Name: an integrated raman spectroscopy and mass spectrometry platform to study single-cell drug uptake, metabolism, and effects
Uploaded: 2020-01-09T14:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects at JoVE.com

Os autores agradecem toshio yanagida por seu apoio e RIKEN fundos colaborativos internos atribuídos ao Dr. Arno Germond.

1. Cultura celular
<ol><li>Células de cultura de interesse em uma mídia cultural apropriada. Penicilina-estreptomicina pode ser adicionada para evitar a contaminação. No caso das células HepG2, as células culturais em uma mídia cultural contendo o meio modificado da Águia de Dulbecco (DMEM) complementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 0,1% penicilina-estreptomicina. Para faciltate Raman medições espectroscopia, as células podem ser cultivadas em um 0,1% de gelatina revestido prato de vidro-bottom ou slides de quartzo.</li>
	<li>Incubate células por 2 dias a 37 °C e 5% CO2 em uma incubadora umidificada.</li>
	<li>Sincronizar as culturas celulares para chegar a 70% de confluência.</li>
	<li>Células subculturais em um prato de grade de 35 mm com fundo de vidro ou lâminas de quartzo usando o mesmo meio em uma densidade de semeadura de 0,7 x 106, em seguida, incubar a 37 °C para 24 h. NOTA: Pratos ou slides de cultura podem ser pré-revestidos com solução de revestimento de colágeno ou gelatina com uma relação de superfície de cultura de 5 ug/cm2 para permitir que eles consertem, garantindo sua sobrevivência durante a medição.</li>
</ol>2. Tratamento medicamentoso
<ol><li>Retire as culturas celulares da incubadora e lave 2x com tampão PBS pré-aquecido (37 °C). NOTA: É ideal para remover as células para o tratamento de drogas em uma confluência de 50%-60%.</li>
	<li>Divida as células em subgrupos tratados e não tratados em pratos de cultura de 35 mm.</li>
	<li>Misture a droga de escolha com a mídia cultural. Por exemplo, dissolva o tamoxifeno no dimetil sulfoxida (DMSO) e misture-se com a mídia cultural para obter um volume final de 2 mL e concentração de tamoxifeno de 10 μM. Este será o grupo tratado com drogas.</li>
	<li>Misture um volume correspondente de solvente (DMSO) no meio como um controle para estudar os efeitos do DMSO. Este será o grupo de controle.</li>
	<li>Incubar ambos os grupos em 2 mL da mídia cravada preparado em etapas 2.3-2.4 para 24 h. A confluência esperada após a incubação deve ser de 70% a 80%.</li>
</ol>3. Raman imagem espectral e processamento espectral
NOTA: Embora os sistemas de espectroscopia Raman estejam disponíveis comercialmente, o sistema de espectroscopia Raman usado aqui é um microscópio confocal de varredura de linha construído em casa anteriormente descrito7,8. Resumidamente, este sistema está equipado com um laser de estado sólido bombeado de 532 nm. A luz laser é moldada em um plano usando uma lente cilíndrica, que permite a medição de 400 espectros em uma única exposição. Os espectros de Raman foram gravados usando uma câmera ccd resfriada montada em um policromador que usa uma grade de 1.200 sulcos/mm para maximizar a resolução espectral da região de impressão digital (de 500-1.800 cm-1). Esta área espectral contém uma alta densidade de frequências específicas para moléculas que gera dispersão de Raman. Uma lente de imersão na águaobjetiva (NA = 0,95) também é usada. A resolução espacial deste sistema é de ~300 nm e a resolução espectral é de 1 cma 1. Para garantir a sobrevivência celular durante o experimento, uma microcâmara fixada em um estágio de microscópio motorizado é usada.
