Name: tracking superparamagnetic iron oxide-labeled mesenchymal stem cells using mri after intranasal delivery in a traumatic brain injury murine model
Uploaded: 2019-11-21T15:00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for videnskab og teknologi tilskud, Taiwan (de fleste 104-2923-B-038-004-MY2, de fleste 107-2314-B-038-063, og de fleste 107-2314-B-038-042) og Taipei Medical University (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400, DP2-107-21121 -01-N-05 og DP2-108-21121 -01-N-05-01).

Alle procedurer, der involverer dyr i denne protokol, blev godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse med godkendelse fra den etiske komité for dyre brug i Taipei Medical University (godkendelses nr. LAC-2018-0574; 15.03.2019).
1. mærkning af MSCs med SPIO nanopartikler
<ol><li>For at mærke MSCs med SPIO tilsættes 6 mL mærknings medier (25 μg/mL SPIO i Dulbecco's modificerede Eagle medium [DMEM] uden føtal bovint serum [FBS]) til en T75 kolbe indeholdende MSCs (80% konfluency).</li>
	<li>
Cellerne inkubates med mærknings mediet i en CO2 -inkubator (37 °c, 5% Co2) uden rystelser. Efter 24 timer skal du forsigtigt fjerne mærknings mediet ved hjælp af en steril Pasteur-pipette med en plastikspids, der er fastgjort til et vakuum. Cellerne i enkeltlags vaskes 2x med 6 ml fosfat bufferet saltvand (PBS) for at fjerne eventuelle spor af ikke-internaliseret spio.
	<ol>
<li>For at afgøre, om cellerne er blevet mærket med succes, skal du kontrollere de mærkede celler under et fluorescerende mikroskop eller et Konfokal mikroskop, hvis spio er mærket med en fluoroforet (dvs. som dem, der anvendes her; Figur 1B, C). Alternativt kan du udføre preussisk blå farvning for cellerne (Se trin 6.2 – 6.4 for farvnings protokollen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Høst Vedde celler ved behandling med 3 mL trypsin og Inkuber ved 37 °C. Efter 5 minutters inkubation tilsættes 7 mL præ-varmede DMEM-medier med 10% FBS (v/v) for at inaktivere trypsin. Opsaml cellesuspensionen med en pipette i et 15 mL konisk rør.</li>
	<li>Centrifugering af cellesuspensionen ved 300 x g i 5 min. kassér supernatanten og resuspender celle pellet i PBS. Tæl de levedygtige celler ved hjælp af trypan og et blå farvestof og en hemocytometer. Bemærk: Celle pellet af de mærkede celler vises som en mørk farve på grund af jernbelastning (figur 1d). Denne protokol er relevant for MSC-mærkning og MR-scanning. Proceduren for MSC mærkning6 er tidligere optimeret, og kun trinene til at forberede mærket MSCS til at spore in vivo er inkluderet her, da in vivo tracking er fokus. Protokollen til dyrkning og mærkning af andre celletyper bør optimeres af forskeren.</li>
	<li>Juster celle koncentrationen ved hjælp af PBS til 150.000 celler (eller et tal, der resulterer i et tilstrækkeligt MRI-signal) i 18 μL PBS (eller det totale volumen, der vil blive anvendt i den intranasale leverings procedure). Bemærk: Det blev bemærket, at en celle koncentration højere end 150.000 celler/18 μL PBS fører til celle aggregering, hvilket kan påvirke effektiviteten af intranasal levering. Hvis et højere antal celler er nødvendige for intranasal levering, øge den samlede mængde af cellesuspension og øge antallet af intranasal forvaltninger, som intranasal administration er en ikke-invasiv procedure, og flere dosering er muligt.</li>
</ol>2. kontrolleret kortikal påvirkning (CCI) skade
Bemærk: I denne protokol, mandlige C57 BL/6 mus (7 – 8 uger gamle) blev holdt i en 12/12 h lys/mørk cyklus med ad libitum adgang til mad og vand.
<ol><li>For at forberede hver mus til CCI skade, administrere zolazepam (50 mg/kg) og xylazin (20 mg/kg) bedøvelsesmiddel cocktail via intraperitoneal (IP) injektion (1 ml/kg). Sørg for, at dybden af anæstesi er tilstrækkelig ved en mangel på tå-pinch respons. Alternativt kan du placere musen i et kammer forsynet med 2% – 4% isofluran til 60 s.
