van frequenties die specifiek zijn voor moleculen die Raman verstrooiing genereren. Een water-immersionobjective lens (NA = 0,95) wordt ook gebruikt. De ruimtelijke resolutie van dit systeem is ~ 300 nm en de spectrale resolutie is 1 cm-1. Om de overleving van de cel tijdens het experiment te garanderen, wordt een micro kamer gebruikt die is bevestigd op een gemotoriseerde Microscoop.
<ol><li>Controleer vóór de spectrale metingen de uitlijning van de optiek. Een 50 μm pinhole kan worden gebruikt om te controleren of de pinhole en laser positie exact overeenkomen. Voer de spectrofotometer gleuf in wanneer u zoveel mogelijk vernauwde.</li>
	<li>Gebruik ethanol om de spectrofotometer te kalibreren vóór elk experiment. Om dit te doen, plaats EtOH in een schotel met glazen bodem, meet het spectrum op een gegeven laserintensiteit (gemeten bij monster) voor 1 s, en koppel de piek aan bekende golflengten7.</li>
	<li>Minimaliseer de laserintensiteit van het monster tot ~ 2,4 mW/μm2 , zodat cellen Laser blootstelling overleven.</li>
	<li>Stel de micro kamer in op 5% CO2 en 37 °c.</li>
	<li>Zodra het Microscoop-systeem gereed is, verwijdert u cellen uit de incubator en spoelt u de cellen onmiddellijk 2x met de buffer opgewarmd PBS (37 °c) en voegt u vervolgens 2 ml opgewarmde PBS (37 °c) of DMEM toe om de cellen te hervatten. OPMERKINGEN: zowel PBS als FluoroBrite-gebaseerde media zijn voldoende opties voor Raman-spectroscopie-metingen omdat ze een minimaal achtergrond signaal produceren.</li>
	<li>Voeg 10 μL water toe aan de objectief lens met water onderdompeling en plaats het glazen onderste celschaaltje voorzichtig op de Microscoop.</li>
	<li>Meet elke cel door de laser lijn te focussen. Een 15 s blootstellingstijd per cel volstaat hier om een dwarsdoorsnede van een cel te verkrijgen met een duidelijk Raman-signaal. Een Galvano mirror maakt het scannen van één cel of een groep cellen binnen enkele tientallen minuten mogelijk. OPMERKINGEN: een hogere resolutie van volledige spectrale beeldvorming van cellen vereist meer tijd en kan tot foto beschadiging leiden. Hier werden cellen gemeten met behulp van een enkele regel blootstelling om een dwarsdoorsnede van elke cel te verkrijgen. Deze aanpak is een goede ruil om de doorvoer te verhogen en voldoende informatie te verkrijgen om cellen te discrimineren, terwijl ook de levensvatbaarheid van de cel wordt gewaarborgd door foto schade te beperken.</li>
</ol>4. voorbewerken van spectrale gegevens en multivariate analyses
Opmerking: voor verwerking is een noodzakelijke stap voorafgaand aan aanvullende analyse om ongewenste technische variaties binnen de spectrale gegevens te verwijderen. Als gevolg van de diversiteit van de methoden en software, een uitputtende lijst kan niet worden verstrekt, en er zijn veel nuttige beoordelingen gevonden in de literatuur7,8. In deze sectie beschrijven we kort de benadering die wordt gebruikt voor het analyseren en interpreteren van spectrale Raman-gegevens die zijn verkregen uit levende enkelvoudige cellen.
<ol><li>Pak Raman-afbeeldingen uit en voorverwerken om mogelijke kosmische straling te verwijderen. Opmerking: spectrale as van spectra verkregen tijdens verschillende dagen/weken/maanden kan enkele variaties als gevolg van kleine technische variaties tijdens de kalibratie met behulp van ethanol omvatten. Dit zal een sterk effect hebben op latere multivariate analyses en statistische vergelijkingen. In het geval dat experimenten worden uitgevoerd tijdens verschillende weken/maanden, worden kleine optische variaties verwacht. In dit geval moeten gegevens worden geïntermuleerd om te corrigeren voor eventuele spectrale verschuivingen van de gegevens in experimenten. Interpolatie met behulp van kubieke spline wordt hier gebruikt. Na deze stap moet alle Spectra Axis worden uitgelijnd. Voor de daaropvolgende analyse wordt een bereik van 500-1800 cm-1 overwogen.</li>
	<li>Extraheer spectrale gegevens van cellen en achtergrond (afwezigheid van cellen) van elke afbeelding met behulp van een zelf gemaakt algoritme. Trek het achtergrond signaal af van het signaal van de cel. Vervolgens, gemiddelde de spectra van de resterende pixels, die moet overeenkomen met een enkele cel. De volgende stappen worden uitgevoerd met behulp van de 2D-spectra van cellen.</li>
	<li>Uitvoeren van een basislijn correctie met behulp van de ModPoly9 of een ander algoritme dat naar schatting voldoende passen. Trim het spectrale bereik tot 600-1700 cm-1 om het vingerafdruk gebied te selecteren en zorg ervoor dat er geen ongewenste randeffecten zijn op de spectra als gevolg van een slechte polynoom fitting.</li>
	<li>Voer een normalisatie stap uit zoals vector normalisatie (intensiteit bij elk vibratie wordt gedeeld door de globale L2-norm of de maximale enkelvoud waarde van een spectrum) om de spectrale intensiteit10te normaliseren, hoewel andere normalisatie kan worden overwogen.</li>
	<li>Bereid een gegevensset met het juiste label voor elke klasse/voorwaarde. Opmerking: vergelijkende spectrale analyses kunnen worden geperforeerd om de aard van mogelijke verschillen tussen celklasse/condities te onderzoeken (bijvoorbeeld door het gemiddelde spectrum van de controlegroep af te trekken naar andere groepen om belangrijke regio's te identificeren [zoals potentiële biomarkers]). Er kunnen ook ANOVA-en Fisher-scores berekeningen worden uitgevoerd10.</li>