<ol><li>Antes das medições espectrais, verifique o alinhamento da ótica. Um pinhole de 50 μm pode ser usado para verificar se o pinhole e a posição do laser combinam exatamente. Digite a fenda espectrômetro quando estreitado, tanto quanto possível.</li>
	<li>Use etanol para calibrar o espectrômetro antes de cada experimento. Para fazer isso, coloque o EtOH em um prato com fundo de vidro, meça o espectro em uma determinada intensidade laser (medida na amostra) por 1 s, e associe o pico a comprimentos de onda conhecidos7.</li>
	<li>Minimize a intensidade do laser na amostra para ~2.4 mW/μm2 para que as células sobrevivam à exposição a laser.</li>
	<li>Configure a microcâmara a 5% de CO2 e 37 °C.</li>
	<li>Uma vez que o sistema do microscópio está pronto, remova pilhas da incubadora e lave imediatamente pilhas 2x com tampão aquecido de PBS (37 °C) a seguir adicione 2 mL de PBS aquecido (37 °C) ou DMEM para resuspender as pilhas. NOTAS: Tanto pbs e fluorobrite dmem baseado mídia são opções suficientes para raman espectroscopia medidas porque eles produzem um sinal de fundo mínimo.</li>
	<li>Adicione 10 μL de água na lente objetiva de imersão na água e coloque delicadamente o prato de célula com fundo de vidro no estágio do microscópio.</li>
	<li>Medir cada célula, concentrando a linha laser. Um tempo de exposição de 15 anos por célula é suficiente aqui para obter uma seção transversal de uma célula com um sinal claro de Raman. Um espelho de galvano permite a digitalização de uma célula ou um grupo de células dentro de várias dezenas de minutos. NOTAS: Maior resolução de imagens espectrais completas de células requer mais tempo e pode levar a danos fotográficos. Aqui, as células foram medidas usando uma exposição de linha única para obter uma seção transversal de cada célula. Esta abordagem é um bom trade-off para aumentar a produção e obter informações suficientes para discriminar as células, garantindo também a viabilidade celular, limitando photodamage.</li>
</ol>4. Pré-processamento de dados espectrais e análises multivariadas
NOTA: O pré-processamento é uma etapa necessária antes da análise adicional, a fim de remover variações técnicas indesejadas dentro dos dados espectrais. Devido à diversidade dos métodos e software, uma lista exaustiva não pode ser fornecida, e há muitas revisões úteis encontradas na literatura7,8. Nesta seção, descrevemos brevemente a abordagem usada para analisar e interpretar dados espectrais de Raman obtidos de células individuais vivas.
<ol><li>Extrato e pré-processe imagens de Raman para remover possíveis interferências de raios cósmicos. NOTA: Eixo espectral de espectros obtidos durante diferentes dias/semanas/meses pode incluir algumas variações devido a pequenas variações técnicas durante a calibração usando etanol. Isso afetará fortemente as análises multivariadas subsequentes e comparações estatísticas. No caso de os experimentos serem realizados durante diferentes semanas/meses, pequenas variações ópticas são esperadas. Neste caso, os dados devem ser interpolados para corrigir eventuais mudanças espectrais dos dados em todos os experimentos. Interpolação usando spline cúbico é usado aqui. Após esta etapa, todo o eixo espectro deve ser alinhado. Uma escala de 500-1.800 cm-1 é considerada para a análise subseqüente.</li>
	<li>Extrair dados espectrais de células e fundo (ausência de células) de cada imagem usando um algoritmo caseiro. Subtraia o sinal de fundo do sinal da célula. Em seguida, calcula a média dos espectros dos pixels restantes, que devem corresponder a uma única célula. As seguintes etapas são executadas usando os espectros 2D das pilhas.</li>
	<li>Realize uma correção de linha de base usando o ModPoly9 ou qualquer outro algoritmo que ele estimou para caber suficientemente. Apare a gama espectral para 600-1.700 cm-1 para selecionar a região de impressão digital e garantir que não haja efeitos de borda indesejados sobre os espectros devido à má montagem polinomial.</li>
	<li>Realize uma etapa de normalização, como normalização vetorial (a intensidade em cada número de onda é dividida pela norma l2 global ou valor singular máximo de um espectro) para normalizar a intensidade espectral10,embora outras normalizações possam ser consideradas.</li>
	<li>Prepare um conjunto de dados com o rótulo apropriado para cada classe/condição. NOTA: Análises espectrais comparativas podem ser analisadas para explorar a natureza de possíveis diferenças entre a classe/condições celulares (por exemplo, subtraindo o espectro médio do grupo controle a outros grupos para identificar regiões de interesse [como potenciais biomarcadores]). Os cálculos de pontuações da ANOVA e da Fisher também podem ser realizados10.</li>
	<li>Para identificar células tratadas e não tratadas com base em características espectrais, análises multivariadas podem ser aplicadas. Os dados espectrais normalizados devem ser utilizados como conjunto de dados de formação, e um conjunto de dados desconhecido (sem rótulo) de um experimento de replicação deve ser usado como dados de teste, se possível. NOTA: A análise discriminante realizada em algum vetor de uma análise de componente principal (PCA-DA10),projeção em escores latentes seguidas de análise discriminante (PLS-DA) e máquinas vetoreiras de suporte (SVM)11 são modelos frequentemente usados no campo, e cada um apresenta diferentes considerações estatísticas. Consequentemente, o pré-processamento de dados deve ser realizado.</li>