</li>
	<li>Barberer pels af den dorsale overflade af kraniet mellem ørerne ved hjælp af en elektronisk hårklipper. Rengør det barberede område flere gange ved hjælp af en steril vatpind gennemblødt i jod. Brug en vatpind gennemblødt i 70% ethanol til at rense jod.</li>
	<li>Placer den bedøvede mus i den stereotaktiske ramme og fastgør musen ved hjælp af ørepude og næse stænger. Lav en mellemsagittal indsnit (ca. 2,5 cm) i den barberede hud ved hjælp af steril saks til at få adgang til overfladen af kraniet.</li>
	<li>Fjern vævet på knoglen ved hjælp af en bomulds pude til at udsætte kraniet. Rengør kraniets overflade ved hjælp af en vatpind gennemblødt i en 3% H2O2 for 10 s, og Rengør den derefter med en tør bomulds pude. Bemærk: Kraniet suturer og både bregma og lambda kan nu let identificeres.</li>
	<li>Identificer koordinaterne for valg på kraniets overflade for CCI-skaden og tegn en cirkel (4 mm diameter) omkring koordinaterne ved hjælp af en blyant eller korrekt markør. Bemærk: I denne protokol blev koordinaterne ved anteeroposterior (AP)-2,0 mm og mediolaterale (ML) + 1,5 mm anvendt til CCI-induktion.</li>
	<li>Brug en mikrobor og rund Burr (0,5 mm diameter) til at tynde kraniet på den markerede cirkel. Undgå at anvende tryk under boring, da boring gennem knoglen kan forårsage skade på hjerne parentchyma. Rengør knogle støvet væk med en ren og tør vatpind.</li>
	<li>Fjern forsigtigt knogle klappen ved hjælp af sterile fine pincet for at udsætte dura mater, samtidig med at den forbliver intakt. Fjern musen fra den stereotaktiske ramme, der blev brugt til forberedelse af præ-skade og Placer den i den stereotaktiske ramme af CCI-enheden.</li>
	<li>Stabilisere hovedet af musen ved hjælp af øre barer og næse stænger. Sørg for, at hovedet af musen er niveau i rostral-caudal retning og justere næse stænger, hvis det er nødvendigt.</li>
	<li>Følg instruktionerne på betjenings boksen for at nulpunkt slaglegemets spids til den eksponerede kortikale overflade. Sørg for, at slag spidsen er justeret direkte over de ønskede cortex koordinater for at blive påvirket ved hjælp af X-og Y-kontrol hjulene på bunden af slaganordningen.</li>
	<li>Indstil eksperiment parametrene ved hjælp af kontrol boksen med en hastighed på 5 m/s, opholdstid på 250 MS og skade dybde på 1 mm for at fremkalde mild skade i musen.</li>
	<li>Fremkald skade ved at trykke på ' ' Impact ' ' knappen på betjenings boksen. Svaber enhver blødning, der opstår ved hjælp af en steril vatpind.</li>
	<li>Fjern musen fra den stereotaktiske ramme og lukke indsnit ved hjælp af silke kirurgiske suturer. Brug ikke metalclips til at lukke operationsstedet, da musen vil blive udsat for et magnetfelt for MRI.</li>
	<li>Påfør topikale antibiotika (bacitracin neomycin) til operationsstedet for at forebygge infektioner. Hold musen på varmepuden og overvåge den nøje under gendannelses fasen.</li>
	<li>Giv ketoprofen (2,5 mg/kg, IP) dagligt i 3 dage efter operationen, medmindre ketoprofen-administrationen modsiger undersøgelsens mål.</li>
</ol>3. intranasal levering
<ol><li>Ved 1 dag post-CCI induktion, administrere zolazepam (50 mg/kg) og xylazin (20 mg/kg) bedøvelsesmiddel cocktail via IP injektion. Sørg for, at musen er dybt bedøvet af manglende tå-knivspids respons.</li>
	<li>
Forbered musen til intranasal levering af MSCs ved hyaluronidase behandling.
	<ol>
<li>Grib musens Scruff og tænd dens ryg fast, mens immobilisering kraniet. Spidsen af en pipette, der indeholder hyaluronidase, placeres i steril PBS (4 e/μL) i nærheden af musens næsebor i en vinkel på 45 °.</li>
		<li>Giv 3 μL hyaluronidase suspension i hvert næsebor. Hold musen immobiliseret og vender opad på en ren pad i 5 min. gentagen hyaluronidase-behandling 4X (i alt 100 U hyaluronidase suspension).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Efter hyaluronidase behandling, holde den behandlede mus på en ren pad vender opad i 30 min.</li>
	<li>Hold musen fast, som beskrevet i trin 3.2.1, for at levere MSCs ind i hjernen. Der administreres 3 μL/næsebor af MSC suspension med et interval på 3 s. Hold musen i samme position i 30 s, indtil prøve dråberne er helt forsvundet. Bemærk: Undgå at danne luftbobler under administrationen.</li>
	<li>Gentag administrationen med et interval på 2 min. op til 3x. Bemærk: Det samlede antal celler, der skal leveres, er 150.000, således at 18 μL af cellesuspensionen kan leveres ved en dosis på 3 μL for hvert næsebor, 3x hver.</li>
	<li>Returnere musen til sit bur og overvåge det nøje, indtil det fuldt ud genopretter fra anæstesi.</li>
</ol>4. in vivo magnetisk resonansbilleddannelse
Bemærk: Histologisk farvning af hjernevæv har tidligere været anvendt til at bekræfte den vellykkede levering af stamceller efter intranasal administration. Denne metode kan dog kun anvendes som endepunkt for en undersøgelse, ikke i længderetningen. Brug af Mr-sonder til at mærke terapeutiske stamceller vil give mulighed for langsgående, ikke-invasiv, in vivo sporing af cellerne ved hjælp af Mr. Vigtigere, denne protokol effektivt reducerer antallet af dyr, der kræves. I denne protokol blev MRI-scanning udført på dag 1, 7 og 14 efterleve ring af MSCs.
