Name: an integrated raman spectroscopy and mass spectrometry platform to study single-cell drug uptake, metabolism, and effects
Uploaded: 2020-01-09T14:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects at JoVE.com

Yazarlar toshio Yanagida'ya desteği ve Dr. Arno Germond'a atfedilen RIKEN iç işbirlikçi fonları için teşekkür eder.

1. Hücre kültürü
<ol><li>Uygun bir kültür medyailgi Kültür hücreleri. Kontaminasyonu önlemek için penisilin-streptomisin eklenebilir. HepG2 hücrelerinde, Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) içeren bir kültür medya kültür hücreleri% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmektedir (FBS) ve 0.1% penisilin-streptomisin. Raman spektroskopisi ölçümlerini kolaylaştırmak için hücreler %0,1 jelatin kaplı cam alt çanak veya kuvars slaytlarda yetiştirilebilir.</li>
	<li>37 °C'de 2 gün, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 CO2'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hücre kültürlerini senkronize edin ve %70'lik bir araya ulaşın.</li>
	<li>35 mm'lik cam dipızgara çanağına veya aynı ortayı kullanarak 0,7 x 106'lıkbir tohumlama yoğunluğuna giren kuvars slaytlarına alt kültür hücreleri, daha sonra 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın. NOT: Kültür yemekleri veya slaytlar, ölçüm sırasında hayatta kalmalarını sağlayarak, 5 ug/cm2 kültür yüzeyi oranı ile kollajen veya jelatin kaplama çözeltisi ile önceden kaplanabilir.</li>
</ol>2. İlaç tedavisi
<ol><li>Hücre kültürlerini kuvözden çıkarın ve önceden ısıtılmış PBS tamponu (37 °C) ile 2 kat yıkayın. NOT: İlaç tedavisi için hücreleri %50-60 arasında bir kesişme ile çıkarmak en uygun uyrmaktadır.</li>
	<li>Hücreleri 35 mm kültür yemeklerinde ilaçla tedavi edilen ve tedavi edilmeyen alt gruplara ayırın.</li>
	<li>Seçtiğiniz ilacı kültür medyasıyla karıştırın. Örneğin, dimethyl sulfoxide (DMSO) tamoksifen çözünve kültür medya ile karıştırın 2 mL ve 10 μM tamoksifen konsantrasyonu son bir hacim elde etmek için. Bu uyuşturucu tedavisi gören grup olacak.</li>
	<li>DMSO'nun etkilerini incelemek için ilgili hacimde (DMSO) bir kontrol olarak ortama karıştırın. Bu kontrol grubu olacak.</li>
	<li>2.3-2.4 adımlarında hazırlanan sivri uçlu ortamın 2 mL'sinde her iki grubu da 24 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonrası beklenen kesişme %70-80 olmalıdır.</li>
</ol>3. Raman spektral görüntüleme ve spektral işleme
NOT: Raman spektroskopi sistemleri ticari olarak mevcut olmasına rağmen, burada kullanılan Raman spektroskopi sistemi daha önce7,8açıklanan bir ev yapımı hat tarama confokal mikroskop olduğunu. Kısaca, bu sistem 532 nm diyot pompalı katı hal lazer ile donatılmıştır. Lazer ışığı, tek bir pozlamada 400 spektrumölçümü sağlayan silindirik bir lens kullanılarak düzleme dönüşür. Raman spektrumları, parmak izi bölgesinin spektral çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak için 1.200 oluk/mm ızgara kullanan bir polikromatörün üzerine monte edilmiş soğutulmuş ccd kamera kullanılarak kaydedildi (500-1.800 cm-1). Bu spektral alan Raman saçılımı üreten moleküllere özgü frekansların yüksek yoğunluklu içerir. Su daldırma objektifi (NA = 0.95) de kullanılır. Bu sistemin mekansal çözünürlüğü ~300 nm ve spektral çözünürlük 1 cm-1'dir. Deney sırasında hücre hayatta kalmasını sağlamak için motorlu mikroskop aşamasına sabitlenmiş bir mikrohazettir.
<ol><li>Spektral ölçümlerden önce, optiklerin hizalanmasını doğrulayın. İğne deliği ve lazer pozisyonunun tam olarak eşleşip eşleşmediğini doğrulamak için 50 μm'lik bir iğne deliği kullanılabilir. Mümkün olduğunca daraltıldığında spektrofotometre yarık girin.</li>
	<li>Her deneyden önce spektrofotometreyi kalibre etmek için etanol kullanın. Bunu yapmak için, bir cam alt çanak EtOH yerleştirin, belirli bir lazer yoğunluğunda spektrum ölçmek (örnek olarak ölçülen) için 1 s, ve bilinen dalga boyları için tepe ilişkilendirmek7.</li>
	<li>Örneklerdeki lazer yoğunluğunu ~2,4 mW/μm2'ye indirin, böylece hücreler lazer maruziyetinden sağ çıkabilsin.</li>
	<li>Mikro hazneyi %5 CO2 ve 37 °C'de ayarlayın.</li>
	<li>Mikroskop sistemi hazır olduğunda, hücreleri kuvözden çıkarın ve hücreleri ısıtılmış PBS (37 °C) tamponla 2 kat durulayın, ardından hücreleri askıya almak için 2 mL ısıtılmış PBS (37 °C) veya DMEM ekleyin. NOTLAR: Hem PBS hem de FloroBritd DMEM tabanlı ortam raman spektroskopi ölçümleri için yeterli seçeneklerdir çünkü en az arka plan sinyali üretirler.</li>
	<li>Su daldırma objektif in üzerine 10 μL su ekleyin ve cam alt hücre çanamasını mikroskop aşamasına hassas bir şekilde yerleştirin.</li>
	<li>Lazer çizgisini odaklayarak her hücreyi ölçün. Hücre başına 15 s maruz kalma süresi burada net raman sinyali olan bir hücrenin kesitini elde etmek için yeterlidir. Bir galvano ayna birkaç düzine dakika içinde bir hücre veya hücre grubu tarama sağlar. NOTLAR: Hücrelerin tam spektral görüntüleme yüksek çözünürlük daha fazla zaman gerektirir ve fotohasara yol açabilir. Burada, hücreler her hücrenin bir kesitelde etmek için tek satırlık pozlama kullanılarak ölçüldü. Bu yaklaşım, iş bünyesini artırmak ve hücreleri ayırt etmek için yeterli bilgi elde etmek için iyi bir denge dir. Ayrıca fotohasarı sınırlayarak hücre canlılığını da sağlar.</li>
</ol>4. Spektral verilerin ön işlenmesi ve çok değişkenli analizler
NOT: Ön işleme, spektral verilerdeki istenmeyen teknik varyasyonları kaldırmak için ek analizden önce gerekli bir adımdır. Yöntem ve yazılım çeşitliliği nedeniyle, ayrıntılı bir liste sağlanamaz ve literatürde bulunan birçok yararlı değerlendirmeleri vardır7,8. Bu bölümde, yaşayan tek hücrelerden elde edilen spektral Raman verilerini analiz etmek ve yorumlamak için kullanılan yaklaşımı kısaca açıklıyoruz.
