Name: an integrated raman spectroscopy and mass spectrometry platform to study single-cell drug uptake, metabolism, and effects
Uploaded: 2020-01-09T14:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects at JoVE.com

המחברים מודים טושיו Yanagida על תמיכתו ו RIKEN קרנות שיתוף פעולה פנימי המיוחס ד ר ארנו גרמונד.

<ol>
	<li>Altschuler, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity:+do+differences+make+a+difference?.">Cellular heterogeneity: do differences make a difference?.</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+metabolomics+by+mass+spectrometry:+Advances,+challenges,+and+future+applications.">Single-cell metabolomics by mass spectrometry: Advances, challenges, and future applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. , (2019).</li><li>Bunnage, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Screening+of+Tamoxifen+Abundance+and+Effect+Using+Mass+Spectrometry+and+Raman-Spectroscopy.">Single-Cell Screening of Tamoxifen Abundance and Effect Using Mass Spectrometry and Raman-Spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (4), 2710-2718 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+lipidomics+using+single-cell+Raman+spectroscopy.">In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3809-3814 (2011).</li><li>Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+Raman+observation+of+cytochrome+c+dynamics+during+apoptosis.">Label-free Raman observation of cytochrome c dynamics during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 28-32 (2012).</li><li>Palonpon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+SERS+microscopy+for+molecular+imaging+of+live+cells.">Raman and SERS microscopy for molecular imaging of live cells.</a> Nature Protocols. 8 (4), 677-692 (2013).</li><li>Butler, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Raman+spectroscopy+to+characterize+biological+materials.">Using Raman spectroscopy to characterize biological materials.</a> Nature Protocols. 11 (4), 664-687 (2016).</li><li>Mark, H., Workman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemomtrics in Spectroscopy. , (2018).</li><li>Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+subtraction+of+fluorescence+from+biological+Raman+spectra.">Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra.</a> Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).</li><li>Germond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectral+signature+reflects+transcriptomic+features+of+antibiotic+resistance+in+Escherichia+coli.">Raman spectral signature reflects transcriptomic features of antibiotic resistance in Escherichia coli.</a> Communications Biology. 1, 85 (2018).</li><li>Wold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+Least+Squares+Projections+to+Latent+Structures+(PLS)+in+Chemistry.">Partial Least Squares Projections to Latent Structures (PLS) in Chemistry.</a> Encyclopedia of Computational Chemistry. , (2002).</li><li>Chong, I. G., Jun, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+some+variable+selection+methods+when+multicollinearity+is+present.">Performance of some variable selection methods when multicollinearity is present.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 78, (2005).</li><li>Inde, Z., Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+non-genetic+heterogeneity+on+cancer+cell+death.">The impact of non-genetic heterogeneity on cancer cell death.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1), 99-114 (2018).</li><li>Pan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-probe:+a+miniaturized+multifunctional+device+for+single+cell+mass+spectrometry+analysis.">The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis.</a> Analytical chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).</li><li>Rao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+Single-probe:+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Single+Cell+Analysis+under+Ambient+Conditions.">Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e53911 (2016).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Live+Single-cell+Mass+Spectrometry+with+Spatial+Evaluation+by+Three-Dimensional+Holographic+and+Tomographic+Laser+Microscopy.">Quantitative Live Single-cell Mass Spectrometry with Spatial Evaluation by Three-Dimensional Holographic and Tomographic Laser Microscopy.</a> Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (2), 125-127 (2016).</li><li>Abouleila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+single+cell+mass+spectrometry+reveals+cancer-specific+metabolic+profiles+of+circulating+tumor+cells.">Live single cell mass spectrometry reveals cancer-specific metabolic profiles of circulating tumor cells.</a> Cancer Science. 110, 697-706 (2018).</li><li>Hiyama, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Lipido-Metabolomics+of+Single+Floating+Cells+for+Analysis+of+Circulating+Tumor+Cells+by+Live+Single-cell+Mass+Spectrometry.">Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry.</a> Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 31 (12), 1215-1217 (2015).</li><li>Ryabchykov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+MALDI+Spectrometric+Imaging+and+Raman+Spectroscopic+Data+for+the+Analysis+of+Biological+Samples.">Fusion of MALDI Spectrometric Imaging and Raman Spectroscopic Data for the Analysis of Biological Samples.</a> Frontiers in Chemistry. 6, 257 (2018).</li></ol>