	<li>Om behandelde en onbehandelde cellen te identificeren op basis van spectrale kenmerken, kunnen multivariate analyses worden toegepast. Een genormaliseerde spectrale gegevens moeten worden gebruikt als een gegevensset training en een onbekende gegevensset (zonder label) van een replicaatexperiment moet worden gebruikt als testgegevens, indien mogelijk. Opmerking: discriminant analyse uitgevoerd op een aantal vector van een hoofdcomponent analyse (PCA-DA10), projectie op latente scores gevolgd door discriminant analyse (pls-da), en ondersteuning vector machines (SVM)11 zijn modellen vaak gebruikt in het veld, en elk presenteert verschillende statistische overwegingen. Voor verwerking van gegevens moet bijgevolg worden uitgevoerd.</li>
	<li>Gebruik machine learning die past bij de experimentele doelstellingen. Hier wordt een projectie op latent structuur (PLS) model gebouwd met behulp van de spectrale vingerafdruk regio van Raman spectra (600-1710 cm-1)11,12. Mean-Center de gegevens indien nodig. Voor kruisvalidatie van het model kunnen verschillende technieken worden toegepast. Opmerking: hier wordt een Venetiaanse blinde kruisvalidatie met 10 Splits toegepast. De complexiteit van het model (aantal onderdelen of latente variabele) moet worden getest, zodat het beste model minimaliseert de waarde van de root mean Square error (RMSE). Er werd vastgesteld dat drie latente vectoren (Lv's) de beste discriminatie met onze gegevensset verschafte.</li>
	<li>Bepaal welke Raman spectrale pieken bijdragen aan de discriminatie van de cellen (bijvoorbeeld door de Score van variabel belang in projectie [VIP] te plotten voor elke Raman-vibratie of de grootte van de regressie coëfficiënt). OPMERKINGEN: de VIP-Score van een variabele wordt berekend als een gewogen som van de gekwadrateerde correlaties tussen de PLS-DA-componenten en de oorspronkelijke variabele. Details over pls en VIP scores algoritme kan worden gevonden in de literatuur11,12.</li>
</ol>5. opstelling en procedures voor het bemonsteren van één cel
<ol><li>Bevestig het bemonsteringssysteem van de cel op de Raman-Microscoop zoals weergegeven in Figuur 1. Sluit de 3D-Micro manipulator aan op de glazen capillaire houder die is bevestigd aan een lege spuit voor monster zuigen door een negatieve druk toe te passen (Figuur 1).</li>
	<li>Stel de Microscoop in op een hoog vergrotings veld (40x) om de punt van de glazen capillaire te observeren en zorg ervoor dat deze niet gebroken is. Bedien de positie van het glas capillair met behulp van de micro manipulator (x-, y-, z-assen). Zorg ervoor dat de capillaire punt gecentreerd is in het gezichtsveld en verplaats vervolgens de capillaire omhoog op de z-as om de cultuur schotel later goed te laten zien. Opmerking: micro sampling van de cellen wordt uitgevoerd door het Glazen capillair voor cellen met diameters tussen 10-15 μm. Een capillair met een boring van ~ 5 μm wordt aanbevolen. Als de boring grootte te klein is, de capillaire tip zal worden aangesloten door de cel, en als het te groot is, de gevoeligheid van latere MS metingen kan worden aangetast.</li>
	<li>Plaats de monster plaat/schotel op het podium van de Microscoop, pas de vergroting en scherpstelling aan, selecteer de doelcel op de rooster schotel en verplaats deze naar het midden van de weergave. Verlaag vervolgens voorzichtig het Glazen capillair met behulp van de micromanipulator (z-as) tot de punt in de focus komt. Opmerking: Zorg ervoor dat u het capillair niet in de x-en y-as beweegt totdat het capillair scherp is.</li>
	<li>Raak onder microscopische observatie de doelcel aan met de capillaire Tip en begin met het toepassen van negatieve druk met behulp van de spuit om de cel in de capillaire tip te vangen. Neem deze procedure op door een foto of video te maken om de timing en de gezogen locatie van de cel nauwkeurig te controleren, indien nodig.</li>
	<li>Beweeg de capillaire omhoog op de z-as. Verwijder vervolgens het capillair van de capillaire houder met behulp van een tang ter voorbereiding op MS-analyse.</li>
</ol>6. massaspectrometrie metingen
<ol><li>Kalibreer de massa nauwkeurigheid van het MS-instrument volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Zorg er na kalibratie voor dat de massa fout niet groter is dan 3 ppm.</li>
	<li>Optimaliseer het MS-instrument met parameters die het meest geschikt zijn voor de analyt van belang. Opmerking: in het geval van Tamoxifen en 4-OHT-analyse worden de instrument parameters ingesteld op het volgende: inlaat capillaire temperatuur: 400 °C, sproei spanning: 1500 V, automatische versterkingsregeling (AGC): 5.00 E + 06, S-lens RF-niveau: 90%, SIM-bereik: 347-397 m/z, SIM maximale injectie tijd: 200 MS, SIM-resolutie: 140.000 FWHM, MS/MS-bereik: 50-400 m/z, MS/MS AGC target: 2.00 E + 05, MS/MS maximale injectie tijd: 100 MS, MS/MS resolutie: 17.500 FWHM, MS/MS isolatie venster: 1 m/z, MS/MS genormaliseerde botsingsenergie (NCE): 35</li>