<ol><li>Olası kozmik ışın parazitini ortadan kaldırmak için Raman görüntülerini ayıklayın ve önceden işlemeyapın. NOT: Farklı gün/hafta/aylarda elde edilen spektrumların spektral ekseni, etanol kullanılarak kalibrasyon sırasında ki küçük teknik varyasyonlar nedeniyle bazı varyasyonlar içerebilir. Bu, sonraki çok değişkenli analizleri ve istatistiksel karşılaştırmaları güçlü bir şekilde etkileyecektir. Deneylerin farklı haftalar/aylarda yapılması durumunda, küçük optik varyasyonlar beklenmektedir. Bu durumda, verilerin deneyler arasında nihai spektral kaymaları için düzeltmek için veriler enterpolasyonlu olmalıdır. Burada kübik spline kullanarak enterpolasyon kullanılır. Bu adımdan sonra, tüm spektrum ekseni hizalanmalıdır. Sonraki analizler için 500-1.800 cm-1 aralığı dikkate alınr.</li>
	<li>Ev yapımı bir algoritma kullanarak her görüntüden hücrelerin ve arka planın (hücrelerin yokluğu) spektral verilerini ayıklayın. Hücrenin sinyalinden arka plan sinyalini çıkarın. Daha sonra, tek bir hücreye karşılık gelecek kalan piksellerin spektrumlarının ortalamasını alamalısınız. Aşağıdaki adımlar hücrelerin 2B spektrumları kullanılarak gerçekleştirilir.</li>
	<li>ModPoly9'u veya yeterince sığacağını tahmin ettiği başka bir algoritmayı kullanarak temel düzeltme gerçekleştirin. Parmak izi bölgesini seçmek ve kötü polinom takılması nedeniyle spektrumüzerinde istenmeyen kenar efektleri olmadığından emin olmak için spektral aralığı 600-1.700 cm-1'e belirleyin.</li>
	<li>Diğer normalleştirmeler düşünülebilir rağmen, spektral yoğunluğu10normalleştirmek için vektör normalleştirme (her dalga numarasındaki yoğunluk küresel l2 norm veya bir spektrumun maksimum tekil değeri ile bölünür) gibi bir normalleştirme adımı gerçekleştirin.</li>
	<li>Her sınıf/koşul için uygun etikete sahip bir veri kümesi hazırlayın. NOT: Karşılaştırmalı spektral analizler hücre sınıfı/koşulları arasındaki olası farklılıkların doğasını araştırmak için perfored edilebilir (örneğin, kontrol grubunun ortalama spektrumunu diğer gruplara çıkararak ilgi bölgelerini (potansiyel biyobelirteçler gibi) belirleyebilir). ANOVA ve Fisher puanları hesaplamaları da10yapılabilir.</li>
	<li>Spektral özelliklere göre tedavi edilen ve işlenmemiş hücreleri belirlemek için çok değişkenli analizler uygulanabilir. Normalleştirilmiş spektral veriler bir eğitim veri kümesi olarak kullanılmalı ve mümkünse çoğaltma deneyinden bilinmeyen bir veri kümesi (etiketsiz) test verisi olarak kullanılmalıdır. NOT: Bir temel bileşen analizinin bazı vektörü (PCA-DA10),gizli skorlar üzerinde projeksiyon ve ardından ayrımcı analiz (PLS-DA) ve destek vektör makineleri (SVM)11'in bazı vektörleri üzerinde yapılan ayrımcı analiz, genellikle alanında kullanılan modellerdir ve her biri farklı istatistiksel hususlar sunar. Sonuç olarak verilerin ön işlenmesi yapılmalıdır.</li>
	<li>Deneysel hedeflere uygun makine öğrenimi kullanın. Burada, gizli yapı (PLS) modeli üzerinde bir projeksiyon Raman spektrum (600-1.710 cm-1)11,12spektral parmak izi bölgesi kullanılarak inşa edilmiştir. Verileri gerektiği gibi ortala. Modelin çapraz geçerliliği için farklı teknikler uygulanabilir. NOT: Burada 10 bölmeli venedik kör çapraz doğrulama uygulanmaktadır. Model karmaşıklığı (bileşen sayısı veya gizli değişken) en iyi modelkök ortalama hata (RMSE) değerini en aza indirir, böylece sınanmalıdır. Bu üç gizli vektörler (LVs) bizim veri seti ile en iyi ayrımcılık sağlanan bulundu.</li>
	<li>Raman spektral zirvelerinin hücrelerin ayrımcılığa katkısı olduğunu belirleyin (örneğin, her Raman dalga sayısı veya regresyon katsayısının büyüklüğü için projeksiyonda [VIP] değişken öneme sahip puanı çizerek). NOTLAR: Bir değişkenin VIP skoru, PLS-DA bileşenleri ile özgün değişken arasındaki kareli korelasyonların ağırlıklı toplamı olarak hesaplanır. PLS ve VIP puanları algoritması ile ilgili ayrıntılar literatürde bulunabilir11,12.</li>
</ol>5. Tek hücreli örnekleme kurulumu ve prosedürleri
<ol><li>Hücre örnekleme sistemini Şekil 1'degösterildiği gibi Raman mikroskobuna sabitle. Negatif basınç uygulayarak numune emme için boş bir şırınga bağlı cam kılcal tutucu 3D micromanipulator bağlayın (Şekil 1).</li>
