Name: an integrated raman spectroscopy and mass spectrometry platform to study single-cell drug uptake, metabolism, and effects
Uploaded: 2020-01-09T14:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects at JoVE.com

Авторы благодарят Тосио Янагиду за поддержку и внутренние совместные фонды RIKEN, приписываемые доктору Арно Гермонду.

<ol>
	<li>Altschuler, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity:+do+differences+make+a+difference?.">Cellular heterogeneity: do differences make a difference?.</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+metabolomics+by+mass+spectrometry:+Advances,+challenges,+and+future+applications.">Single-cell metabolomics by mass spectrometry: Advances, challenges, and future applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. , (2019).</li><li>Bunnage, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Screening+of+Tamoxifen+Abundance+and+Effect+Using+Mass+Spectrometry+and+Raman-Spectroscopy.">Single-Cell Screening of Tamoxifen Abundance and Effect Using Mass Spectrometry and Raman-Spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (4), 2710-2718 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+lipidomics+using+single-cell+Raman+spectroscopy.">In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3809-3814 (2011).</li><li>Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+Raman+observation+of+cytochrome+c+dynamics+during+apoptosis.">Label-free Raman observation of cytochrome c dynamics during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 28-32 (2012).</li><li>Palonpon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+SERS+microscopy+for+molecular+imaging+of+live+cells.">Raman and SERS microscopy for molecular imaging of live cells.</a> Nature Protocols. 8 (4), 677-692 (2013).</li><li>Butler, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Raman+spectroscopy+to+characterize+biological+materials.">Using Raman spectroscopy to characterize biological materials.</a> Nature Protocols. 11 (4), 664-687 (2016).</li><li>Mark, H., Workman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemomtrics in Spectroscopy. , (2018).</li><li>Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+subtraction+of+fluorescence+from+biological+Raman+spectra.">Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra.</a> Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).</li><li>Germond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectral+signature+reflects+transcriptomic+features+of+antibiotic+resistance+in+Escherichia+coli.">Raman spectral signature reflects transcriptomic features of antibiotic resistance in Escherichia coli.</a> Communications Biology. 1, 85 (2018).</li><li>Wold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+Least+Squares+Projections+to+Latent+Structures+(PLS)+in+Chemistry.">Partial Least Squares Projections to Latent Structures (PLS) in Chemistry.</a> Encyclopedia of Computational Chemistry. , (2002).</li><li>Chong, I. G., Jun, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+some+variable+selection+methods+when+multicollinearity+is+present.">Performance of some variable selection methods when multicollinearity is present.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 78, (2005).</li><li>Inde, Z., Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+non-genetic+heterogeneity+on+cancer+cell+death.">The impact of non-genetic heterogeneity on cancer cell death.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1), 99-114 (2018).</li><li>Pan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-probe:+a+miniaturized+multifunctional+device+for+single+cell+mass+spectrometry+analysis.">The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis.</a> Analytical chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).</li><li>Rao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+Single-probe:+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Single+Cell+Analysis+under+Ambient+Conditions.">Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e53911 (2016).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Live+Single-cell+Mass+Spectrometry+with+Spatial+Evaluation+by+Three-Dimensional+Holographic+and+Tomographic+Laser+Microscopy.">Quantitative Live Single-cell Mass Spectrometry with Spatial Evaluation by Three-Dimensional Holographic and Tomographic Laser Microscopy.</a> Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (2), 125-127 (2016).</li><li>Abouleila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+single+cell+mass+spectrometry+reveals+cancer-specific+metabolic+profiles+of+circulating+tumor+cells.">Live single cell mass spectrometry reveals cancer-specific metabolic profiles of circulating tumor cells.</a> Cancer Science. 110, 697-706 (2018).</li><li>Hiyama, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Lipido-Metabolomics+of+Single+Floating+Cells+for+Analysis+of+Circulating+Tumor+Cells+by+Live+Single-cell+Mass+Spectrometry.">Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry.</a> Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 31 (12), 1215-1217 (2015).</li><li>Ryabchykov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+MALDI+Spectrometric+Imaging+and+Raman+Spectroscopic+Data+for+the+Analysis+of+Biological+Samples.">Fusion of MALDI Spectrometric Imaging and Raman Spectroscopic Data for the Analysis of Biological Samples.</a> Frontiers in Chemistry. 6, 257 (2018).</li></ol>