	<li>Stel een automatische verwervingsmethode in met een duur van 5 min voor de SIM-modus om relatieve kwantatie te bereiken, en een andere MS/MS-methode voor positieve identificatie van het medicijn en de metaboliet ervan. De parameters van de overnamemethode moeten worden ingesteld op de geoptimaliseerde waarden die worden vermeld in stap 6,2.</li>
	<li>Bereid het ionisatie-oplosmiddel onder een rook afzuigkap voor. De samenstelling van het oplosmiddel is afhankelijk van de analyt van belang. Hier, de gebruikte organische oplosmiddel bestaat uit 80% MeOH, 10% DMSO, en 0,1% mierenzuur.</li>
	<li>Meng vóór de metingen een geschikte interne standaard met het organische oplosmiddel. In dit experiment, 5,31 nM van D5-Tamoxifen wordt gebruikt als een interne standaard.</li>
	<li>Om valse positieven te voorkomen, aspireren de media rond de cellen behandeld met de drug met behulp van een 1 μm boring-grootte capillair met constante microscopische observatie om te voorkomen dat het bemonsteren van cellulaire delen.</li>
	<li>Voeg 2 μL van het ionisatie-oplosmiddel toe aan het brede uiteinde van het capillair dat de media bevat met behulp van een pipet dat is bevestigd aan tips voor de lader. Analyseer vervolgens de bemonsterde media door MS, Controleer op de aanwezigheid van de analyt van belang (normaalgesproken moet het niet detecteerbaar zijn).</li>
	<li>Voeg 2 μL het ionisatie-oplosmiddel toe aan het capillair dat de cel bevat, bevestig het capillair aan een nanoelectrospray-adapter (nano-ESI) die is aangesloten op een geschikte massaspectrometer en start de automatische verwervingsmethode.</li>
</ol>7. massaspectrometrie gegevensverwerking en-analyse
Opmerking: alle geschikte software kan worden gebruikt voor het uitvoeren van gegevensanalyse. Als onderzoekers echter gegevensanalyse willen uitvoeren met behulp van een software die niet wordt geleverd door de MS-leverancier, moeten de onbewerkte gegevens worden geconverteerd van de indeling van de propriëtaire leverancier naar een open indeling of als een tekstbestand eerst (wat hier is gedaan).
<ol><li>Normaliseer de gegevens door het piek gebied van de analyt van interest (s) te delen door die van de interne standaard van dezelfde MS-scan. Vervolgens transformeert u de piek verhoudingen om scheet te verminderen.</li>
	<li>Plot de genormaliseerde intensiteit van het geneesmiddel of de metaboliet ervan als een Boxplot of dichtheids curve om de verdeling over afzonderlijke cellen te visualiseren. Hier wordt R statistische software gebruikt, samen met het ggplot2 pakket.</li>
	<li>Bereken de metaboliseerde drug naar unmetabolized drug ratio door het delen van de overvloed van de drug metaboliet door die van de niet-metaboliseerde bovenliggende molecuul in elke cel (dat wil zeggen, 4-OHT en tamoxifen, respectievelijk. Opmerking: de correlatie tussen variaties van specifieke Raman pieken van belang en de variaties in MS pieken van het geneesmiddel of de metabolieten ervan kunnen worden bestudeerd. Dit is een aanvulling op de mogelijke correlatie tussen de drug zelf en de metaboliet in enkele cellen. Dit kan worden gedaan door de correlatiecoëfficiënt van Pearson te berekenen met behulp van een tweezijdige test. Er moet ook rekening worden gehouden met geavanceerdere integratieve benaderingen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Altschuler, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity:+do+differences+make+a+difference?.">Cellular heterogeneity: do differences make a difference?.</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+metabolomics+by+mass+spectrometry:+Advances,+challenges,+and+future+applications.">Single-cell metabolomics by mass spectrometry: Advances, challenges, and future applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. , (2019).</li><li>Bunnage, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Screening+of+Tamoxifen+Abundance+and+Effect+Using+Mass+Spectrometry+and+Raman-Spectroscopy.">Single-Cell Screening of Tamoxifen Abundance and Effect Using Mass Spectrometry and Raman-Spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (4), 2710-2718 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+lipidomics+using+single-cell+Raman+spectroscopy.">In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3809-3814 (2011).</li><li>Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+Raman+observation+of+cytochrome+c+dynamics+during+apoptosis.">Label-free Raman observation of cytochrome c dynamics during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 28-32 (2012).</li><li>Palonpon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+SERS+microscopy+for+molecular+imaging+of+live+cells.">Raman and SERS microscopy for molecular imaging of live cells.</a> Nature Protocols. 8 (4), 677-692 (2013).</li><li>Butler, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Raman+spectroscopy+to+characterize+biological+materials.">Using Raman spectroscopy to characterize biological materials.</a> Nature Protocols. 11 (4), 664-687 (2016).</li><li>Mark, H., Workman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemomtrics in Spectroscopy. , (2018).</li><li>Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+subtraction+of+fluorescence+from+biological+Raman+spectra.">Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra.</a> Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).</li><li>Germond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectral+signature+reflects+transcriptomic+features+of+antibiotic+resistance+in+Escherichia+coli.">Raman spectral signature reflects transcriptomic features of antibiotic resistance in Escherichia coli.</a> Communications Biology. 1, 85 (2018).</li><li>Wold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+Least+Squares+Projections+to+Latent+Structures+(PLS)+in+Chemistry.">Partial Least Squares Projections to Latent Structures (PLS) in Chemistry.</a> Encyclopedia of Computational Chemistry. , (2002).</li><li>Chong, I. G., Jun, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+some+variable+selection+methods+when+multicollinearity+is+present.">Performance of some variable selection methods when multicollinearity is present.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 78, (2005).</li><li>Inde, Z., Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+non-genetic+heterogeneity+on+cancer+cell+death.">The impact of non-genetic heterogeneity on cancer cell death.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1), 99-114 (2018).</li><li>Pan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-probe:+a+miniaturized+multifunctional+device+for+single+cell+mass+spectrometry+analysis.">The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis.</a> Analytical chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).</li><li>Rao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+Single-probe:+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Single+Cell+Analysis+under+Ambient+Conditions.">Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e53911 (2016).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Live+Single-cell+Mass+Spectrometry+with+Spatial+Evaluation+by+Three-Dimensional+Holographic+and+Tomographic+Laser+Microscopy.">Quantitative Live Single-cell Mass Spectrometry with Spatial Evaluation by Three-Dimensional Holographic and Tomographic Laser Microscopy.</a> Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (2), 125-127 (2016).</li><li>Abouleila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+single+cell+mass+spectrometry+reveals+cancer-specific+metabolic+profiles+of+circulating+tumor+cells.">Live single cell mass spectrometry reveals cancer-specific metabolic profiles of circulating tumor cells.</a> Cancer Science. 110, 697-706 (2018).</li><li>Hiyama, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Lipido-Metabolomics+of+Single+Floating+Cells+for+Analysis+of+Circulating+Tumor+Cells+by+Live+Single-cell+Mass+Spectrometry.">Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry.</a> Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 31 (12), 1215-1217 (2015).</li><li>Ryabchykov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+MALDI+Spectrometric+Imaging+and+Raman+Spectroscopic+Data+for+the+Analysis+of+Biological+Samples.">Fusion of MALDI Spectrometric Imaging and Raman Spectroscopic Data for the Analysis of Biological Samples.</a> Frontiers in Chemistry. 6, 257 (2018).</li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

In dit manuscript werd een simpele zaak gekozen waarin HepG2 cellen werden blootgesteld (of niet) aan Tamoxifen. Het vermogen van een Raman-spectroscopie en massaspectrometrie systeem wordt aangetoond dat het monitoren van de effecten van Tamoxifen op cellen. Raman-spectroscopie liet de identificatie van potentiële biomarkers zien die een algemene respons van enkelvoudige cellen tot blootstelling aan het geneesmiddel reflecteerde. Sommige heterogeniteit tussen enkele cellen werd waargenomen, wat suggereert dat sommige cellen niet reageerden op blootstelling aan geneesmiddelen. Aan de andere kant was LSC-MS in staat om een gerichte analyse van het medicijn en de metaboliet ervan op het eencellige niveau uit te voeren, waarbij een hoge mate van heterogeniteit werd waargenomen in het medicijn en de overvloed aan metaboliet. Deze heterogeniteit helpt verklaren waarom sommige cellen worden beïnvloed door het medicijn terwijl anderen schijnbaar niet zijn, ondanks de cellen die afkomstig zijn van een zogenaamd uniforme populatie12.
Onder bijzondere aspecten van deze techniek die aandacht vereisen, is het belangrijk om de kwaliteit van de Microscoop-opstelling en signaalverwerking te evalueren om de reproduceerbaarheid van de gegevens te garanderen. Als voor verwerking van de spectra zorgvuldig wordt gedaan, moeten de signaal variaties worden gemaximaliseerd op het lokale maximum van elke piek. De baseline en de rand van de spectra moeten daarentegen overlappen tussen de geteste celcondities. Een ander belangrijk aspect is het multivariate-model dat wordt gebruikt om verschillen tussen behandelingen te onderzoeken. Men moet de modellen en model parameters zorgvuldig evalueren om een nauwkeurige en nauwkeurige analyse te garanderen. Een voordeel van het PLS-model, in tegenstelling tot neurale netwerken, is dat het toegang geeft tot de gewichten die zijn gekoppeld aan elke golflengte (Raman shifts) die het beste de door het model geteste voorwaarden kunnen onderscheiden.