	<li>Mikroskobu, cam kılcal damarın ucunu gözlemlemek ve kırılmadığından emin olmak için yüksek bir büyütme alanına (40x) ayarlayın. Mikromanipülatör (x-, y-, z-eksenleri) kullanarak cam kılcal damarın konumunu kontrol edin. Kılcal uç görüş alanında ortalanmış olduğundan emin olun, sonra daha sonra kültür çanak için açıklık vermek için z ekseni üzerinde kılcal yukarı taşıyın. NOT: Hücrelerin mikro örneklemesi, çapları 10-15 m arasında olan hücreler için cam kılcal damar ile yapılır. ~5 μm delik boyutunda bir kılcal damar önerilir. Delik boyutu çok küçükse, kılcal uç hücre tarafından takılır ve çok büyükse, daha sonraki MS ölçümlerinin hassasiyeti tehlikeye girer.</li>
	<li>Örnek plakayı/kabı nı mikroskop un sahnesine yerleştirin, büyütme ve odaklamayı ayarlayın, ızgara çanağı üzerindeki hedef hücreyi seçin ve görüş merkezine taşıyın. Daha sonra, ucu odak haline gelene kadar mikromanipülatör (z-ekseni) kullanarak cam kılcal aşağı dikkatle aşağı indirin. NOT: Kılcal damar odak noktası olana kadar x ve y eksenlerinde kılcal damarı hareket ettirmemeye dikkat edin.</li>
	<li>Mikroskobik gözlem altında, kılcal ucu ile hedef tek hücredokunun, sonra kılcal ucu içinde hücre tuzak şırınga kullanarak negatif basınç uygulamaya başlar. Gerekirse hücrenin zamanlamasını ve emilmiş konumunu tam olarak kontrol etmek için bir fotoğraf veya video çekerek bu yordamı kaydedin.</li>
	<li>Kılcal damarı z ekseninde yukarı doğru hareket ettirin. Daha sonra, MS analizine hazırlık olarak forseps kullanarak kılcal damar tutucudan kılcal damarı ayırın.</li>
</ol>6. Kütle spektrometresi ölçümleri
<ol><li>MS cihazının kütle doğruluğunu üreticinin tavsiyelerine göre kalibre edin. Kalibrasyondan sonra, kütle hatasının dakikada 3 ppm'den büyük olmadığından emin olun.</li>
	<li>MS cihazını ilgi analizi için en uygun parametrelere optimize edin. NOT: Tamoksifen ve 4-OHT analizi nde alet parametreleri aşağıdaki lere ayarlanır: giriş kılcal damar sıcaklığı: 400 °C, püskürtme gerilimi: 1500 V, otomatik kazanç kontrol hedefi (AGC): 5.00E+06, S-lens RF seviyesi: %90, SIM aralığı: 347-397 m/z, SIM maksimum enjeksiyon süresi: 200 ms, SIM çözünürlük: 140.000 FWHM, MS/MS aralığı: 50-400 m/z, MS/MS AGC hedefi: 2.00E+05, MS/MS maksimum enjeksiyon süresi: 100 ms, MS/MS çözünürlüğü: 17.500 FWHM, MS/MS izolasyon penceresi: 1 m/z, MS/MS normalleştirilmiş çarpışma enerjisi (NCE5).</li>
	<li>Göreceli nicelik elde etmek için SIM modu için 5 dk süreli otomatik bir kazanım yöntemi ve ilacın ve metabolitinin pozitif tanımlanması için başka bir MS/MS yöntemi ayarlayın. Edinme yönteminin parametreleri adım 6.2'de belirtilen en iyi duruma getirilmiş değerlere ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Bir duman başlık altında iyonizasyon çözücü hazırlayın. Çözücü bileşimi ilgi analizine bağlıdır. Burada kullanılan organik çözücü %80 MeOH, %10 DMSO ve %0.1 formik asitten oluşmaktadır.</li>
	<li>Ölçümlerden önce uygun bir iç standardı organik çözücüile karıştırın. Bu deneyde, 5.31 nM d5-tamoksifen iç standart olarak kullanılır.</li>
	<li>Yanlış pozitifleri önlemek için, herhangi bir hücresel parça örnekleme önlemek için sürekli mikroskobik gözlem ile 1 μm delik boyutunda kılcal kullanarak ilaç ile tedavi hücreleri çevreleyen medya aspire.</li>
	<li>Yükleyici uçlarına bağlı bir pipet kullanarak ortam içeren kılcal damarın geniş ucuna 2 μL iyonizasyon çözücüekleyin. Daha sonra, MS tarafından örneklenmiş ortam analiz, ilgi analyt varlığını kontrol edin (normalde, tespit edilmemelidir).</li>
	<li>Hücreyi içeren kılcal damara 2 μL iyonizasyon çözücüsi ekleyin, kapilleri uygun bir kütle spektrometresine bağlı bir nanoelektrosprey adaptörüne (nano-ESI) sabitlayın ve otomatik satın alma yöntemini başlatın.</li>
</ol>7. Kütle spektrometresi veri işleme ve analizi
NOT: Veri analizi yapmak için uygun herhangi bir yazılım kullanılabilir. Ancak, araştırmacılar MS satıcısı tarafından sağlanmayan bir yazılım kullanarak veri analizi yapmak istiyorlarsa, ham veriler özel satıcı biçiminden açık bir biçime veya önce bir metin dosyası olarak dönüştürülmelidir (burada yapıldı).