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

בכתב היד הזה, נבחר מקרה פשוט שבו HepG2 תאים נחשפו (או לא) לטמוקסיפן. היכולת של ספקטרוסקופיית ראמאן ומערכת ספקטרומטר המסה ממחישה כדי לפקח על ההשפעות של טמוקסיפן על התאים. ספקטרוסקופיית ראמאן מאפשר זיהוי של סמנים פוטנציאליים שיקפו תגובה כללית של תאים בודדים לחשיפה לסמים. כמה טרוגניות בין תאים בודדים נצפתה, טוען כי כמה תאים לא הגיבו לחשיפה לסמים. מצד שני, LSC-MS היה מסוגל לבצע ניתוח ממוקד של התרופה ואת מטבוליזם שלה ברמה תא בודד, שבו רמה גבוהה של טרוגניות נצפתה בתרופה ואת השפע מטבוליזם שלה. טרוגניות זה עוזר להסביר מדוע תאים מסוימים מושפעים התרופה בעוד אחרים הם לכאורה לא, למרות התאים שמקורם באוכלוסייה אחידה לכאורה12.
בין היבטים מסוימים של טכניקה זו הדורשת תשומת לב, חשוב להעריך את איכות הגדרת המיקרוסקופ ועיבוד האותות כדי להבטיח את הנתונים. אם עיבוד מקדים של הספקטרום מתבצע בקפידה, יש להגדיל את וריאציות האות במקסימום של כל שיא. לעומת זאת, הבסיס והקצה של הספקטרום צריכים לחפוף בין תנאי התא שנבדקו. היבט חשוב נוסף הוא מודל רב-משתנים המשמש לחקר הבדלים בין טיפולים. יש להעריך בקפידה את המודלים ואת פרמטרי המודל כדי להבטיח ניתוח מדויק ומדויק. אחד היתרונות של המודל PLS, בניגוד לרשתות עצביות, הוא שזה מאפשר גישה למשקולות הקשורות לכל אורך הגל (ראמאן משמרות) הבחנה הטובה ביותר את התנאים נבדק על ידי המודל.
למרות הספקטרוסקופית ראמאן מפלה בהצלחה את תגובת התרופה, יש להדגיש כי טכניקה זו מוגבלת בשימוש בה כדי לספק פרשנות ביולוגית. זה נובע בעיקר המורכבות של האות ספקטרלי, אשר כוללת תערובת של אלפי מולקולות. לפיכך, נדרשת חקירה נוספת להערכת וריאציות שיטתית בין עוצמות ווריאציות ספקטרליות של ראמאן בריכוזים של סמים. כמו כן, מחקרים דומים של קווי תאים אחרים נדרשים להעריך את ההכללה של סמנים ספקטרלי הקשורים טמוקסיפן.
יתר על כן, זה עשוי להיות עניין לבצע מדידות רקמות החיים כדי להעריך פרמקודינמיקה וללמוד כיצד סמים לחדור ולזרום בתוך כל תא. יתרה מזאת, יש לציין כי צעד הדגימה ב-LSC-MS תלוי מאוד במיומנות של המפעיל. פרמטרים כגון רזולוציה מרחבית, מיקום התא בתוך נימי לאחר הדגימה, וחוזק התפוקה הם לגמרי תלויים, אשר מגביל את האימוץ בקנה מידה גדול של LSC-MS. למרות שמערכות דגימה אוטומטיות עשויות להקל על הבעיה. יתר על כן, בעוד LSC-MS מצטיין בדיגום מחסיד או תאים צפים במדינות הילידים שלהם, היא מבצעת גרוע יותר בתאי דגימה מוטבע בסעיפים רקמות. הדבר נובע מהנטייה של עצה נימי הדגימה להישבר אם צפיפות המדגם גבוהה. לכן, גישה נוספת כגון בדיקה בודדת עשויה להיות מתאימה יותר במקרים כאלה14,15.
מאז התאים המשמשים כאן הם שנדגמו בתנאי הסביבה עם הכנה לדוגמה מינימלית, LSC-MS ניתן לשלב בקלות עם טכנולוגיות אחרות, כפי שמוצג על ידי שילוב שלה עם ראמאן בפרוטוקול זה. שילוב דומה נוסף עם הולוגרפיה תלת-ממדית מאפשר להשיג כימות מוחלטות של מטבוליטים סלולאריים ברמה התאית16. בנוסף, שילוב עם cy, הזרמת ביוטונסה אפשרה לגלות ביואריטים מטבולית בתאים סרטניים במחזור בודדים של חולי סרטן נוירובלסטומה17,18.
בעתיד, בשל ההתעניינות הגוברת האחרונה בשילוב מערכות נתונים מדפוסי הדמיה19, זה עשוי להיות גם עניין ללמוד את הווריאציות הסיסטמיות בין אותות ראמאן לבין תוצאות ספקטרומטר המסה (כמו גם שיטות אחרות omics) באמצעות גישות חישוביות אינטגרטיבית. מעניין, כבר מצאנו כמה חלשים אך משמעותיים ליניארי היחסים בין העוצמות של פסגות ראמאן מזוהה על ידי ציוני VIP שפע של טמוקסיפן או מטבוליזם שלה ברמה תא יחיד כפי שזוהה על ידי MS4. נתונים אלה עשויים להציע קשר מטבולי בין פרופילי MS וספקטרום ראמאן והאפשרות לחזות ערכים אלה.