	<li>Use o aprendizado de máquina que se adapte aos objetivos experimentais. Aqui, uma projeção sobre o modelo de estrutura latente (PLS) é construída usando a região de impressão digital espectral de Espectros raman (600-1.710 cm-1)11,12. Mean-center os dados, se necessário. Para a validação cruzada do modelo, diferentes técnicas podem ser aplicadas. NOTA: Aqui, uma validação cruzada cega veneziana com 10 divisões é aplicada. A complexidade do modelo (número de componentes ou variável latente) deve ser testada para que o melhor modelo minimize o erro quadrado de raiz média (RMSE) valor. Verificou-se que três vetores latentes (LVs) forneceram a melhor discriminação com o nosso conjunto de dados.</li>
	<li>Identifique quais picos espectrais de Raman contribuem para a discriminação das células (por exemplo, traçando a pontuação de importância variável na projeção [VIP] para cada número de onda raman ou a magnitude do coeficiente de regressão). NOTAS: A pontuação VIP de uma variável é calculada como uma soma ponderada das correlações quadradas entre os componentes PLS-DA e a variável original. Detalhes sobre PLS e algoritmo de pontuações VIP podem ser encontrados na literatura11,12.</li>
</ol>5. Configuração de amostragem de células únicas e procedimentos
<ol><li>Corrigir o sistema de amostragem celular no microscópio Raman, como mostrado na Figura 1. Conecte o micromanipulador 3D ao suporte capilar de vidro que é unido a uma seringa vazia para a amostra que suga aplicando a pressão negativa(figura 1).</li>
	<li>Defina o microscópio em um campo de ampliação alta (40x) para observar a ponta do capilar de vidro e certifique-se de que não está quebrado. Controle a posição do capilar de vidro usando o micromanipulador (x-, y-, z-machados). Certifique-se de que a ponta capilar é centrada no campo de visão, em seguida, mover o capilar no eixo z para dar folga para o prato de cultura mais tarde. NOTA: A microamostragem das células é realizada pelo capilar de vidro para células com diâmetros entre 10-15 μm. Recomenda-se um capilar com um tamanho de furo de ~5 μm. Se o tamanho do furo for muito pequeno, a ponta capilar será conectada pela célula e, se for muito grande, a sensibilidade das medições posteriores da EM pode ser comprometida.</li>
	<li>Coloque a placa de amostra / prato no palco do microscópio, ajustar a ampliação e foco, selecione a célula-alvo no prato grade, e movê-lo para o centro de vista. Em seguida, abaixe cuidadosamente o capilar de vidro usando micromanipulador (z-eixo) até que a ponta entre em foco. NOTA: Certifique-se de não mover o capilar no x- e y-eixos até que o capilar está em foco.</li>
	<li>observação microscópica, toque na célula única alvo com a ponta capilar, em seguida, comece a aplicar pressão negativa usando a seringa para prender a célula dentro da ponta capilar. Registre este procedimento tirando uma foto ou vídeo para verificar o momento e a localização sugada da célula com precisão, se necessário.</li>
	<li>Mova o capilar para cima no eixo z. Em seguida, retire o capilar do suporte capilar usando fórceps em preparação para a análise da EM.</li>
</ol>6. Medições de espectrometria de massa
<ol><li>Calibrar a precisão em massa do instrumento MS de acordo com as recomendações do fabricante. Após a calibração, certifique-se de que o erro de massa não é maior do que 3 ppm.</li>
	<li>Otimizar o instrumento em EM para parâmetros mais adequados para o anlito de interesse. NOTA: No caso da análise de tamoxifeno e 4-OHT, os parâmetros do instrumento são definidos para o seguinte: temperatura capilar de entrada: 400 °C, tensão spray: 1500 V, meta de controle de ganho automático (AGC): 5.00E+06, Nível de RF de lente S: 90%, faixa DE SIM: 347-397 m/z, sim tempo máximo de injeção: 200 ms, Sim resolução: 140.000 FWHM, MS/ MS gama: 50-400 m/z, MS/ MS AGC meta: 2.00E+05, MS / MS tempo máximo de injeção: 100 ms, MS / MS resolução: 17.500 FWHM, MS / MS janela de isolamento: 1 m /z, MS / MS energia de colisão normalizada (NCE): 35.</li>
	<li>Configure um método de aquisição automática com uma duração de 5 min para o modo SIM para alcançar a quantidade relativa, e outro método de EM/EM para identificação positiva da droga e seu metabólito. Os parâmetros do método de aquisição devem ser definidos para os valores otimizados mencionados na etapa 6.2.</li>
	<li>Prepare o solvente de ionização um capô de fumaça. A composição solvente depende do anályte de interesse. Aqui, o solvente orgânico utilizado consiste em 80% MeOH, 10% DMSO e 0,1% de ácido fórmico.</li>
	<li>Misture um padrão interno apropriado com o solvente orgânico antes das medições. Neste experimento, 5,31 nM de d5-tamoxifeno é usado como um padrão interno.</li>
	<li>Para evitar falsos positivos, assapirata os meios de comunicação em torno das células tratadas com a droga usando um capilar de tamanho furo de 1 μm com observação microscópica constante para evitar a amostragem de quaisquer partes celulares.</li>
	<li>Adicione 2 μL do solvente de ionização para a extremidade larga do capilar contendo a mídia usando uma pipeta anexada a pontas carregador. Em seguida, analise os meios de comunicação amostrados por EM, verifique se há presença do anályte de interesse (normalmente, não deve ser detectável).</li>
	<li>Adicione 2 μL o solvente de ionização ao capilar contendo a célula, conserte o capilar a um adaptador de nanoeletrospray (nano-ESI) conectado a um espectrômetro de massa adequado e inicie o método de aquisição automática.</li>
</ol>7. Processamento e análise de dados de espectrometria de massa
NOTA: Qualquer software adequado pode ser usado para realizar análise de dados. No entanto, se os pesquisadores desejam realizar a análise de dados usando um software que não é fornecido pelo fornecedor de EM, então os dados brutos devem ser convertidos do formato de fornecedor proprietário para um formato aberto ou como um arquivo de texto primeiro (que foi feito aqui).