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

В этой рукописи был выбран простой случай, в котором клетки HepG2 были выставлены (или нет) для тамоксифена. Показано способность Раманеспектроскопии и системы масс-спектрометрии контролировать воздействие тамоксифена на клетки. Раманская спектроскопия позволила выявить потенциальные биомаркеры, отражающие общую реакцию отдельных клеток на воздействие наркотиков. Наблюдалась определенная неоднородность между одиночными клетками, что свидетельствует о том, что некоторые клетки не реагируют на воздействие наркотиков. С другой стороны, LSC-MS был способен проводить целенаправленный анализ препарата и его метаболита на одноклеточном уровне, при котором в препарате наблюдалась высокая степень неоднородности и его содержание метаболита. Эта неоднородность помогает объяснить, почему некоторые клетки страдают от наркотиков, а другие, казалось бы, нет, несмотря на клетки, происходящие из якобы равномерной населения12.
Среди конкретных аспектов этого метода, которые требуют внимания, важно оценить качество настройки микроскопа и обработки сигналов для обеспечения воспроизводимости данных. Если предварительная обработка спектра выполняется тщательно, вариации сигнала должны быть максимально максимизированы на локальном максимуме каждого пика. В отличие от этого, базовый уклад и край спектра должны перекрываться между условиями исследуемых ячеек. Другим важным аспектом является многоварная модель, используемая для исследования различий между методами лечения. Необходимо тщательно оценить модели и параметры модели, чтобы обеспечить точный и точный анализ. Одним из преимуществ модели PLS, в отличие от нейронных сетей, является то, что она позволяет получить доступ к весам, связанным с каждой длиной волны (СдвигаМи Рамына), которые лучше всего различают условия, проверенные моделью.
Несмотря на то, что раманская спектроскопия успешно дискриминирует реакцию препарата, следует подчеркнуть, что этот метод ограничен в использовании для обеспечения биологической интерпретации. В основном это связано со сложностью спектрального сигнала, который включает в себя смесь тысяч молекул. Поэтому необходимо провести дальнейшее исследование для оценки систематических различий между спектральной интенсивностью Раман и вариациями концентрации наркотиков. Кроме того, аналогичные исследования других клеточных линий необходимы для оценки обобщения спектральных биомаркеров, связанных с тамоксифеном.
Кроме того, может быть интересно проводить измерения живых тканей для оценки фармакодинамики и изучения того, как наркотики проникают и текут в каждой клетке. Кроме того, следует отметить, что этап выборки в LSC-MS в высокой степени зависит от квалификации оператора. Параметры, такие как пространственное разрешение, положение клеток внутри капилляра после отбора проб, и прочность пропускной силы полностью зависят от оператора, что ограничивает широкомасштабное внедрение LSC-MS. Хотя автоматизированные системы отбора проб могут облегчить эту проблему. Кроме того, в то время как LSC-MS выделяется на выборки приверженцев или плавающих клеток в их родных штатах, он выполняет более плохо в клетках выборки встроенных в секции тканей. Это связано с тенденцией отбора капилляров разорвать, если плотность образца высока. Таким образом, другой подход, такой как один зонд может быть более подходящим в таких случаях14,15.
Поскольку используемые здесь ячейки пробы взяты в условиях окружающей среды с минимальной подготовкой образца, LSC-MS может быть легко интегрирован с другими технологиями, о чем свидетельствует его интеграция с Раманом в этом протоколе. Еще одна подобная интеграция с 3D голографией позволила достичь абсолютной количественной оценки клеточных метаболитов на субклеточном уровне16. Кроме того, интеграция с цитометрией потока позволила обнаружить метаболические биомаркеры в отдельных циркулирующих опухолевых клетках больных раком нейробластомы17,18.
В будущем, в связи с недавним растущим интересом к объединению наборов данных из методов визуализации19,может также представлять интерес изучение систематических различий между рамаными сигналами и результатами масс-спектрометрии (а также другими методами омики) с помощью интегративных вычислительных подходов. Интересно, что мы уже нашли несколько слабых, но значительных линейных корреляций между интенсивностью пиков Раман определены VIP баллов и обилие тамоксифена или его метаболита на одноклеточном уровне, как определено MS4. Эти данные могут свидетельствовать о метаболической взаимосвязи между профилями MS и спектрами Раман и возможности предсказать эти значения.