Ondanks dat de Raman-spectroscopie de reactie van de drug met succes heeft gediscrimineerd, moet worden benadrukt dat deze techniek beperkt is in het gebruik ervan om biologische interpretatie te bieden. Dit is vooral te wijten aan de complexiteit van het spectrale signaal, dat een mengsel van duizenden moleculen omvat. Daarom is verder onderzoek nodig om systematische variaties tussen Raman spectrale intensiteiten en variaties in geneesmiddelconcentraties te evalueren. Ook, soortgelijke studies van andere cellijnen zijn nodig om de generalisatie van spectrale biomarkers geassocieerd met tamoxifen te evalueren.
Bovendien, het kan van belang zijn voor het uitvoeren van levende weefsels metingen om de farmacodynamiek te beoordelen en te bestuderen hoe drugs doordringen en stromen binnen elke cel. Bovendien moet worden opgemerkt dat de bemonsterings stap in de LSC-MS sterk afhankelijk is van de vaardigheid van de exploitant. Parameters zoals ruimtelijke resolutie, celpositie binnen het capillair na bemonstering en doorvoer sterkte zijn volledig afhankelijk van de operator, waardoor grootschalige acceptatie van LSC-MS wordt beperkt. Hoewel geautomatiseerde bemonsteringssystemen dit probleem kunnen verlichten. Bovendien, terwijl LSC-MS blinkt uit bij het bemonsteren aanhangend of zwevende cellen in hun inheemse toestanden, het presteert meer slecht in monster cellen ingebed in weefsel secties. Dit is te wijten aan de neiging van de bemonstering capillaire tip te breken als de sample dichtheid hoog is. Daarom kan een andere benadering, zoals de enkelvoudige sonde, in dergelijke gevallen14,15geschikter zijn.
Aangezien de hier gebruikte cellen worden bemonsterd in omgevingscondities met een minimale monstervoorbereiding, kunnen LSC-MS eenvoudig worden geïntegreerd met andere technologieën, zoals blijkt uit de integratie met Raman in dit protocol. Een andere soortgelijke integratie met 3D-holografie heeft toegestaan voor het bereiken van absolute kwantatie van cellulaire metabolieten op het subcellulaire niveau16. Bovendien, integratie met Flow flowcytometrieonderzoeken heeft toegestaan voor het afdekken van metabole biomarkers in enkele circulerende tumorcellen van neuroblastoom kankerpatiënten17,18.
In de toekomst, als gevolg van recente toenemende belangstelling voor het combineren van datasets van Imaging modaliteiten19, kan het ook interessant zijn om de systematische variaties tussen Raman-signalen en massaspectrometrie resultaten (evenals andere omics-methoden) te bestuderen door gebruik te maken van integratieve computationele benaderingen. Interessant genoeg hebben we al verschillende zwakke, maar significante lineaire correlaties gevonden tussen de intensiteiten van Raman pieken geïdentificeerd door VIPSCORES en de overvloed van Tamoxifen of zijn metaboliet op het eencellige niveau zoals geïdentificeerd door MS4. Deze gegevens kunnen duiden op een metabole relatie tussen MS-profielen en Raman spectra en de mogelijkheid om deze waarden te voorspellen.

Cellen reageren verschillend op veranderingen in hun micro omgeving op het eencellige niveau, een fenomeen dat cellulaire heterogeniteit1wordt genoemd. Ondanks dit, huidige Drug Discovery studies zijn gebaseerd op de gemiddelde metingen van de celpopulaties, die verdoezelen informatie over mogelijke subpopulaties, alsmede eencellige variaties2. Deze ontbrekende informatie kan verklaren waarom sommige cellen zijn gevoeliger voor drugs, terwijl anderen resistent zijn. Belangwekkend, het ontbreken van eencellige informatie over drug Response is een mogelijke reden voor het falen van fase II klinische proeven van drugs3. Daarom, om dit probleem op te lossen, cellulaire interacties met de drug (dat wil zeggen, opname, metabolisme, en reactie) moet worden gemeten op het niveau van de eencellige.
Om dit te bereiken, hebben we een uniek systeem ontworpen waarin levende enkelvoudige cellen worden gescreend met behulp van label vrije Raman-spectroscopie en vervolgens verder worden gekarakteriseerd met behulp van massaspectrometrie4. Raman-spectroscopie biedt een moleculaire vingerafdruk van de cellulaire toestand, een complex spectrum dat voortvloeit uit de bijdragen van vele moleculen in de cel. Ondanks deze complexiteit kan worden overwogen dat Raman-vingerafdrukken de structuur en de stofwisseling van een hele cel weerspiegelen,5,6. De Raman-spectroscopie blinkt uit in het meten van cellulaire toestanden op een niet-invasieve en relatief hoge doorvoer wijze, wat het nuttig maakt voor het screenen en beoordelen van de geneesmiddel respons op het eencellige niveau.
MS biedt daarentegen de vereiste gevoeligheid en selectiviteit voor het meten van de opname van geneesmiddelen op het eencellige niveau. Aangezien MS destructief is (het voorbeeld [cel] wordt meestal verbruikt tijdens de analyse), het integreren met niet-destructieve, label-vrije Raman-spectroscopie kan een hoge doorvoer en gevoelig systeem bieden. Dit gecombineerde platform is in staat om meer informatie te verstrekken over de opname van geneesmiddelen, metabolisme, en effecten op het niveau van de eencellige.