<ol><li>Normalize os dados dividindo a área de pico do analyte de interesse (s) por a do padrão interno a partir da mesma varredura de EM. Em seguida, o log transforma as proporções de pico para reduzir a distorção.</li>
	<li>Trace a intensidade normalizada da droga ou seu metabólito como uma caixa ou curva de densidade para visualizar a distribuição em células únicas. Aqui, o software estatístico R é usado, juntamente com o pacote ggplot2.</li>
	<li>Calcule a droga metabolizada em relação de drogas não metabolizadas dividindo a abundância do metabólito da droga pela molécula de pai não metabolizada em cada célula (ou seja, 4-OHT e tamoxifeno, respectivamente. NOTA: A correlação entre variações de picos específicos de interesse de Raman e as variações nos picos de EM da droga ou seus metabólitos pode ser estudada. Esta é uma adição à possível correlação entre a droga em si e seu metabólito em células únicas. Isso pode ser feito calculando o coeficiente de correlação Pearson usando um teste de duas caudas. Abordagens integrativas mais avançadas também devem ser consideradas.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores declaram nenhum conflito de interesses.

Neste manuscrito, um caso simples foi escolhido em que as células HepG2 foram expostas (ou não) ao tamoxifeno. A capacidade de um sistema de espectroscopia e espectrometria de massa ramano é demonstrada para monitorar os efeitos do tamoxifeno nas células. A espectroscopia de Raman permitiu a identificação de potenciais biomarcadores que refletiam uma resposta geral de células individuais à exposição a medicamentos. Alguma heterogeneidade entre as células únicas foi observada, sugerindo que algumas células não responderam à exposição à droga. Por outro lado, o LSC-MS foi capaz de realizar uma análise direcionada da droga e seu metabólito no nível unicelular, no qual um alto grau de heterogeneidade foi observado na droga e em sua abundância de metabólitos. Esta heterogeneidade ajuda a explicar por que algumas células são afetadas pela droga, enquanto outros aparentemente não são, apesar das células provenientes de uma população supostamente uniforme12.
Entre os aspectos específicos desta técnica que requerem atenção, é importante avaliar a qualidade da configuração do microscópio e processamento de sinal para garantir a reprodutibilidade dos dados. Se o pré-processamento dos espectros for feito com cuidado, as variações de sinal devem ser maximizadas no máximo local de cada pico. Por outro lado, a linha de base e a borda dos espectros devem sobrepor-se entre as condições celulares testadas. Outro aspecto importante é o modelo multivariado utilizado para investigar as diferenças entre os tratamentos. É preciso avaliar cuidadosamente os modelos e parâmetros do modelo para garantir uma análise precisa e precisa. Uma vantagem do modelo PLS, ao contrário das redes neurais, é que ele permite o acesso aos pesos associados a cada comprimento de onda (mudanças de Raman) que melhor distinguem as condições testadas pelo modelo.
Apesar da espectroscopia de Raman discriminar com sucesso a resposta da droga, deve-se salientar que esta técnica é limitada em seu uso para fornecer interpretação biológica. Isto é principalmente devido à complexidade do sinal espectral, que abrange uma mistura de milhares de moléculas. Portanto, é necessária uma investigação mais aprofundada para avaliar as variações sistemáticas entre as intensidades espectrais de Raman e as variações nas concentrações de medicamentos. Além disso, estudos semelhantes de outras linhas celulares são necessários para avaliar a generalização de biomarcadores espectrais associados ao tamoxifeno.