תאים מגיבים באופן שונה לשינויים בסביבת המיקרו-שלהם ברמת התא הבודד, תופעה הנקראת טרוגניות סלולר1. למרות זאת, המחקרים הנוכחיים של גילוי הסמים מבוססים על מדידות ממוצעות של אוכלוסיות תאים, אשר מערפל מידע על אוכלוסיות משנה פוטנציאליות, וכן וריאציות של תא בודד2. מידע חסר זה עשוי להסביר מדוע תאים מסוימים רגישים יותר לסמים בעוד אחרים עמידים. מעניין, היעדר מידע תא יחיד על תגובת התרופה היא סיבה אפשרית לכישלון הניסויים הקליניים שלב II של תרופות3. לכן, כדי לטפל בבעיה זו, יש למדוד את האינטראקציות הסלולריות עם הסם (כלומר, ספיגת, חילוף החומרים והתגובה) ברמת התא היחיד.
כדי להשיג זאת, עיצבנו מערכת ייחודית שבה החיים תאים בודדים מוקרנים באמצעות התווית ספקטרוסקופית ראמאן לאחר מכן מאופיין עוד יותר באמצעות ספקטרומטר מסה4. ספקטרוסקופיית ראמאן מספק טביעת אצבע מולקולרית של המדינה התאית, ספקטרום מורכב הנובע מהתרומות של מולקולות רבות בתוך התא. למרות מורכבות זו, זה יכול להיחשב כי טביעות אצבע ראמאן משקפים מבנה של תא שלם חילוף חומרים5,6. הספקטרוסקופית ראמאן מצטיינת במדידת מצבים סלולאריים בצורה של תפוקה לא פולשנית וגבוהה יחסית, מה שהופך אותו לשימושי להקרנה ולהערכת תגובת הסמים ברמת התא היחיד.
לעומת זאת, MS מספק את הרגישות הנדרשת ואת הסלקטיביות למדידת ספיגת התרופה ברמה תא יחיד. מאז MS היא הרסנית (המדגם [תא] הוא נצרך בדרך כלל במהלך הניתוח), שילוב זה עם גמישה, תווית הספקטרוסקופית ראמאן יכול לספק תפוקה גבוהה ומערכת רגישה. פלטפורמה זו משולבת מסוגל לספק מידע נוסף על ספיגת הסמים, חילוף החומרים, ואפקטים ברמה תא יחיד.
כתב יד זה מהבהיר פרוטוקול המשמש לחקר אינטראקציות סלולריות עם סמים ברמה של תא יחיד באמצעות תרביות מבחנה באמצעות פלטפורמת ראמאן-MS משולבת. לשם כך, תאי קרצינומה של hepatocellular (HepG2) ו טמוקסיפן משמשים כמודל. תאים HepG2 נבחרו משום שהם לוקחים את טמוקסיפן מטבוליזם התרופה, והם מושפעים בו בשל ההשפעות hepatotoxic שלה. שתי מדינות משמשות בכתב יד זה: תאים שטופלו בסמים לעומת תאים שאינם מטופלים (בקרה).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% penicillin-streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass bottom grid dish</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxy Tamoxifen standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm diode pumped solid-state laser</td>
			<td>Ventus, Laser Quantum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOS-L101T-S motorized microscope stage</td>
			<td>OptoSigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-2 cellomics coated sampling capillaries</td>
			<td>HUMANIX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d5-Tamoxifen standard</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide LC-MS grade</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf GELoader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone laboratories</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cell line (RCB1886)</td>
			<td>RIKEN cell bank center</td>
			<td>RCB1886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC0-19A1C Incubator</td>
			<td>Sanyo Electric Co.</td>
			<td>MC0-19A1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1060352500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMO-203 3-D Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MMO-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoflex nano-ESI adaptor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-stage incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce LTQ Velos ESI calibration solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIXIS BR400 cooled CCD camera</td>
			<td>Princeton Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail collagen coating solution</td>
			<td>Cell Applications Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85256</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated raman spectroscopy and mass spectrometry platform to study single-cell drug uptake, metabolism, and effects