<ol><li>İlgi analyt(ler)'in en yüksek alanını aynı MS tetkisinden iç standardına bölerek verileri normalleştirin. Ardından, çarpıklığı azaltmak için tepe oranlarını dönüştüren günlük defteri.</li>
	<li>Tek hücreler arasındaki dağılımı görselleştirmek için ilacın veya metabolitinin normalleştirilmiş yoğunluğunu bir kutu çizimi veya yoğunluk eğrisi olarak çizin. Burada, R istatistik yazılımı ggplot2 paketi ile birlikte kullanılır.</li>
	<li>Metabolize edilen ilacı, her hücredeki metabolize edilmemiş ana molekülün (yani 4-OHT ve tamoksifen) ile bölünerek, ilaç metaboliti nin bolluğunu metabolize edilmemiş ilaç oranına göre hesaplayın. NOT: Belirli Raman ilgi zirvelerinin varyasyonları ile ilacın MS zirveleri veya metabolitleri arasındaki ilişki incelenebilir. Bu tek hücrelerde ilacın kendisi ve metaboliti arasındaki olası korelasyon bir ektir. Bu iki kuyruklu test kullanılarak Pearson korelasyon katsayısı hesaplanarak yapılabilir. Daha gelişmiş bütünleştirici yaklaşımlar da göz önünde bulundurulmalıdır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Altschuler, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity:+do+differences+make+a+difference?.">Cellular heterogeneity: do differences make a difference?.</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+metabolomics+by+mass+spectrometry:+Advances,+challenges,+and+future+applications.">Single-cell metabolomics by mass spectrometry: Advances, challenges, and future applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. , (2019).</li><li>Bunnage, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Screening+of+Tamoxifen+Abundance+and+Effect+Using+Mass+Spectrometry+and+Raman-Spectroscopy.">Single-Cell Screening of Tamoxifen Abundance and Effect Using Mass Spectrometry and Raman-Spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (4), 2710-2718 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+lipidomics+using+single-cell+Raman+spectroscopy.">In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3809-3814 (2011).</li><li>Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+Raman+observation+of+cytochrome+c+dynamics+during+apoptosis.">Label-free Raman observation of cytochrome c dynamics during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 28-32 (2012).</li><li>Palonpon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+SERS+microscopy+for+molecular+imaging+of+live+cells.">Raman and SERS microscopy for molecular imaging of live cells.</a> Nature Protocols. 8 (4), 677-692 (2013).</li><li>Butler, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Raman+spectroscopy+to+characterize+biological+materials.">Using Raman spectroscopy to characterize biological materials.</a> Nature Protocols. 11 (4), 664-687 (2016).</li><li>Mark, H., Workman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemomtrics in Spectroscopy. , (2018).</li><li>Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+subtraction+of+fluorescence+from+biological+Raman+spectra.">Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra.</a> Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).</li><li>Germond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectral+signature+reflects+transcriptomic+features+of+antibiotic+resistance+in+Escherichia+coli.">Raman spectral signature reflects transcriptomic features of antibiotic resistance in Escherichia coli.</a> Communications Biology. 1, 85 (2018).</li><li>Wold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+Least+Squares+Projections+to+Latent+Structures+(PLS)+in+Chemistry.">Partial Least Squares Projections to Latent Structures (PLS) in Chemistry.</a> Encyclopedia of Computational Chemistry. , (2002).</li><li>Chong, I. G., Jun, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+some+variable+selection+methods+when+multicollinearity+is+present.">Performance of some variable selection methods when multicollinearity is present.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 78, (2005).</li><li>Inde, Z., Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+non-genetic+heterogeneity+on+cancer+cell+death.">The impact of non-genetic heterogeneity on cancer cell death.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1), 99-114 (2018).</li><li>Pan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-probe:+a+miniaturized+multifunctional+device+for+single+cell+mass+spectrometry+analysis.">The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis.</a> Analytical chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).</li><li>Rao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+Single-probe:+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Single+Cell+Analysis+under+Ambient+Conditions.">Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e53911 (2016).</li><li>Ali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Live+Single-cell+Mass+Spectrometry+with+Spatial+Evaluation+by+Three-Dimensional+Holographic+and+Tomographic+Laser+Microscopy.">Quantitative Live Single-cell Mass Spectrometry with Spatial Evaluation by Three-Dimensional Holographic and Tomographic Laser Microscopy.</a> Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (2), 125-127 (2016).</li><li>Abouleila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+single+cell+mass+spectrometry+reveals+cancer-specific+metabolic+profiles+of+circulating+tumor+cells.">Live single cell mass spectrometry reveals cancer-specific metabolic profiles of circulating tumor cells.</a> Cancer Science. 110, 697-706 (2018).</li><li>Hiyama, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Lipido-Metabolomics+of+Single+Floating+Cells+for+Analysis+of+Circulating+Tumor+Cells+by+Live+Single-cell+Mass+Spectrometry.">Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry.</a> Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 31 (12), 1215-1217 (2015).</li><li>Ryabchykov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+MALDI+Spectrometric+Imaging+and+Raman+Spectroscopic+Data+for+the+Analysis+of+Biological+Samples.">Fusion of MALDI Spectrometric Imaging and Raman Spectroscopic Data for the Analysis of Biological Samples.</a> Frontiers in Chemistry. 6, 257 (2018).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması beyan etmezler.

Bu yazıda, HepG2 hücrelerinin tamoksifene maruz kaldığı (ya da maruz kalmadığı) basit bir olgu seçilmiştir. Raman spektroskopisi ve kütle spektrometresi sisteminin yeteneği tamoksifenin hücreler üzerindeki etkilerini izlemek için gösterilmiştir. Raman spektroskopisi, tek hücrenin uyuşturucuya maruz kalma genel yanıtını yansıtan potansiyel biyobelirteçlerin tanımlanmasına olanak sağladı. Tek hücreler arasında bazı heterojenlik gözlenmiştir, bu da bazı hücrelerin uyuşturucuya maruz kalma larına yanıt vermediğini düşündürmektedir. Öte yandan, LSC-MS tek hücre düzeyinde ilaç ve metaboliti hedefli bir analiz yapma yeteneğine sahip oldu, hangi heterojenite yüksek derecede ilaç ve metabolit bolluğu gözlendi. Bu heterojenlik bazı hücrelerin ilaç tan etkilendiğini açıklamaya yardımcı olurken, diğerleri görünüşte değil, sözde tek tip popülasyondan kaynaklanan hücrelere rağmen12.