Além disso, pode ser de interesse realizar medições de tecidos vivos para avaliar a farmacodinâmica e estudar como as drogas penetram e fluem dentro de cada célula. Além disso, deve-se notar que o passo de amostragem no LSC-MS é altamente dependente da habilidade do operador. Parâmetros como resolução espacial, posição celular dentro do capilar após a amostragem e força de taxa de produção são totalmente dependentes do operador, o que limita a adoção em larga escala do LSC-MS. Embora, sistemas automatizados de amostragem possam aliviar esse problema. Além disso, enquanto o LSC-MS se destaca na amostragem de células aderentes ou flutuantes em seus estados nativos, ele executa mais mal em células de amostragem incorporadas em seções de tecidos. Isto é devido à tendência da ponta capilar da amostragem quebrar se a densidade da amostra é elevada. Portanto, outra abordagem, como a sonda única, pode ser mais adequada nesses casos14,15.
Como as células aqui utilizadas são amostradas em condições ambientais com preparação mínima de amostras, o LSC-MS pode ser facilmente integrado com outras tecnologias, como mostra sua integração com Raman neste protocolo. Outra integração semelhante com a holografia 3D permitiu alcançar a quantidade absoluta de metabólitos celulares no nível subcelular16. Além disso, a integração com citometria de fluxo permitiu a descoberta de biomarcadores metabólicos em células tumorais circulantes únicas de pacientes com câncer de neuroblastoma17,18.
No futuro, devido ao recente crescente interesse em combinar conjuntos de dados das modalidades de imagem19,também pode ser de interesse estudar as variações sistemáticas entre os sinais de Raman e os resultados da espectrometria de massa (bem como outros métodos omics) usando abordagens computacionais integrativas. Curiosamente, já encontramos várias correlações lineares fracas, mas significativas, entre as intensidades dos picos de Raman identificadas pelas pontuações VIP e a abundância de tamoxifeno ou seu metabólito no nível unicelular, conforme identificado pela MS4. Esses dados podem sugerir uma relação metabólica entre os perfis de EM e os espectros de Raman e a possibilidade de prever esses valores.

As células respondem de forma diferente às mudanças em seu microambiente no nível unicelular, um fenômeno denominado heterogeneidade celular1. Apesar disso, os estudos atuais de descoberta de medicamentos são baseados em medições médias de populações celulares, que ofuscam informações sobre potenciais subpopulações, bem como variações unicelulares2. Esta informação ausente pode explicar por que algumas células são mais suscetíveis a drogas, enquanto outros são resistentes. Curiosamente, a falta de informações unicelulares sobre a resposta a medicamentos é uma possível razão para o fracasso dos ensaios clínicos de fase II dos medicamentos3. Portanto, para resolver esse problema, as interações celulares com a droga (ou seja, captação, metabolismo e resposta) devem ser medidas no nível unicelular.
Para conseguir isso, nós projetamos um sistema único em que as células únicas vivas são rastreadas usando espectroscopia Raman sem rótulo, em seguida, caracterizado ainda mais usando espectrometria de massa4. A espectroscopia de Raman fornece uma impressão digital molecular do estado celular, um espectro complexo resultante das contribuições de muitas moléculas dentro da célula. Apesar dessa complexidade, pode-se considerar que as impressões digitais de Raman refletem a estrutura eometabolismo de uma célula inteira5,6. A espectroscopia raman se destaca na medição de estados celulares de forma não invasiva e relativamente alta, o que o torna útil para triagem e avaliação da resposta a medicamentos no nível unicelular.
Em contraste, a EM fornece a sensibilidade e a seletividade necessárias para medir a captação de medicamentos no nível unicelular. Como a EM é destrutiva (a amostra [célula] é normalmente consumida durante a análise), integrá-la com espectroscopia Raman não destrutiva e sem rótulos pode fornecer uma alta sobre-oferta e um sistema sensível. Esta plataforma combinada é capaz de fornecer mais informações sobre a captação de drogas, metabolismo e efeitos no nível unicelular.