תאים ידועים להיות הטרוגנית מיסודו בתגובותיהם לסמים. לכן, חיוני כי תא בודד טרוגניות במחקרים גילוי סמים. זה יכול להיות מושגת על ידי מדידת מדויק של שפע של אינטראקציות סלולריות בין תא לבין תרופה ברמה תא יחיד (כלומר, ספיגת הסמים, חילוף החומרים, והתוצאה). המאמר מתאר את הפלטפורמה היחידה לניטור מטבולית של תאים בעלי תא יחיד ולנטר שינויים מטבוליים בתגובה לתרופות. באמצעות פלטפורמה זו, שינויים מטבולית בתגובה לתרופה ניתן למדוד על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן, בעוד התרופה ואת המטבולית שלה ניתן לכמת באמצעות ספקטרומטר מסה באותו תא. התוצאות מרמזות על כך שניתן לגשת למידע אודות ספיגת הסמים, חילוף החומרים והתגובה ברמה של תא בודד.

ניתוח תא בודד של אינטראקציות תרופות (ספיגת, חילוף החומרים ואפקטים) חיוני לחשוף כל האוכלוסייה החבויה או התרופות עמידים משנה, כמו גם הבנה של ההשפעות של טרוגניות הסלולר. בפרוטוקול זה, שתי טכניקות משלימות שימשו כדי למדוד את האינטראקציות הנ ל בתאים בודדים: ספקטרוסקופיית ו-MS. ראמאן במהירות מזהה תאים המושפעים על ידי תרופות המבוססות על סמנים ספקטרליות של תגובת התרופה. MS משמש לניטור ספיגת ומטבוליזם של הסם באופן סלקטיבי וחצי כמותי. תאים הוקרן לראשונה על ידי ספקטרוסקופיה ראמאן ולאחר מכן שנדגמו בנפרד עבור ניתוח על ידי MS.
ניתוח השוואתי של הספקטרום הממוצע של כל תנאי (עם ובלי טיפול בסמים) מוצג באיור 2. ספקטרום הממוצע של שני התנאים שונים בבירור בפסגות שונות, אשר זוהו בעבר והוקצו תרכובות מולקולריות2. במיוחד, הפסגות ב 1000 ס מ- (מוקצות תרכובות ארומטיות כגון פנילאלנין ו טירולך) להראות הבדלים חזקים. המשמעות של ההבדל הסטטיסטי צריך להיות מוערך על ידי ניתוח רב משתנים נוספים.
ערכת הנתונים היתה לאחר מכן להכשיר מודל PLS (שלבים 4.5-4.8) מיועד להבדיל בין שני טיפולי תאים (עם תרופה: n = 290, ללא סמים: n = 115). היכולת הניבוי לסווג את התאים המתורבתות בנוכחות טמוקסיפן הגיעו 100% רגישות ו 72% ספציפיות בנתוני הבדיקה (לא ידוע ממודל מאולף מחוצה אימות). רגישות היא מדד של התוצאות החיוביות האמיתיות המזוהות בצורה נכונה על-ידי המודל, בעוד שהספציפיות היא מדד של התשלילים הממשיים המזוהים על-ידי המודל. דגמים חלופיים כגון SVMs, LDAs, ורשתות עצביות עשויים לספק תוצאות דומות או טובות יותר, למרות השוואה מקיפה לא בוצעה במחקר זה.