Клетки по-разному реагируют на изменения в их микроокружении на одноклеточном уровне, явлении, называемом клеточной неоднородностью1. Несмотря на это, текущие исследования открытия наркотиков основаны на средних измерениях популяций клеток, которые запутывают информацию о потенциальных субпопуляциях, а также одноклеточных вариациях2. Эта недостающая информация может объяснить, почему некоторые клетки более восприимчивы к наркотикам, в то время как другие устойчивы. Интересно, что отсутствие одноклеточной информации о реакции препарата является возможной причиной провала фазы II клинических испытаний препаратов3. Поэтому для решения этой проблемы, клеточные взаимодействия с препаратом (т.е. поглощение, метаболизм, и ответ) должны быть измерены на одноклеточном уровне.
Для достижения этой цели мы разработали уникальную систему, в которой живые одиночные клетки проверяются с помощью безэтикетки Рамана спектроскопии, а затем далее характеризуется с помощью масс-спектрометрии4. Раманская спектроскопия обеспечивает молекулярный отпечаток клеточного состояния, сложный спектр в результате вклада многих молекул внутри клетки. Несмотря на эту сложность, можно считать, что отпечатки пальцев Раман отражают структуру всей клетки и метаболизм5,6. Раманская спектроскопия выделяется при измерении клеточных состояний в неинвазивной и относительно высокой пропускной форме, что делает ее полезной для скрининга и оценки реакции препарата на одноклеточном уровне.
В отличие от этого, MS обеспечивает необходимую чувствительность и селективность для измерения усвоения наркотиков на одноклеточном уровне. Поскольку MS является разрушительным (образец «клетки», как правило, потребляется во время анализа), интеграция его с неразрушающей, без этикетки Ребан спектроскопии может обеспечить высокую пропускную и чувствительную систему. Эта комбинированная платформа способна предоставить больше информации о усвоении наркотиков, метаболизме и эффектах на одноклеточном уровне.
Данная рукопись разъясняет протокол, используемый для изучения клеточных взаимодействий с наркотиками на одноклеточном уровне с использованием культур in vitro с помощью интегрированной платформы Raman-MS. Для этого в качестве модели используются клетки гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2) и тамоксифен. HepG2 клетки были выбраны потому, что они занимают тамоксифен и усваивают препарат, и они одновременно страдают из-за его гепатотоксического воздействия. В этой рукописи используются два состояния: клетки, обработанные наркотиками, против необработанных клеток (контроль).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% penicillin-streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass bottom grid dish</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxy Tamoxifen standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm diode pumped solid-state laser</td>
			<td>Ventus, Laser Quantum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOS-L101T-S motorized microscope stage</td>
			<td>OptoSigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-2 cellomics coated sampling capillaries</td>
			<td>HUMANIX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d5-Tamoxifen standard</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide LC-MS grade</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf GELoader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone laboratories</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cell line (RCB1886)</td>
			<td>RIKEN cell bank center</td>
			<td>RCB1886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC0-19A1C Incubator</td>
			<td>Sanyo Electric Co.</td>
			<td>MC0-19A1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1060352500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMO-203 3-D Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MMO-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoflex nano-ESI adaptor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-stage incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce LTQ Velos ESI calibration solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIXIS BR400 cooled CCD camera</td>
			<td>Princeton Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail collagen coating solution</td>
			<td>Cell Applications Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85256</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated raman spectroscopy and mass spectrometry platform to study single-cell drug uptake, metabolism, and effects