Dit manuscript verheldeert een protocol dat wordt gebruikt om cellulaire interacties met geneesmiddelen op het eencellige niveau te bestuderen met behulp van in vitro culturen door gebruik te maken van een geïntegreerd Raman-MS-platform. Om dit te doen, hepatocellulaire carcinoom cellen (HepG2) en Tamoxifen worden gebruikt als een model. HepG2 cellen werden gekozen omdat ze Tamoxifen nemen en metaboliseren de drug, en ze worden gelijktijdig getroffen als gevolg van de Hepatotoxische effecten. In dit manuscript worden twee toestanden gebruikt: met drugs behandelde cellen versus niet-behandelde cellen (controle).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% penicillin-streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass bottom grid dish</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxy Tamoxifen standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm diode pumped solid-state laser</td>
			<td>Ventus, Laser Quantum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOS-L101T-S motorized microscope stage</td>
			<td>OptoSigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-2 cellomics coated sampling capillaries</td>
			<td>HUMANIX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d5-Tamoxifen standard</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide LC-MS grade</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf GELoader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone laboratories</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cell line (RCB1886)</td>
			<td>RIKEN cell bank center</td>
			<td>RCB1886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC0-19A1C Incubator</td>
			<td>Sanyo Electric Co.</td>
			<td>MC0-19A1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1060352500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMO-203 3-D Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MMO-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoflex nano-ESI adaptor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-stage incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce LTQ Velos ESI calibration solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIXIS BR400 cooled CCD camera</td>
			<td>Princeton Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail collagen coating solution</td>
			<td>Cell Applications Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85256</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated raman spectroscopy and mass spectrometry platform to study single-cell drug uptake, metabolism, and effects

Cellen zijn bekend dat ze inherent heterogeen zijn in hun reacties op drugs. Daarom is het essentieel dat de heterogeniteit van één cel wordt verantwoord in onderzoeken naar geneesmiddelen ontdekking. Dit kan worden bereikt door het nauwkeurig meten van de overvloed aan cellulaire interacties tussen een cel en drug op het niveau van één cel (dat wil zeggen, drug opname, metabolisme, en effect). Dit artikel beschrijft een single-cell Ramanspectroscopie en massaspectrometrie (MS) platform om metabolische veranderingen van cellen in reactie op drugs te controleren. Met behulp van dit platform, metabole veranderingen in reactie op het medicijn kan worden gemeten door Raman-spectroscopie, terwijl de drug en de metaboliet kan worden gekwantificeerd met behulp van massaspectrometrie in dezelfde cel. De resultaten suggereren dat het mogelijk is om toegang te krijgen tot informatie over de opname van de drug, metabolisme, en reactie op een eencellige niveau.

Enkelvoudige celanalyse van geneesmiddelinteracties (opname, metabolisme en effecten) is essentieel voor het ontdekken van een verborgen of resistente subpopulatie en het begrijpen van de effecten van cellulaire heterogeniteit. In dit protocol werden twee complementaire technieken gebruikt om de bovengenoemde interacties in afzonderlijke cellen te meten: Raman-spectroscopie en MS. Raman-spectrometrie identificeren snel cellen die zijn aangetast door geneesmiddelen op basis van spectrale biomarkers van de geneesmiddel respons. MS wordt gebruikt om de opname en het metabolisme van het medicijn op selectieve en semi-kwantitatieve wijze te monitoren. Cellen werden voor het eerst gescreend door Raman-spectroscopie en vervolgens individueel bemonsterd voor analyse door MS.
Een vergelijkende analyse van het gemiddelde spectrum van elke aandoening (met en zonder medicamenteuze behandeling) wordt weergegeven in Figuur 2. Het gemiddelde spectrum van de twee voorwaarden verschilt duidelijk bij verschillende pieken, die eerder werden geïdentificeerd en toegewezen aan moleculaire verbindingen2. Met name de pieken op 1000 cm- (toegewezen aan aromatische verbindingen zoals fenylalanine en tyrosine) vertonen sterke verschillen. De significantie van het statistisch verschil moet worden beoordeeld aan de hand van verdere multivariate analyses.
De gegevensset werd vervolgens gebruikt om een PLS-model (stappen 4.5-4.8) te trainen, gericht op het onderscheiden van de twee celbehandelingen (met geneesmiddel: n = 290, zonder drugs: n = 115). De voorspellende mogelijkheid voor het classificeren van de cellen gekweekt in de aanwezigheid van Tamoxifen bereikte 100% gevoeligheid en 72% specificiteit in de testgegevens (onbekend van de cross-gevalideerde getrainde model). Gevoeligheid is een maatstaf voor de werkelijke positieven die correct worden geïdentificeerd door het model, terwijl specificiteit een maat is van de werkelijke negatieven die door het model worden geïdentificeerd. Alternatieve modellen zoals Svm's, LDAs en neurale netwerken kunnen vergelijkbare of betere resultaten bieden, hoewel er in deze studie geen uitgebreide vergelijking is uitgevoerd.