בהתבסס על מודל PLS, ציוני ה-VIP חושבו, אשר מייצגים את החשיבות של אורכי גל (משמרות ראמאן) להפלות את התנאים ניסיוני (איור 3). חשוב מכך, הפסגות הגבוהות ביותר של פרופילי ה-VIP התכתב עם פסגות ראמאן שבהן נראו הבדלים חזקים בין שני הטיפולים. זה אישר את ההבדלים המולקולריים הספציפיים בין תאים מטופלים ולא מטופלים. כתוצאה מכך, חוקרים יכולים לזהות סמנים ספקטרלי אפשריים המשקפים את התגובה של תאים בודדים לטיפול בסמים. ניתן לבדוק בסמנים אלה עוד כדי לאמת את הרלוונטיות הביולוגית שלהם ואת ההכללה בתנאים שונים וקווי תאים.
בשידור חי תא בודד המסה (LSC-MS) מערכת היתה אפשרות לזהות הן את התרופה מטבוליטים שלה בודד, תרופות מטופלים HepG2 תאים שנמדדו בעבר על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן. בנוסף, ניתן להשתמש ב-MS טנדם כדי לאשר את המבנה של שתי המולקולות. לאחר זיהוי חיובי, השפע היחסי של הסם ומטבוליטים נמדדו בכל תא ולעומת פסגות הרקע בתאים לא מטופלות. וריאציה חזקה נצפתה בשפע טמוקסיפן, תופעה זו היה אפילו יותר מבוטא במקרה של המטטבוליט שלה, 4-OHT (איור 4). הקשר בין שפע טמוקסיפן לבין מטבוליטים נחקרו גם, שבו מתאם חיובי משמעותי נמצא בין שני (r = 0.54, p = 0.0001, n = 31).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig1.jpg"> איור 1: מערכת איסוף תאים רכוב על במת מיקרוסקופ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig2.jpg"> איור 2: הספקטרום הממוצע של תאים שטופלו בסמים (עם טממוקסיפן: n = 295) ותאים לא מטופלים (ללא טמוקסיפן: n = 115). פסגות ראמאן ניתן לזהות מתוך הספרות. רוב ההבדלים ספקטרלי חזק הם משמעותיים מבחינה סטטיסטית (ANOVA, p ≤ 0.5) כמתואר בעבר4. איור זה השתנה מפרסום קודם4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig3.jpg"> איור 3: עשרות VIP שחולצו מן המודל PLS חזוי. ציוני VIP משקפים את אורכי הגל התורמים להבחנה בין שתי הכיתות במודל. רוב הפסגות מתאימות למולקולות ספציפיות שנצפו כסמנים ספקטרליות של השפעות הסמים על תאים שטופלו בסמים. איור זה השתנה מפרסום קודם4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig4.jpg"> איור 4: הפצת שפע טמוקסיפן והמטטבוליט שלה. התפלגות שפע של טמוקסיפן והמטאווליט שלה, 4-OHT (נמדד ברמת תא בודד) לעומת פסגות אנדוגני בתאים מטופל (שליטה). איור זה השתנה מפרסום קודם4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects at JoVE.com

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

פרוטוקול זה מציג את פלטפורמת משולבת ראמאן ספקטרוסקופית (MS) של המסה המסוגלת להשיג רזולוציה של תא בודד. ספקטרוסקופית ראמאן ניתן להשתמש כדי ללמוד תגובה תאית לסמים, בעוד MS יכול לשמש ניתוח ממוקד וכמותי של ספיגת התרופה ואת חילוף החומרים.