Bu tekniğin dikkat gerektiren belirli yönleri arasında, verilerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için mikroskop kurulumu ve sinyal işleme kalitesinin değerlendirilmesi önemlidir. Spektrumun ön işlemesi dikkatle yapılırsa, sinyal varyasyonları her tepenin yerel maksimum unda en üst düzeye çıkarılmalıdır. Buna karşılık, spektrumun taban çizgisi ve kenarı test edilen hücre koşulları arasında çakışmalıdır. Bir diğer önemli yönü tedaviler arasındaki farklılıkları araştırmak için kullanılan çok değişkenli modeldir. Bir dikkatle modelleri ve model parametreleri hassas ve doğru bir analiz sağlamak için değerlendirmek gerekir. PLS modelinin bir avantajı, sinir ağları aksine, her dalga boyu ile ilişkili ağırlıkları erişim sağlar (Raman vardiya) en iyi modeli tarafından test koşulları ayırt.
Raman spektroskopisi başarıyla ilaç yanıtı ayrımcılık rağmen, bu tekniğin biyolojik yorumu sağlamak için kullanımı sınırlı olduğu vurgulanmalıdır. Bunun başlıca nedeni binlerce molekülün karışımını kapsayan spektral sinyalin karmaşıklığıdır. Bu nedenle, Raman spektral yoğunlukları ve ilaç konsantrasyonları arasındaki sistematik varyasyonları değerlendirmek için daha fazla araştırma gereklidir. Ayrıca, diğer hücre hatları benzer çalışmalar tamoksifen ile ilişkili spektral biyobelirteçlerin genellemesi değerlendirmek için gereklidir.
Ayrıca, farmakodinamik değerlendirmek ve ilaçların her hücre içinde nüfuz ve akışı nasıl çalışma canlı doku ölçümleri yapmak ilgi olabilir. Ayrıca, LSC-MS'deki örnekleme adımının operatörün becerisine son derece bağlı olduğu unutulmamalıdır. Uzamsal çözünürlük, örnekleme den sonra kılcal damar içindeki hücre konumu ve iş gücü gibi parametreler tamamen işleç bağlıdır ve bu da LSC-MS'in büyük ölçekli benimsenmesini sınırlar. Ancak, otomatik örnekleme sistemleri bu sorunu hafifletmek olabilir. Ayrıca, LSC-MS kendi yerel durumlarında yapışık veya yüzen hücreleri örneklemede öne çıkan, doku bölümlerine gömülü örnekleme hücrelerinde daha kötü performans gösterir. Bunun nedeni, numune yoğunluğu yüksekse, numune kılcal ucunun kırılma eğilimidir. Bu nedenle, tek sonda gibi başka bir yaklaşım gibi bu gibi durumlarda daha uygun olabilir14,15.
Burada kullanılan hücreler en az örneklem hazırlığı ile ortam koşullarında örneklendirilebildiği için, LSC-MS bu protokolde Raman ile entegrasyonu ile gösterildiği gibi, diğer teknolojilerle kolayca entegre edilebilir. 3D holografi ile benzer bir entegrasyon hücre altı düzey16hücresel metabolitlerin mutlak nicelik elde etmek için izin verdi. Ayrıca, akış sitometri ile entegrasyon nöroblastom kanser hastalarının tek dolaşan tümör hücrelerinde metabolik biyobelirteçlerin ortaya çıkarılması için izin verdi17,18.
Gelecekte, görüntüleme yöntemleri19veri kümeleri birleştirerek son artan ilgi nedeniyle, aynı zamanda raman sinyalleri ve kütle spektrometresi sonuçları arasındaki sistematik varyasyonları incelemek için ilgi olabilir (yanı sıra diğer omics yöntemleri) entegre hesaplamalı yaklaşımlar kullanarak. İlginçtir, biz zaten VIP puanları ve tamoksifen veya ms4tarafından tanımlanan tek hücreli düzeyde metabolitbolü ile tanımlanan Raman zirvelerinin yoğunlukları arasında birkaç zayıf ama önemli doğrusal korelasyon bulduk . Bu veriler, MS profilleri ile Raman spektrumları arasında metabolik bir ilişki ve bu değerleri tahmin etme olasılığı önerebilir.

Hücreler mikro ortamlarındaki değişimlere tek hücredüzeyinde farklı tepki verirler, bu fenomen hücresel heterojenlik1olarak adlandırılır. Buna rağmen, mevcut uyuşturucu keşif çalışmaları hücre popülasyonlarının ortalama ölçümleri dayanmaktadır, hangi potansiyel alt popülasyonlar hakkında bilgi gizlemek yanı sıra tek hücrevaryasyonları2. Bu eksik bilgiler bazı hücrelerin ilaçlara neden daha duyarlı olduğunu açıklayabilirken, diğerleri dirençlidir. İlginçtir, ilaç yanıtı hakkında tek hücreli bilgi eksikliği ilaçların faz II klinik çalışmaların başarısızlığı için olası bir nedenidir3. Bu nedenle, bu sorunu gidermek için, ilaç ile hücresel etkileşimleri (yani, alım, metabolizma, ve yanıt) tek hücre düzeyinde ölçülmelidir.
Bunu başarmak için, içinde yaşayan tek hücrelerin etiketsiz Raman spektroskopisi kullanılarak tarandır benzersiz bir sistem tasarladık sonra daha fazla kütle spektrometresi kullanılarak karakterize4. Raman spektroskopisi hücresel devletin moleküler parmak izi sağlar, hücre içinde birçok molekülün katkıları sonucu karmaşık bir spektrum. Bu karmaşıklığa rağmen, Raman parmak izleri bütün bir hücrenin yapısı ve metabolizma 5 yansıttığı düşünülebilir5,6. Raman spektroskopisi, hücresel durumları noninvaziv ve nispeten yüksek bir şekilde ölçmede öne çıkmaktadır, bu da ilaç yanıtınıtek hücreli düzeyde taranması ve değerlendirilmesi için yararlıdır.