Клетки, как известно, по своей сути неоднородны в их ответах на наркотики. Поэтому важно, чтобы одноклеточная неоднородность учитывалась в исследованиях по открытию лекарств. Это может быть достигнуто путем точного измерения множества клеточных взаимодействий между клеткой и препаратом на одноклеточном уровне (т.е. потребление наркотиков, метаболизм и эффект). В этой статье описывается одноклеточная Рамана спектроскопия и масс-спектрометрия (MS) платформа для мониторинга метаболических изменений клеток в ответ на наркотики. Используя эту платформу, метаболические изменения в ответ на препарат могут быть измерены Спомощью Рамановской спектроскопии, в то время как препарат и его метаболит можно количественно оценить с помощью масс-спектрометрии в одной клетке. Полученные результаты свидетельствуют о том, что можно получить доступ к информации об усвоении наркотиков, обмене веществ и реакции на одноклеточном уровне.

Одноклеточный анализ лекарственных взаимодействий (поглощение, обмен веществ и эффекты) имеет важное значение для выявления каких-либо скрытых или лекарственно-устойчивых субпопуляции, а также понимание последствий клеточной неоднородности. В этом протоколе были использованы два дополнительных метода для измерения вышеупомянутых взаимодействий в одиночных клетках: спектроскопия Раман и спектрометрия MS. З.Раман быстро определяет клетки, пораженные препаратами на основе спектральных биомаркеров ответных препаратов. MS используется для мониторинга поглощения и метаболизма препарата в селективной и полуколичественной основе. Клетки были сначала проверены Рамане спектроскопии затем индивидуально отобраны для анализа MS.
Сравнительный анализ среднего спектра каждого состояния (с и без лечения) показан на рисунке 2. Усредненные спектры этих двух условий четко различаются на различных пиках, которые ранее были определены и назначены молекулярным соединениям2. В частности, пики на 1000 см- (присужденные к ароматическим соединениям, таким как фенилаланин и тирозин) показывают сильные различия. Значимость статистической разницы следует оценивать с помощью дальнейших многовариантных анализов.
Набор данных затем использовался для обучения модели PLS (шаги 4.5-4.8), направленной на различение двух клеточных процедур (с препаратом: n No 290, без препарата: n No 115). Прогностические способности классифицировать клетки, культивированные в присутствии тамоксифена, достигли 100% чувствительности и 72% специфичности в тестовых данных (неизвестных по перекрестной проверенной обученной модели). Чувствительность является мерой истинных положительных моментов, которые правильно определены моделью, в то время как специфичность является мерой фактических негативов, которые определены моделью. Альтернативные модели, такие как SVMs, LDAs и нейронные сети могут обеспечить аналогичные или лучшие результаты, хотя всестороннее сравнение не было выполнено в данном исследовании.
На основе модели PLS были рассчитаны VIP-оценки, которые отражают важность длин волн (Роман сдвиги) в распознавании экспериментальных условий(рисунок 3). Важно отметить, что самые высокие пики VIP-профилей соответствовали пикам Рамана, для которых были замечены сильные различия между двумя процедурами. Это подтвердило специфические молекулярные различия между обработанными и необработанными клетками. Следовательно, исследователи могут определить возможные спектральные биомаркеры, которые отражают реакцию отдельных клеток на медикаментозное лечение. Эти биомаркеры могут быть проверены для дальнейшего тестирования их биологической значимости и обобщения в различных условиях и клеточных линиях.
Система живой одноклеточной масс-спектрометрии (LSC-MS) смогла обнаружить как препарат, так и его метаболиты в отдельных, обработанных наркотиками клетках HepG2, которые ранее измерялись раманой спектроскопией. Кроме того, тандем MS может быть использован для подтверждения структуры обеих молекул. После положительной идентификации, относительное изобилие препарата и его метаболитов были измерены в каждой клетке и сравнены с фоновыми пиками в необработанных клетках. Сильные изменения наблюдались в изобилии тамоксифена, и это явление было еще более выраженным в случае его метаболита, 4-OHT (Рисунок 4). Была также изучена взаимосвязь между изобилием тамоксифена и его метаболитами, в которой была обнаружена значительная положительная корреляция между ними (р- 0,54, стр. 0,0001, n no 31).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig1.jpg"> Рисунок 1: Система сбора ячеек, установленная на стадии микроскопа. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig2.jpg"> Рисунок 2: Средний спектр наркологических клеток (с тамоксифеном: n No 295) и необработанных клеток (без тамоксифена: n no 115). Вершины Рамына можно определить по литературе. Большинство сильных спектральных различий являются статистически значимыми (ANOVA, р 0,5), как описано ранее4. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig3.jpg"> Рисунок 3: VIP-оценки, извлеченные из прогностической модели PLS. VIP-оценки отражают длины волн, которые способствуют различению двух классов в модели. Большинство пиков соответствуют определенным молекулам, которые наблюдаются как спектральные биомаркеры лекарственного воздействия на клетки, обработанные наркотиками. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig4.jpg"> Рисунок 4: Распределение изобилия тамоксифена и его метаболита. Распределение изобилия тамоксифена и его метаболита, 4-OHT (измеряется на одноклеточном уровне) по сравнению с эндогенными пиками в необработанных клетках (контроль). Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects at JoVE.com