ספקטרוסקופיית ראמאן משולבת ופלטפורמת ספקטרומטר המסה ללימוד תא יחיד קליטת סמים, מטבוליזם, ואפקטים

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

פיתחנו שיטה חדשנית למטבולומיה. שילבנו את ההדמיה הספקטרלית של בלפרי של תאים חיים עם ספקטרומטריית מסה חד-תאית. הטכניקה שלנו יכולה לפקח ולחזות את השינויים המטבוליים של תאים בודדים נגד תרופות.וזה פותח הרבה יישום למחקר יסודות ותעשייה. השיטה שלנו מוסיפה רזולוציה חד-תאית לטכניקות הנוכחיות להערכת סמים אשר יסייעו מאוד למאמצי גילוי תרופות עתידיים. הטכניקה שלנו יכולה גם לעזור לנו להבין את התפקיד שמילאה הטרוגניות תאית בהתנגדות לסרטן.הדגימה החד-תאית וניתוח הנתונים הם ההיבטים המאתגרים ביותר בניסוי זה. אנו עובדים כעת על הפיכת שני שלבים אלה לאוטומטיים, במיוחד החלק של הדגימה. אנו ממליצים לך לתרגל את הדגימה של תא יחיד הרבה לפני הניסוי, כמו כל הגדרת micromanipulator הוא שונה במקצת ואתה צריך לקחת את הזמן כדי להכיר את הפקדים.לאחר דגירה תאים להגיע 70%confluency, תאי תרבות של עניין במדיה תרבותית מתאימה, להוסיף פניצילין-סטרפטומיצין כדי למנוע זיהום. לאחר מדידת צפיפות התאים בהמוציטמטר, תאי תת-תרבות לצלחת רשת תחתונה של 35 מילימטר זכוכית או מגלשות קוורץ, תוך שימוש באותו מדיום בצפיפות זריעה של פי 0.7 10 עד השישי. ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.למחרת, התאים מגיעים לקונפליה של 50 עד 60% לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ PBS מחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס. מחלקים את התאים לקבוצות משנה שטופלו בסמים ולא מטופלים במנות תרבות של 35 מילימטר. מערבבים טמוקסיפן מומס דימתיל סולפוקסיד עם התקשורת התרבותית כדי להשיג נפח סופי של שני מיליליטר וריכוז טמוקסיפן של 10 micromolar.זו הקבוצה שטופלה בסמים. ערבבו נפח תואם של DMSO למדיום כקבץ בקרה כדי לחקור את ההשפעות של DMSO. דגירה שתי הקבוצות בשני מיליליטר של התקשורת זינק במשך 24 שעות כדי להגיע לקונפליה של 70 עד 80% לפני מדידות ספקטרליות, לאמת את חור הסיכה ואת מיקום הלייזר להתאים באמצעות יעד.כדי לכייל את הספקטרופוטומטר לפני כל ניסוי, מניחים אתנול בצלחת תחתונה מזכוכית, מודדים את הספקטרום בעוצמת לייזר נתונה לשנייה אחת, ומקשרים את הפסגה לאורכי גל ידועים. ואז להגדיר את תא מיקרו ב 5% פחמן דו חמצני ו 37 מעלות צלזיוס. לאחר שמערכת המיקרוסקופ מוכנה, מוציאים תאים מהאינקובטור ומיד שוטפים תאים פעמיים עם חיץ PBS מחומם ב-37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר של PBS מחומם או FluoroBrite DMEM. מוסיפים 10 מיקרוליטרים של מים לעדשה האובייקטיבית של טבילת המים. ומ מניחים בעדינות את צלחת התא התחתון של הזכוכית על שלב המיקרוסקופ.תקן את מערכת דגימת התאים במיקרוסקופ של אמן. חבר את המיקרומניפולטור תלת-מימדי למחזיק נימי הזכוכית המחובר למזרק ריק למצצת דגימה. הגדר את המיקרוסקופ לשדה הגדלה גבוה של 40 פעמים כדי לבחון את קצה נימי הזכוכית, ולוודא שהוא לא שבור.