Buna karşılık, MS tek hücredüzeyinde ilaç alımını ölçmek için gerekli duyarlılık ve seçicilik sağlar. MS yıkıcı olduğundan (örnek [hücre] genellikle analiz sırasında tüketilir), zararsız, etiketsiz Raman spektroskopisi ile entegre yüksek iş ve hassas bir sistem sağlayabilir. Bu kombine platform ilaç alımı hakkında daha fazla bilgi sağlama yeteneğine sahiptir, metabolizma, ve etkileri tek hücredüzeyinde.
Bu el yazması entegre raman-MS platformu kullanarak in vitro kültürleri kullanarak tek hücre düzeyinde ilaçlarile hücresel etkileşimleri incelemek için kullanılan bir protokol açıklanır. Bunun için hepatosellüler karsinom hücreleri (HepG2) ve tamoksifen model olarak kullanılmaktadır. HepG2 hücreleri tamoksifen almak ve ilaç metabolize çünkü seçildi, ve aynı anda hepatotoksik etkileri nedeniyle etkilenir. Bu el yazmasında iki durum kullanılmaktadır: uyuşturucu ile tedavi edilen hücreler vs. tedavi edilmeyen hücreler (kontrol).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% penicillin-streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass bottom grid dish</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxy Tamoxifen standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm diode pumped solid-state laser</td>
			<td>Ventus, Laser Quantum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOS-L101T-S motorized microscope stage</td>
			<td>OptoSigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-2 cellomics coated sampling capillaries</td>
			<td>HUMANIX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d5-Tamoxifen standard</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide LC-MS grade</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf GELoader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone laboratories</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cell line (RCB1886)</td>
			<td>RIKEN cell bank center</td>
			<td>RCB1886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC0-19A1C Incubator</td>
			<td>Sanyo Electric Co.</td>
			<td>MC0-19A1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1060352500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMO-203 3-D Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MMO-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoflex nano-ESI adaptor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-stage incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce LTQ Velos ESI calibration solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIXIS BR400 cooled CCD camera</td>
			<td>Princeton Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail collagen coating solution</td>
			<td>Cell Applications Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85256</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated raman spectroscopy and mass spectrometry platform to study single-cell drug uptake, metabolism, and effects

Hücreler ilaçlara verdikleri yanıtlarda doğal olarak heterojen olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, tek hücreli heterojenitenin ilaç keşif çalışmalarında hesaba katEdilmesi esastır. Bu doğru tek hücre düzeyinde bir hücre ve ilaç arasındaki hücresel etkileşimlerin bolluk ölçme ile elde edilebilir (yani, ilaç alımı, metabolizma, ve etkisi). Bu makalede, ilaçlara yanıt olarak hücrelerin metabolik değişikliklerini izlemek için tek hücreli Raman spektroskopisi ve kütle spektrometresi (MS) platformu açıklanmaktadır. Bu platformu kullanarak, ilaca yanıt metabolik değişiklikler Raman spektroskopisi ile ölçülebilir, ilaç ve metaboliti aynı hücrede kütle spektrometresi kullanılarak ölçülebilir. Sonuçlar, tek hücreli düzeyde ilaç alımı, metabolizma ve yanıt hakkında bilgilere erişimin mümkün olduğunu göstermektedir.

İlaç etkileşimlerinin tek hücreli analizi (alım, metabolizma ve etkileri) herhangi bir gizli veya ilaca dirençli alt popülasyonun ortaya çıkarılmasında ve hücresel heterojenliğin etkilerini anlamada esastır. Bu protokolde, tek hücrelerde yukarıda bahsedilen etkileşimleri ölçmek için iki tamamlayıcı teknik kullanılmıştır: Raman spektroskopisi ve MS. Raman spektrometrisi ilaç yanıtının spektral biyobelirteçlerine dayalı ilaçlardan etkilenen hücreleri hızla tanımlatır. MS seçici ve yarı kantitatif bir şekilde ilacın alımını ve metabolizmasını izlemek için kullanılır. Hücreler önce Raman spektroskopisi ile tarandı, sonra ms tarafından analiz için ayrı ayrı örneklendi.
Her durumun (ilaç tedavisi olan ve olmayan) ortalama spektrumunun karşılaştırmalı analizi Şekil 2'degösterilmiştir. İki koşulun ortalama spektrumu, daha önce tanımlanmış ve moleküler bileşikler2'yeatanmış çeşitli zirvelerde açıkça farklılık göstermektedir. Özellikle, 1000 cm zirveleri- (fenilalanin ve tirozin gibi aromatik bileşikler atanan) güçlü farklılıklar göstermektedir. İstatistiksel farkın önemi daha fazla çok değişkenli analizlerle değerlendirilmelidir.
Veri seti daha sonra bir PLS modeli (adımlar 4.5-4.8) iki hücre tedavileri ayırt etmek amacıyla (ilaç ile: n = 290, ilaç olmadan: n = 115) eğitmek için kullanılmıştır. Tamoksifen varlığında kültürlenen hücreleri sınıflandırmak için tahminyeteneği% 100 duyarlılık ve test verilerinde% 72 özgüllük ulaştı (çapraz doğrulanmış eğitimli modelden bilinmeyen). Duyarlılık, model tarafından doğru bir şekilde tanımlanan gerçek pozitiflerin bir ölçüsüdür, özgüllük ise model tarafından tanımlanan gerçek negatiflerin bir ölçüsüdür. Bu çalışmada kapsamlı bir karşılaştırma yapılmamış olsa da, SVM'ler, LdA'lar ve sinir ağları gibi alternatif modeller benzer veya daha iyi sonuçlar sağlayabilir.