Este manuscrito elucida um protocolo usado para estudar as interações celulares com drogas no nível unicelular usando culturas in vitro usando uma plataforma Raman-MS integrada. Para fazer isso, as células carcinoma hepatocelular (HepG2) e tamoxifeno são usadas como modelo. As células hepG2 foram escolhidas porque ocupam tamoxifeno e metabolizar a droga, e eles são simultaneamente afetados devido aos seus efeitos hepatotóxicos. Dois estados são usados neste manuscrito: células tratadas com drogas versus células não tratadas (controle).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% penicillin-streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass bottom grid dish</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxy Tamoxifen standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm diode pumped solid-state laser</td>
			<td>Ventus, Laser Quantum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOS-L101T-S motorized microscope stage</td>
			<td>OptoSigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-2 cellomics coated sampling capillaries</td>
			<td>HUMANIX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d5-Tamoxifen standard</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide LC-MS grade</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf GELoader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone laboratories</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cell line (RCB1886)</td>
			<td>RIKEN cell bank center</td>
			<td>RCB1886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC0-19A1C Incubator</td>
			<td>Sanyo Electric Co.</td>
			<td>MC0-19A1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1060352500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMO-203 3-D Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MMO-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoflex nano-ESI adaptor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-stage incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce LTQ Velos ESI calibration solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIXIS BR400 cooled CCD camera</td>
			<td>Princeton Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail collagen coating solution</td>
			<td>Cell Applications Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85256</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated raman spectroscopy and mass spectrometry platform to study single-cell drug uptake, metabolism, and effects

As células são conhecidas por serem inerentemente heterogêneas em suas respostas às drogas. Portanto, é essencial que a heterogeneidade unicelular seja contabilizada em estudos de descoberta de medicamentos. Isso pode ser alcançado medindo com precisão a infinidade de interações celulares entre uma célula e uma droga no nível unicelular (ou seja, captação de drogas, metabolismo e efeito). Este artigo descreve uma plataforma de espectroscopia e espectrometria de massa (EM) de ramano para monitorar alterações metabólicas de células em resposta a drogas. Usando esta plataforma, as mudanças metabólicas em resposta à droga podem ser medidas pela espectroscopia de Raman, quando a droga e seu metabolito puderem ser quantificados usando a espectrometria maciça na mesma pilha. Os resultados sugerem que é possível acessar informações sobre captação de drogas, metabolismo e resposta em um nível unicelular.

A análise unicelular das interações medicamentosas (captação, metabolismo e efeitos) é essencial para descobrir qualquer subpopulação oculta ou resistente a medicamentos, bem como compreender os efeitos da heterogeneidade celular. Neste protocolo, duas técnicas complementares foram usadas para medir as interações acima mencionadas em células individuais: espectroscopia Raman e espectrometria ms. Raman identifica rapidamente as células afetadas por drogas com base em biomarcadores espectrais da resposta à droga. A EM é usada para monitorar a captação e o metabolismo da droga de forma seletiva e semi-quantitativa. As células foram primeiro rastreadas pela espectroscopia Raman, em seguida, amostrados individualmente para análise por EM.
Uma análise comparativa do espectro médio de cada condição (com e sem tratamento medicamentoso) é mostrada na Figura 2. O espectro médio das duas condições difere claramente em vários picos, que foram previamente identificados e atribuídos a compostos moleculares2. Em particular, os picos de 1000 cm- (atribuído a compostos aromáticos, como fenilalanina e tirosina) mostram fortes diferenças. A importância da diferença estatística deve ser avaliada por novas análises multivariadas.
O conjunto de dados foi então utilizado para treinar um modelo PLS (passos 4,5-4,8) com o objetivo de distinguir os tratamentos de duas células (com droga: n = 290, sem droga: n = 115). A capacidade preditiva de classificar as células cultivadas na presença de tamoxifeno atingiu 100% de sensibilidade e 72% de especificidade nos dados do teste (desconhecido do modelo treinado cruzado). A sensibilidade é uma medida dos verdadeiros aspectos positivos que são corretamente identificados pelo modelo, enquanto a especificidade é uma medida dos negativos reais que são identificados pelo modelo. Modelos alternativos, como SVMs, LDAs e redes neurais, podem fornecer resultados semelhantes ou melhores, embora uma comparação abrangente não tenha sido realizada neste estudo.
Com base no modelo PLS, foram calculadas as pontuações VIP, o que representa a importância dos comprimentos de onda (mudanças de Raman) na discriminação das condições experimentais(Figura 3). Importante, os picos os mais elevados dos perfis do VIP corresponderam aos picos de Raman para que as diferenças fortes foram consideradas entre os dois tratamentos. Isto confirmou as diferenças moleculares específicas entre pilhas tratadas e não tratadas. Consequentemente, os pesquisadores podem identificar possíveis biomarcadores espectrais que refletem a resposta de células únicas ao tratamento medicamentoso. Esses biomarcadores podem ser testados ainda mais para verificar sua relevância biológica e generalização em várias condições e linhas celulares.