לשלוט על המיקום של נימי הזכוכית באמצעות מיקרומניפולטור. ודא כי קצה נימי מרוכז בשדה המבט. ואז להזיז את נימי על ציר Z כדי לתת אישור עבור צלחת התרבות מאוחר יותר.מניחים את צלחת הדגימה על שלב המיקרוסקופ, מתאימים את ההגדלה והמיקוד, בוחרים את תא היעד בצלחת הרשת ומעבירים אותו למרכז הנוף. למדוד כל תא על ידי מיקוד קו הלייזר. זמן חשיפה של 15 שניות לכל תא מספיק כדי להשיג חתך רוחב של תא עם אות אמן ברור.מראה גלוונו מאפשרת סריקה של תא אחד או קבוצת תאים בתוך כמה עשרות דקות. ואז בזהירות להוריד את נימי הזכוכית באמצעות מיקרומניפולטור עד הקצה נכנס לפוקוס. תחת תצפית מיקרוסקופית, לגעת בתא היעד יחיד עם קצה נימי.ואז להתחיל להפעיל לחץ שלילי באמצעות המזרק כדי ללכוד את התא בתוך קצה נימי. הקלט הליך זה על-ידי צילום וידאו כדי לבדוק את התזמון ואת המיקום המוצץ של התא במדויק. הזז את נימי על ציר Z.לאחר מכן נתק את נימי ממחזיק נימי באמצעות מדפים כהכנה לניתוח ספקטרומטריית מסה. לאחר הגדרת מכשיר ספקטרומטריית המסה וניתוח המדיה, מוסיפים שני מיקרוליטרים של ממס היוניזציה ל נימי המכיל את התא. תקן את נימי מתאם ננו-אלקטרוספריי מחובר ספקטרומטר מסה מתאים ולהתחיל את שיטת הרכישה האוטומטית.ניתוח השוואתי של הספקטרום הממוצע של כל מצב, עם וללא טיפול תרופתי, מוצג כאן. הספקטרום הממוצע של שני התנאים שונה בבירור בפסגות שונות. בפרט, הפסגות ב 1, 000 אחוז סנטימטר, שהוא סימן תרכובות ארומטיות כגון פנילאלנין טירוזין, להראות הבדלים חזקים.בהתבסס על ההקרנה על מודל מבנה סמוי, ציוני VIP חושבו המייצגים את החשיבות של אורכי גל באפליית התנאים הניסיוניים. חשוב לציין, הפסגות הגבוהות ביותר של פרופילי VIP התאים לפסגות רמן אשר הבדלים חזקים נראו בין שני הטיפולים. זה אישר את ההבדלים המולקולריים הספציפיים בין תאים מטופלים ולא מטופלים.לאחר זיהוי חיובי, השפע היחסי של התרופה ומטבוליטים שלה נמדדו בכל תא בהשוואה לפסגות רקע בתאים לא מטופלים. וריאציה חזקה נצפתה בשפע טמוקסיפן. ותופעה זו הייתה בולטת עוד יותר במקרה של מטבוליט 4-הידרוקסי-טמוקסיפן שלה.חוקרים יכולים להיות מעוניינים לחקור את הקשר בין תמונות ספקטרליות לבין פרופילים מטבוליים של תאים. המחקר שלנו יש גם יישומים תעשייתיים כי זה מאפשר סינון מקומי של תאים לייצור תרופות. יש לדאוג בעת הכנת ממס היונים למדידות ספקטרומטר המסה.זה צריך להיות מוכן מתחת למכסה המנוע של אדים. כמו כן, היזהר לא לגעת במקור היון של מכשיר ספקטרומטר המסה כדי למנוע התחשמלות. לבסוף, נימי הדגימה המשמשים לאורך כל המדידה הם חדים מאוד, אז לטפל בהם בזהירות כדי למנוע פציעה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

בודה UV-Vis ראמאן ספקטרוסקופיה פלטפורמת Immunoassay

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...