Op basis van het PLS-model werden de VIP-scores berekend, die het belang vertegenwoordigen van golflengten (Raman shifts) bij het discrimineren van de experimentele omstandigheden (Figuur 3). Belangrijk is dat de hoogste toppen van de VIP-profielen overeenkwamen met Raman Peaks, waarvoor sterke verschillen werden gezien tussen de twee behandelingen. Dit bevestigde de specifieke moleculaire verschillen tussen behandelde en onbehandelde cellen. Bijgevolg kunnen onderzoekers mogelijke spectrale biomarkers identificeren die de respons van enkelvoudige cellen op medicamenteuze behandeling weerspiegelen. Deze biomarkers kunnen verder worden getest om hun biologische relevantie en generalisatie over verschillende omstandigheden en cellijnen te controleren.
Een live eencellige massaspectrometrie (LSC-MS) systeem was in staat om zowel de drug en de metabolieten te detecteren in enkelvoudige, drug behandelde HepG2 cellen die eerder werden gemeten door Raman-spectroscopie. Daarnaast kunnen tandem-MS worden gebruikt om de structuur van beide moleculen te bevestigen. Na positieve identificatie, de relatieve overvloed van het geneesmiddel en de metabolieten ervan werden gemeten in elke cel en vergeleken met de achtergrond pieken in onbehandelde cellen. Sterke variatie werd waargenomen in de overvloed van Tamoxifen, en dit fenomeen was nog meer uitgesproken in het geval van de metaboliet, 4-OHT (Figuur 4). De relatie tussen de overvloed aan tamoxifen en zijn metabolieten werd ook bestudeerd, waarbij een significante positieve correlatie werd gevonden tussen de twee (r = 0,54, p = 0,0001, n = 31).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig1.jpg"> Figuur 1: cel picking systeem gemonteerd op een Microscoop fase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig2.jpg"> Figuur 2: gemiddeld spectrum van de met geneesmiddelen behandelde cellen (met tamoxifen: n = 295) en onbehandelde cellen (zonder Tamoxifen: n = 115). Raman pieken kunnen worden geïdentificeerd uit de literatuur. De meeste sterke spectrale verschillen zijn statistisch significant (ANOVA, p ≤ 0,5) zoals eerder beschreven4. Dit cijfer is gewijzigd van een vorige publicatie4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig3.jpg"> Afbeelding 3: VIP-scores geëxtraheerd uit het VOORSPELLENDE pls-model. VIP-scores weerspiegelen de golflengten die bijdragen aan het onderscheiden van de twee klassen in het model. De meeste pieken corresponderen met specifieke moleculen die worden waargenomen als spectrale biomarkers van geneesmiddel effecten op met drugs behandelde cellen. Dit cijfer is gewijzigd van een vorige publicatie4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig4.jpg"> Figuur 4: verdeling van de abundantie van Tamoxifen en zijn metaboliet. Verdeling van de overvloed aan tamoxifen en zijn metaboliet, 4-OHT (gemeten op het eencellige niveau) in vergelijking met endogene pieken in de onbehandelde cellen (controle). Dit cijfer is gewijzigd van een vorige publicatie4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects at JoVE.com

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Dit protocol presenteert een geïntegreerde Ramanspectroscopie-massaspectrometrie (MS) platform dat is geschikt voor het bereiken van één-cel resolutie. Raman-spectroscopie kan worden gebruikt om cellulaire reactie op drugs te bestuderen, terwijl MS kan worden gebruikt voor gerichte en kwantitatieve analyse van de opname van geneesmiddelen en metabolisme.

Een geïntegreerde Raman-spectroscopie en massaspectrometrie platform voor het bestuderen van de opname van één cel drug, metabolisme, en effecten

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

We ontwikkelden een innovatieve methode voor metabolomics. We combineerden de Belfort spectrale beeldvorming van levende cellen met eencellige massaspectrometrie. Onze techniek kan de metabolische veranderingen van enkele cellen tegen geneesmiddelen monitoren en voorspellen.En dit opent veel toepassing voor basics onderzoek en industrie. Onze methode voegt eencellige resolutie aan de huidige drug evaluatie technieken die sterk zal helpen toekomstige drug discovery inspanningen. Onze techniek kan ons ook helpen de rol te begrijpen die cellulaire heterogeniteit speelt bij kankerresistentie.De single-cell sampling en data-analyse zijn de meest uitdagende aspecten in dit experiment. We zijn momenteel bezig met het automatiseren van deze twee stappen, met name het bemonsteringsgedeelte. We raden u aan de bemonstering met één cel ruim voor het experiment te oefenen, omdat elke micromanipulator-instelling iets anders is en u de tijd moet nemen om vertrouwd te raken met de besturingselementen.Na het uitbroeden van cellen tot 70% samenvloeiing, cultuur cellen van belang in een geschikte cultuur media, voeg Penicilline-Streptomycine om besmetting te voorkomen. Na het meten van de celdichtheid op een hemocytometer, subcultuur cellen in een 35 millimeter glazen bodem rooster schotel of kwarts dia's, met behulp van hetzelfde medium bij een zaaidichtheid van 0,7 keer 10 tot de zesde. Dan incubeer op 37 graden celsius voor 24 uur.De volgende dag bereiken de cellen een samenloop van 50 tot 60%Was de cellen twee keer met een voorverwarmde PBS-buffer bij 37 graden Celsius. Verdeel de cellen in behandelde en onbehandelde subgroepen in 35 millimeter kweekschotels. Meng