Um sistema vivo de espectrometria de massa unicelular (LSC-MS) foi capaz de detectar tanto a droga quanto seus metabólitos em células HepG2 únicas tratadas com drogas que foram previamente medidas pela espectroscopia Raman. Além disso, a EM tandem pode ser usada para confirmar a estrutura de ambas as moléculas. Após a identificação positiva, a abundância relativa da droga e seus metabólitos foram medidas em cada célula e em comparação com picos de fundo em células não tratadas. Forte variação foi observada na abundância de tamoxifeno, e esse fenômeno foi ainda mais pronunciado no caso de seu metabólito, 4-OHT (Figura 4). A relação entre a abundância de tamoxifeno e seus metabólitos também foi estudada, na qual foi encontrada uma correlação positiva significativa entre os dois (r = 0,54, p = 0,0001, n = 31).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig1.jpg"> Figura 1: Sistema de colheita de células montado em um estágio de microscópio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig2.jpg"> Figura 2: Espectro médio das células tratadas com drogas (com tamoxifeno: n = 295) e células não tratadas (sem tamoxifeno: n = 115). Os picos de Raman podem ser identificados a partir da literatura. A maioria das fortes diferenças espectrais são estatisticamente significativas (ANOVA, p ≤ 0,5), conforme descrito anteriormente4. Este número foi modificado a partir de uma publicação anterior4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig3.jpg"> Figura 3: Pontuações VIP extraídas do modelo PLS preditivo. As pontuações VIP refletem os comprimentos de onda que contribuem para a distinção entre as duas classes do modelo. A maioria dos picos correspondem a moléculas específicas que são observadas como biomarcadores espectrais de efeitos de drogas em células tratadas com drogas. Este número foi modificado a partir de uma publicação anterior4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig4.jpg"> Figura 4: Distribuição de abundância de tamoxifeno e seu metabólito. Distribuição de abundância de tamoxifeno e seu metabólito, 4-OHT (medido no nível unicelular) em comparação com picos endógenos nas células não tratadas (controle). Este número foi modificado a partir de uma publicação anterior4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>

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An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Este protocolo apresenta uma plataforma integrada de espectroscopia-massa raman (EM) que é capaz de alcançar a resolução unicelular. A espectroscopia raman pode ser usada para estudar a resposta celular aos medicamentos, enquanto a EM pode ser usada para análise direcionada e quantitativa da captação e metabolismo de medicamentos.

Uma plataforma integrada de espectroscopia e espectrometria de massa para estudar a absorção, metabolismo e efeitos de drogas unicelulares

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Desenvolvemos um método inovador para metabolômica. Combinamos a imagem espectral de Belfry de células vivas com espectrometria de massa unicelular. Nossa técnica pode monitorar e prever as mudanças metabólicas de células únicas contra drogas.E isso abre muita aplicação para pesquisa básica e indústria. Nosso método adiciona resolução unicelular às técnicas atuais de avaliação de medicamentos que ajudarão muito os esforços futuros de descoberta de drogas. Nossa técnica também pode nos ajudar a entender o papel desempenhado pela heterogeneidade celular na resistência ao câncer.A amostragem unicelular e a análise de dados são os aspectos mais desafiadores deste experimento. No momento, estamos trabalhando na automatização dessas duas etapas, especialmente a parte amostral. Recomendamos que você pratique a amostragem unicelular bem antes do experimento, pois cada configuração de micromanipulador é ligeiramente diferente e você deve ter tempo para se familiarizar com os controles.Depois de incubar células para atingir 70% de confluência, células de cultura de interesse em uma mídia cultural apropriada, adicionam Penicilina-Streptomicina para evitar contaminação. Depois de medir a densidade celular em um hemótmetro, as células de subcultura em uma placa de grade de vidro de 35 milímetros ou slides de quartzo, usando o mesmo meio em uma densidade de semeadura de 0,7 vezes 10 a sexta. Em seguida, incubar a 37 graus celsius por 24 horas.No dia seguinte, as células atingem uma confluência de 50 a 60% Lave as células duas vezes com tampão PBS pré-aquecido a 37 graus celsius. Divida as células em subgrupos tratados com drogas e não tratados em pratos de cultura de 35 milímetros. Misture o Tamoxifen dissolvido em sulfóxido de dimetila com a mídia cultural para obter um volume final de dois mililitros e concentração de Tamoxifen de 10 micromolar.Este é o grupo tratado com drogas. Misture um volume correspondente de DMSO ao meio como um grupo de controle para estudar os efeitos do DMSO. Incubar ambos os grupos em dois mililitros da mídia cravada por 24 horas para atingir uma confluência de 70 a 80%Antes das medições espectrais, verifique o pinhole e a posição do laser correspondendo usando um