PLS modeline göre, deneysel koşulların ayırt inde dalga boylarının (Raman kaymaları) önemini temsil eden VIP puanları hesaplanmıştır(Şekil 3). Daha da önemlisi, VIP profillerinin en yüksek zirveleri raman zirvelerine karşılık gelirken, iki tedavi arasında güçlü farklılıklar görüldü. Bu tedavi ve tedavi edilmemiş hücreler arasındaki özel moleküler farklılıkları doğruladı. Sonuç olarak, araştırmacılar ilaç tedavisine tek hücrelerin yanıtını yansıtan olası spektral biyobelirteçleri belirleyebilirler. Bu biyobelirteçler, biyolojik alaka larını ve çeşitli koşullar ve hücre hatları arasında genellemelerini doğrulamak için daha fazla test edilebilir.
Canlı tek hücreli kütle spektrometresi (LSC-MS) sistemi, daha önce Raman spektroskopisi ile ölçülen tek, ilaç tedavi görmüş HepG2 hücrelerinde hem ilacı hem de metabolitlerini tespit etmeyi başardı. Buna ek olarak, tandem MS her iki molekülün yapısını doğrulamak için kullanılabilir. Pozitif tanımlamadan sonra, ilacın ve metabolitlerinin göreceli bolluğu her hücrede ölçüldü ve tedavi edilmeyen hücrelerdeki arka plan zirvelerine göre karşılaştırıldı. Tamoksifen bolluğunda güçlü bir varyasyon gözlendi ve bu fenomen metaboliti 4-OHT durumunda daha da belirgindi (Şekil 4). Tamoksifen bolluğu ile metabolitleri arasındaki ilişki de incelenmiş ve ikisi arasında anlamlı pozitif korelasyon saptakilmiştir (r = 0.54, p = 0.0001, n = 31).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig1.jpg"> Şekil 1: Hücre toplama sistemi mikroskop aşamasına monte edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig2.jpg"> Şekil 2: İlaçla tedavi edilen hücrelerin ortalama spektrumu (tamoksifen ile: n = 295) ve işlenmemiş hücreler (tamoksifen olmadan: n = 115). Raman zirveleri literatürden tanımlanabilir. Güçlü spektral farklılıkların çoğu istatistiksel olarak anlamlıdır (ANOVA, p ≤ 0.5) daha önce açıklandığı gibi4. Bu rakam önceki bir yayından değiştirilmiştir4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig3.jpg"> Şekil 3: Tahmine dayalı PLS modelinden çıkarılan VIP puanları. VIP puanları, modeldeki iki sınıf arasında ayrım yapmaya katkıda bulunan dalga boylarını yansıtır. Zirvelerin çoğu, ilaç tedavisi gören hücreler üzerindeki ilaç etkilerinin spektral biyobelirteçleri olarak gözlenen spesifik moleküllere karşılık gelmektedir. Bu rakam önceki bir yayından değiştirilmiştir4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig4.jpg"> Şekil 4: Tamoksifen bolluğunun ve metabolitinin dağılımı. Tamoksifen bolluğu ve metaboliti dağılımı, 4-OHT (tek hücre düzeyinde ölçülen) tedavi edilmeyen hücrelerde endojen zirveleri ile karşılaştırıldığında (kontrol). Bu rakam önceki bir yayından değiştirilmiştir4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects at JoVE.com

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Bu protokol, tek hücreli çözünürlüğe ulaşabilen entegre bir Raman spektroskopi-kütle spektrometresi (MS) platformu sunar. Raman spektroskopisi ilaçlara hücresel yanıt çalışma için kullanılabilir, MS ilaç alımı ve metabolizma hedefli ve kantitatif analizi için kullanılabilir iken.

Tek Hücreli İlaç Alımı, Metabolizması ve Etkileri Üzerine Entegre Raman Spektroskopisi ve Kütle Spektrometresi Platformu

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Metabolomik için yenilikçi bir yöntem geliştirdik. Belfry spektral görüntülemesini tek hücreli kütle spektrometresi ile birleştirdik. Tekniğimiz ilaçlara karşı tek hücrelerin metabolik değişikliklerini izleyebilir ve tahmin edebilir.Ve bu temel araştırma ve sanayi için bir çok uygulama açılır. Yöntemimiz, gelecekteki uyuşturucu keşif çabalarına büyük ölçüde yardımcı olacak mevcut ilaç değerlendirme tekniklerine tek hücreli çözüm ekler. Tekniğimiz aynı zamanda kanser direncinde hücresel heterojenliğin oynadığı rolü anlamamıza da yardımcı olabilir.Tek hücreli örnekleme ve veri analizi bu deneyin en zorlu yönleridir. Şu anda bu iki adımı, özellikle de örnekleme kısmını otomatikleştirmek üzerinde çalışıyoruz. Her mikromanipülatör kurulumu biraz farklı olduğundan ve denetimleri tanımak için zaman ayırmanız gerektiğinden, denemeden çok önce tek hücreli örnekleme uygulamanızı öneririz.Hücreleri %70'e ulaşmak için kuluçkaya yattıktan sonra, uygun bir kültür ortamına ilgi çeken kültür hücreleri, kontaminasyonu önlemek için Penisilin-Streptomisin ekleyin. Bir hemositometre üzerinde hücre yoğunluğu nu ölçtükten sonra, alt kültür hücreleri 35 milimetrelik cam alt ızgara çanak veya kuvars slaytlar içine, bir tohumlama yoğunluğu 0,7 kez 10 altıncı aynı ortamı kullanarak. Sonra 24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.Ertesi gün, hücreler %50 ila 60 arasında bir araya gelir önceden ısıtılmış PBS tamponuyla hücreleri iki kez yıkayın. 