Tamoxifen opgelost in dimethylsulfoxide met de kweekmedia om een eindvolume van twee milliliter en Tamoxifen concentratie van 10 micromolar te verkrijgen.Dit is de behandelde groep. Meng een overeenkomstig volume DMSO in het medium als een controlegroep om de effecten van DMSO te bestuderen. Broed beide groepen in twee milliliter van de spiked media gedurende 24 uur om een samenvloeiing van 70 tot 80% voorafgaand aan spectrale metingen te bereiken, controleer het gaatje en laser positie overeenkomen met behulp van een doel.Om de spectrofotometer voorafgaand aan elk experiment te kalibreren, plaatst u ethanol in een glazen bodemschaal, meet u het spectrum bij een bepaalde laserintensiteit gedurende een seconde en koppelt u de piek aan bekende golflengten. Stel vervolgens de microkamer in op 5% kooldioxide en 37 graden Celsius. Zodra het microscoopsysteem klaar is, verwijder cellen uit de couveuse en spoel onmiddellijk cellen tweemaal met opgewarmde PBS buffer bij 37 graden celsius.Voeg vervolgens twee milliliter opgewarmde PBS of FluoroBrite DMEM toe. Voeg 10 microliter water toe aan de objectieve lens van de wateronderdompeling. En delicaat plaats de glazen bodem cel schotel op de microscoop podium.Bevestig het celbemonsteringssysteem op de Raman microscoop. Sluit de 3D-micromanipulator aan op de glazen capillaire houder die is bevestigd aan een lege spuit om het monster te zuigen. Stel de microscoop op een hoge vergroting veld van 40 keer om de punt van het glas capillaire observeren, en zorg ervoor dat het niet is gebroken.Bedien de positie van de glazen capillaire met behulp van de micromanipulator. Zorg ervoor dat de capillaire tip gecentreerd is in het gezichtsveld. Verplaats vervolgens de capillaire op de Z-as om later toestemming te geven voor het kweekgerecht.Plaats de monsterschotel op het podium van de microscoop, pas de vergroting en focus aan, selecteer de doelcel op de rasterschaal en verplaats deze naar het midden van de weergave. Meet elke cel door de laserlijn scherp te stellen. Een blootstellingstijd van 15 seconden per cel is voldoende om een dwarsdoorsnede van een cel met een duidelijk Raman-signaal te verkrijgen.Een galvano-spiegel maakt het scannen van een cel of een groep cellen binnen enkele tientallen minuten. Laat de glazen capillaire vervolgens voorzichtig zakken met behulp van micromanipulator totdat de punt in beeld komt. Raak onder microscopisch beeld de doelcel aan met de capillaire punt.Dan beginnen met het toepassen van negatieve druk met behulp van de spuit om de cel val in de capillaire tip. Neem deze procedure op door een video te maken om de timing en de gezogen locatie van de cel nauwkeurig te controleren. Verplaats de capillaire omhoog op de Z-as.Maak vervolgens de capillaire los van de capillaire houder met behulp van tangen ter voorbereiding op massaspectrometrieanalyse. Na het opzetten van de massaspectrometrie-instrument en het analyseren van de media, voeg twee microliters van de ionisatie oplosmiddel aan de capillaire met de cel. Bevestig de capillaire op een nano-elektrospray adapter aangesloten op een geschikte massaspectrometer en start de automatische acquisitiemethode.Hier wordt een vergelijkende analyse van het gemiddelde spectrum van elke aandoening, met en zonder behandeling van geneesmiddelen, getoond. Het gemiddelde spectrum van de twee voorwaarden verschilt duidelijk op verschillende pieken. Met name de pieken op 1.000 per centimeter, wat een teken is voor aromatische verbindingen zoals fenylalanine en tyrosine, vertonen sterke verschillen.Op basis van de projectie op latent structuurmodel werden de VIP-scores berekend die het belang van golflengten vertegenwoordigen bij het discrimineren van de experimentele omstandigheden. Belangrijk is dat de hoogste pieken van de VIP-profielen overeenkwamen met Raman-pieken waarvoor sterke verschillen werden gezien tussen de twee behandelingen. Dit bevestigde de specifieke moleculaire verschillen tussen behandelde en onbehandelde cellen.Na positieve identificatie werden de relatieve overvloed van het medicijn en de metabolieten gemeten in elke cel en vergeleken met achtergrondpieken in onbehandelde cellen. Sterke variatie werd waargenomen in Tamoxifen overvloed. En dit fenomeen was nog duidelijker in het geval van zijn metaboliet 4-hydroxy-tamoxifen.Onderzoekers kunnen geïnteresseerd zijn in het verkennen van het verband tussen spectrale beelden en de metabole profielen van cellen. Ons onderzoek heeft ook industriële toepassingen omdat het lokale screening van cellen voor farmaceutische productie mogelijk maakt. Er moet voor worden gezorgd bij de voorbereiding van het ionisatieoplosmiddel voor de metingen van de massaspectrometer.Het moet worden bereid onder een rookkap. Let ook op dat u de ionenbron van het massaspectrometerinstrument niet aanraakt om te voorkomen dat het geëlektrocuteerd wordt. Ten slotte zijn de bemonsteringsvaten die tijdens de meting worden gebruikt, zeer scherp, dus behandel ze met zorg om letsel te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Het vervaardigen van een UV-Vis en Raman spectroscopie Immunoassay Platform

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Een plasmamonstervoorbereiding voor massaspectrometrie met behulp van een geautomatiseerd werkstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...