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Этот протокол представляет собой интегрированную Рамано-масс-масс-спектрометрию (MS), способную достичь одноклеточного разрешения. Раман спектроскопия может быть использована для изучения клеточной реакции на наркотики, в то время как MS может быть использован для целевого и количественного анализа потребления наркотиков и метаболизма.

Интегрированная Рамана спектроскопия и массовая спектрометрия Платформа для изучения одноклеточного потребления наркотиков, метаболизма и эффектов

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Мы разработали инновационный метод метаболомики. Мы объединили спектральную визуализацию живых клеток Belfry с одноклеточной масс-спектрометрией. Наша техника может контролировать и прогнозировать метаболические изменения одиночных клеток против наркотиков.И это открывает много приложений для фундаментальных исследований и промышленности. Наш метод добавляет одноклеточное разрешение к современным методам оценки наркотиков, которые будут в значительной степени помочь будущим усилиям по обнаружению наркотиков. Наша техника также может помочь нам понять роль, которую играет клеточная неоднородность в устойчивости к раку.Одноклеточная выборка и анализ данных являются наиболее сложными аспектами в этом эксперименте. В настоящее время мы работаем над автоматизацией этих двух этапов, особенно части выборки. Мы рекомендуем вам практиковать одноклеточный выборки задолго до эксперимента, так как каждая установка микроманипулятора немного отличается, и вы должны взять время, чтобы ознакомиться с управлением.После инкубации клеток для достижения 70%-ного слияния, культурные клетки, представляющие интерес в соответствующих культурных средств массовой информации, добавить пенициллин-стрептомицин, чтобы избежать загрязнения. После измерения плотности клеток на гемоцитометре, субкультурные клетки в 35-миллиметровую стеклянную нижнюю сетку или кварцевые горки, используя ту же среду при плотности посева в 0,7 раза от 10 до шестого. Затем инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов.На следующий день, клетки достигают слияния от 50 до 60%Вымойте клетки два раза с предварительно разогретый буфер PBS при 37 градусов по Цельсию. Разделите клетки на обработанные наркотиками и необработанные подгруппы в 35-миллиметровых культурных блюдах. Смешайте тамоксифен, растворенный в диметилфоксиде, с культурными средствами массовой информации, чтобы получить окончательный объем в два миллилитра и концентрацию тамоксифена в 10 микромолях.Это группа, которая лечится от наркотиков. Смешайте соответствующий объем DMSO в среду в качестве контрольной группы для изучения последствий DMSO. Инкубировать обе группы в два миллилитров шипами средств массовой информации в течение 24 часов, чтобы достичь слияния от 70 до 80% До спектральных измерений, проверить пинхол и лазерное положение матч с помощью цели.Чтобы откалибровать спектрофотометр перед каждым экспериментом, поместите этанол в стеклянную нижнюю тарелку, измерьте спектр при данной интенсивности лазера в течение одной секунды и свяжут пик с известными длинами волн. Затем установив микрокамеру на 5%углекислого газа и 37 градусов по Цельсию. Как только микроскоп система будет готова, удалить клетки из инкубатора и сразу же промыть клетки дважды с разогретой буфер PBS при 37 градусов по Цельсию.Затем добавьте два миллилитров разогретого PBS или FluoroBrite DMEM. Добавьте 10 микролитров воды в объектив для погружения в воду. И деликатно поместите стеклянную нижнюю клеточное блюдо на сцену микроскопа.Зафиксив систему отбора проб клеток на раман-микроскопе. Подключите 3D микроманипулятор к держателю стеклянных капилляров, который крепится к пустому шприцу для сосания образца. Установите микроскоп на высокое увеличение поля 40 раз, чтобы наблюдать кончик стеклянной капиллярной, и убедитесь, что он не сломан.Управление положением стеклянной капиллярной с помощью микроманипулятора. Убедитесь, что кончик капилляров центрируется в поле зрения. Затем перемести капилляр на ось, чтобы дать разрешение на культурное блюдо позже.