alvo.Para calibrar o espectrofotômetro antes de cada experimento, coloque o etanol em uma placa de fundo de vidro, meça o espectro em uma dada intensidade de laser por um segundo, e associe o pico a comprimentos de onda conhecidos. Em seguida, configure a micro-câmara a 5% de dióxido de carbono e 37 graus celsius. Uma vez que o sistema de microscópio esteja pronto, remova as células da incubadora e enxágue imediatamente as células duas vezes com tampão PBS aquecido a 37 graus celsius.Em seguida, adicione dois mililitros de PBS aquecido ou FluoroBrite DMEM. Adicione 10 microliters de água na lente objetiva de imersão de água. E coloque delicadamente a placa de vidro inferior da célula no palco do microscópio.Fixar o sistema de amostragem celular no microscópio Raman. Conecte o micromanípulador 3D ao suporte capilar de vidro que está preso a uma seringa vazia para sugação de amostras. Coloque o microscópio em um campo de alta ampliação de 40 vezes para observar a ponta do capilar de vidro e certifique-se de que ele não está quebrado.Controle a posição do capilar de vidro usando o micromanipulador. Certifique-se de que a ponta capilar está centrada no campo de visão. Em seguida, mova o capilar para cima no eixo Z para dar folga para o prato de cultura mais tarde.Coloque o prato de amostra no estágio do microscópio, ajuste a ampliação e o foco, selecione a célula alvo na folha da grade e mova-a para o centro de visão. Meça cada célula focando a linha laser. Um tempo de exposição de 15 segundos por célula é suficiente para obter uma seção transversal de uma célula com um sinal raman claro.Um espelho galvano permite a varredura de uma célula ou de um grupo de células dentro de várias dezenas de minutos. Em seguida, abaixe cuidadosamente o capilar de vidro usando micromanipulador até que a ponta entre em foco. Sob observação microscópica, toque na célula única alvo com a ponta capilar.Em seguida, comece a aplicar pressão negativa usando a seringa para prender a célula dentro da ponta capilar. Registo este procedimento fazendo um vídeo para verificar o tempo e a localização sugada da célula com precisão. Mova o capilar para cima no eixo Z.Em seguida, desvincule o capilar do titular capilar usando fórceps em preparação para análise de espectrometria de massa. Após a configuração do instrumento de espectrometria de massa e análise da mídia, adicione dois microliters do solvente de ionização ao capilar que contém a célula. Fixar o capilar em um adaptador nano-eletrospray conectado a um espectrômetro de massa adequado e iniciar o método de aquisição automática.Uma análise comparativa do espectro médio de cada condição, com e sem tratamento medicamentoso, é mostrada aqui. O espectro médio das duas condições difere claramente em vários picos. Em particular, os picos de 1.000 por centímetro, que é um sinal para compostos aromáticos como fenilalanina e tyrosina, mostram fortes diferenças.Com base na projeção do modelo de estrutura latente, foram calculados os escores VIP que representam a importância dos comprimentos de onda na discriminação das condições experimentais. É importante ressaltar que os picos mais altos dos perfis VIP corresponderam aos picos de Raman para os quais foram observadas fortes diferenças entre os dois tratamentos. Isso confirmou as diferenças moleculares específicas entre células tratadas e não tratadas.Após identificação positiva, a abundância relativa da droga e seus metabólitos foram medidos em cada célula e comparados com picos de fundo em células não tratadas. Observou-se forte variação na abundância de Tamoxifen. E este fenômeno foi ainda mais pronunciado no caso de seu metabólito 4-hidroxi-tamoxifen.Os pesquisadores podem estar interessados em explorar a ligação entre imagens espectrais e os perfis metabólicos das células. Nossa pesquisa também tem aplicações industriais porque permite a triagem local de células para fabricação farmacêutica. Deve-se tomar cuidado durante a preparação do solvente de ionização para as medições do espectrômetro de massa.Deve ser preparado sob um capô de fumaça. Além disso, tenha cuidado para não tocar na fonte de íon do instrumento espectrômetro de massa para evitar ser eletrocutado. Finalmente, os capilares amostrais utilizados ao longo da medição são muito afiados, por isso manuseie-os com cuidado para evitar lesões.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Eletroforese Capilar-Espectrometria de Massa para Metabolic Profiling de amostras biológicas

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Bioquímica

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

A fabricação de um UV-Vis e espectroscopia Raman de plataforma Imuno

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Perfil e identificação de nitropeptídeos ilustrados pela angiotensina II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Uma preparação de amostra de plasma para espectrometria de massa usando uma estação de trabalho automatizada

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Preparação de amostras para espectrometria de ionização de eletrospray de sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...