35 milimetrelik kültür yemeklerinde hücreleri ilaç tedavisi ve tedavi edilmeyen alt gruplara bölün. Mix Tamoxifen dimetil sülfoksit içinde kültür medya ile iki mililitre ve 10 mikromolar Tamoxifen konsantrasyonu son bir hacim elde etmek için çözülmüş.Bu ilaç tedavi grubu. DMSO'nun etkilerini incelemek için bir kontrol grubu olarak ortama karşılık gelen bir DMSO hacmini karıştırın. Her iki grubu da 24 saat boyunca sivri uçlu ortamın iki mililitresinde kuluçkaya yatırArak spektral ölçümlerden önce %70 ila %80'lik bir kesişmeye ulaşın, iğne deliği ve lazer pozisyonu eşleşmesini bir hedef kullanarak doğrulayın.Her deneyden önce spektrofotometreyi kalibre etmek için, etanolü cam bir alt çanağa yerleştirin, belirli bir lazer yoğunluğunda bir saniye boyunca tayfı ölçün ve tepeyi bilinen dalga boylarına bağlayın. Sonra mikro odayı %5 karbondioksit ve 37 santigrat dereceye sabitle. Mikroskop sistemi hazır olduğunda, hücreleri kuvözden çıkarın ve hücreleri 37 santigrat derecede ısıtılmış PBS tamponuyla iki kez durulayın.Sonra ısıtılmış PBS veya FloroBrite DMEM iki mililitre ekleyin. Su daldırma objektif üzerine 10 mikrolitre su ekleyin. Ve incelikle mikroskop aşamasına cam alt hücre çanak yerleştirin.Hücre örnekleme sistemini Raman mikroskobuna sabitle. 3D mikromanipülörü, numune emmeiçin boş bir şırıngaya bağlı olan cam kılcal tutucuya bağlayın. Cam kılcal damarucunu gözlemlemek için mikroskobu 40 kat yüksek büyütme alanına ayarlayın ve kırılmadığından emin olun.Mikromanipülatör kullanarak cam kılcal pozisyonu kontrol edin. Kılcal uç görüş alanında ortalanmış olduğundan emin olun. Daha sonra kültür çanak için açıklık vermek için Z-ekseni üzerinde kılcal yukarı taşıyın.Örnek kabı mikroskop un sahnesine yerleştirin, büyütme ve odaklamayı ayarlayın, ızgara çanağı üzerindeki hedef hücreyi seçin ve görüş merkezine taşıyın. Lazer çizgisini odaklayarak her hücreyi ölçün. Hücre başına 15 saniyelik maruz kalma süresi net raman sinyali olan bir hücrenin kesitini elde etmek için yeterlidir.Bir galvano-ayna birkaç düzine dakika içinde bir hücre veya hücre grubu tarama sağlar. Daha sonra dikkatlice ucu odak haline gelene kadar mikromanipülatör kullanarak cam kılcal aşağı indirin. Mikroskobik gözlem altında, kılcal ucu ile hedef tek hücreye dokunun.Sonra kılcal ucu içinde hücre tuzak şırınga kullanarak negatif basınç uygulamaya başlayın. Tam olarak hücrenin zamanlamasını ve emdi konumunu kontrol etmek için bir video alarak bu yordamı kaydedin. Kılcal damarı Z ekseninde yukarı doğru hareket ettirin.Daha sonra kapilleri kitle spektrometresi analizine hazırlanmak için forseps kullanarak kılcal damar tutucudan ayırın. Kütle spektrometresi aletini kurduktan ve ortamı analiz ettikten sonra, hücreyi içeren kılcal damara iyonizasyon çözücüsünün iki mikrolitresini ekleyin. Kapilleri uygun bir kütle spektrometresine bağlı bir nano-elektrosprey adaptörüne sabitle ve otomatik satın alma yöntemini başlatın.Burada, ilaç tedavisi olan ve olmayan her durumun ortalama spektrumunun karşılaştırmalı bir analizi gösterilmiştir. İki koşulun ortalama spektrumu çeşitli zirvelerde açıkça farklılık gösterir. Özellikle fenilalanin ve tirozin gibi aromatik bileşiklerin bir işareti olan 1,000 santimetredeki zirveler güçlü farklılıklar gösterir.Gizli yapı modelindeki projeksiyona göre, deneysel koşulların ayırt edilebilmesinde dalga boylarının önemini temsil eden VIP puanları hesaplanmıştır. Daha da önemlisi, VIP profillerinin en yüksek zirveleri raman zirvelerine karşılık gelirken, iki tedavi arasında güçlü farklılıklar görüldü. Bu tedavi ve tedavi edilmemiş hücreler arasındaki özel moleküler farklılıkları doğruladı.Pozitif tanımlamadan sonra, ilacın ve metabolitlerinin göreceli bolluğu her hücrede ölçüldü ve tedavi edilmeyen hücrelerdeki arka plan zirvelerine göre karşılaştırıldı. Tamoksifen bolluğunda güçlü bir varyasyon gözlendi. Ve bu fenomen, 4-hidroksi-tamoksifen metaboliti durumunda daha da belirgindi.Araştırmacılar spektral görüntüler ve hücrelerin metabolik profilleri arasındaki bağlantıyı keşfetmek ilginizi çekebilir. Farmasötik üretim için hücrelerin yerel tarama için izin verir, çünkü bizim araştırma da endüstriyel uygulamalar vardır. Kütle spektrometre ölçümleri için iyonizasyon çözücühazırlanırken dikkatli olunmalıdır.Duman kaputunun altında hazırlanmalı. Ayrıca, elektrik çarpmasını önlemek için kütle spektrometre aletinin iyon kaynağına dokunmamaya dikkat edin. Son olarak, ölçüm boyunca kullanılan örnekleme kılcal damarlar çok keskin, bu yüzden yaralanmayı önlemek için dikkatli bir şekilde bunları ele.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Bir UV-Vis ve Raman Spektroskopisi İmmunoassay Platformu imalatı

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Otomatik İş İstasyonu Kullanarak Kütle Spektrometresi Için Plazma Numune Spektrometresi Hazırlığı

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probuelektrosprey Iyonizasyon Kütle Spektrometresi için Örnek Hazırlama

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...