Поместите образец блюда на сцене микроскопа, отрегулируйте увеличение и фокус, выберите целевую ячейку на сетке блюдо, и переместить его в центр зрения. Измерьте каждую ячейку, сосредоточив лазерную линию. 15-секундного времени экспозиции на клетку достаточно для получения поперечного сечения клетки с четким сигналом Рамана.Гальвано-зеркало позволяет сканировать одну клетку или группу клеток в течение нескольких десятков минут. Затем осторожно опустите стеклянный капилляр с помощью микроманипулятора, пока кончик не придет в фокус. Под микроскопическим наблюдением коснитесь одной клетки цели кончиком капилляра.Затем начните применять отрицательное давление, используя шприц, чтобы поймать клетку внутри кончика капилляров. Запись этой процедуры, взяв видео, чтобы проверить сроки и всасывается расположение ячейки точно. Перемести капилляр вверх по оси З.Затем отсоедините капилляр от капиллярного держателя, используя типсы в рамках подготовки к масс-спектрометрии анализа. После настройки инструмента масс-спектрометрии и анализа средств массовой информации добавьте два микролитров растворителя ионизации в капилляр, содержащий клетку. Зафиксите капилляр к наноэлектроспрей-адаптеру, подключенному к подходящему масс-спектрометру, и запустите метод автоматического приобретения.Сравнительный анализ среднего спектра каждого состояния, с и без лечения наркотиками, показано здесь. Средний спектр этих двух условий явно отличается на различных пиках. В частности, пики на 1000 процентов, что является признаком ароматических соединений, таких как фенилаланин и тирозин, показывают сильные различия.На основе проекции на скрытую модель структуры были рассчитаны VIP-оценки, которые представляют важность длин волн в дискриминации экспериментальных условий. Важно отметить, что самые высокие пики VIP-профилей соответствовали раманские пики, для которых были замечены сильные различия между двумя лечениями. Это подтвердило специфические молекулярные различия между обработанными и необработанными клетками.После положительной идентификации, относительное изобилие препарата и его метаболитов были измерены в каждой клетке и по сравнению с фоновыми пиками в необработанных клетках. Сильные изменения наблюдались в изобилии тамоксифена. И это явление было еще более выраженным в случае его метаболита 4-гидрокси-тамоксифен.Исследователи могут быть заинтересованы в изучении связи между спектральными изображениями и метаболическими профилями клеток. Наше исследование также имеет промышленное применение, поскольку оно позволяет проводить локальный скрининг клеток для фармацевтического производства. Необходимо позаботиться при подготовке растворителя ионизации для измерения масс-спектрометра.Его следует подготовить под дымовой капотом. Кроме того, будьте осторожны, чтобы не коснуться источника иона масс-спектрометра инструмент, чтобы избежать удара током. Наконец, капилляры выборки, используемые на протяжении всего измерения, очень острые, так что обрабатывать их с осторожностью, чтобы избежать травм.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Без футляра Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрии для Метаболический Профилирование биологических образцов

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Фабрикации UV-VIS и спектроскопии комбинационного рассеяния света иммуноанализа платформы

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Липидное Выделение капельного для количественной анализа масс-спектрометрии

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Обнаружение мест убиквитирования белка путем обогащения пептида и масс-спектрометрии

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Подготовка образца плазмы для масс-спектрометрии с использованием автоматизированной рабочей станции

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Абсолютная количественная количественная количественная количественная метания белка без клеток путем обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...