<ol><li>For at forberede musen til MRI-scanning, bedøve musen med isofluran (5% isofluran i 1 L/min af O2 for induktion, 1,5% – 2% isofluran til vedligeholdelse). Udfør en tå-knivspids for at sikre, at musen når den nødvendige anæstesiniveau.</li>
	<li>Placer musen på billedbehandlings holderen og fastgør dens position ved hjælp af haner eller en anden korrekt metode. Flyt holderen til midten af MRI-spolen (7 T/40 cm magnet), og Tilslut overvågnings tilslutningen.</li>
	<li>Hvis du vil anskaffe T2 *-vægtede scanninger ved hjælp af en spin-ECHO-sekvens, skal du indstille gentagelsestiden (TR) til 1500 MS og ECHO time (TE) til 2,8 MS.</li>
	<li>Brug et 16 mm x 16 mm synsfelt (FOV), 128 x 128 Acquisition matrix (MTX) og skive tykkelse på 0,75 x 0,8 mm2 med fire signal gennemsnit og en 90 ° flip Angle (FA).</li>
	<li>Træk muse holderen tilbage fra MRI-spole centeret, når scanningerne er fuldført. Returnere musen til sit bur og overvåge det nøje, indtil det helt genopretter fra anæstesi.</li>
	<li>
Hvis du vil spore og kvantificere de mærkede MSCs på de T2 *-vægtede billeder, skal du bruge ITK-SNAP-softwaren (version 3.8.0)7.
	<ol>
<li>Overfør de rå data fra MRI-scanninger fra MRI-maskinens computer til den computer, der bruges til analyse i et DICOM-format (Digital Imaging and Communications in Medicine).</li>
		<li>Kør ITK-SNAP-softwaren, og Indlæs MRI-billederne ved at klikke på knappen filer . Klik derefter på Åbn hoved billede i menuen. Tryk på knappen Åbn billede i displayvinduet, og Find og Åbn derefter MRI-billederne ved hjælp af knappen Gennemse . Bemærk: Visualiseringen af mærkede celler i MRI-billederne vises som hypointense-områder. Hvis billedets kontrast skal justeres, skal du vælge værktøjer | Billede kontrast.</li>
		<li>Opret segmenteringer af de hypoinspændte områder og læsion eller andre hjerne dele ved at vælge aktiv etiket i afsnittet segmenterings etiketter. Brug forskellige etiket farver til forskellige segmenter (hvis segmentering af mere end én del er påkrævet).</li>
		<li>Brug polygon værktøjet på hovedværktøjslinjen til at tegne rundt om de hypoinspændte områder, der repræsenterer de Spio-mærkede MSCS. Vælg Acceptér, der er placeret under MRI-billedet. De segmenterede områder vises som den samme farve på den aktive etiket, der er tildelt det pågældende segment. Gentag dette segmenterings trin for alle MRI-udsnit.</li>
		<li>Udvikl et 3D-kort over de segmenterede områder for at repræsentere MSC-distributionen i hele hjernen ved at vælge skalpel værktøjet nederst på 3D-værktøjslinjen, der findes i afsnittet segmenterings etiketter nederst i theitk-snap Toolbox. Tryk derefter på Acceptér nederst på det oprettede 3D-kort.</li>
		<li>Hvis du vil udføre en kvantitativ analyse (volumen og intensitet) af de segmenterede hypoinspændte områder, der repræsenterer mærkede celler, skal du trykke på segmenterings knappen i øverste panel og vælge lydstyrke og statistik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. fiksering af muse hjernen og Kryosectioning
<ol><li>
For at fastsætte muse hjernen, udføre transcardiac perfusion med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) efter den sidste MRI-scanning, som tidligere beskrevet8.
	<ol>
<li>Decapitate hovedet og udtrække hjernen8. Fastgør hjernen med 4% PFA i mindst 48 h ved 4 °C.</li>
		<li>Dehydrere hjernen ved at fordybe den i en 30% saccharoseopløsning ved 4 °C, indtil hjernen synker til bunden af opløsningen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Integrer hjernen i den optimale skære temperatur (OCT) opløsning og fryse ved-20 °C. Afsnit hjernen med en kryostat mikrotom i skiver med 14 μm tykkelse og montere dem på slides. Opbevar afsnittene slides ved-20 °C indtil videre brug.</li>
</ol>6. preussisk blå farvning
Bemærk: Preussisk blå farvning er almindeligt anvendt til at detektere jernindholdet i SPIO-mærkede celler. Her bruges preussisk blå farvning til at bekræfte, at de hypoinspændte signaler i MRI-billederne svarer til de SPIO-mærkede MSCs og ikke til artefakter. Preussisk blå farvning er en af de mest følsomme histokemiske metoder, der anvendes til at detektere jern i væv og kan bruges til at identificere selv et enkelt granulat af jern i cellerne.
<ol><li>Vask slides af hjernen sektioner med destilleret vand i 5 min.</li>
	<li>Udfør preussisk blå farvning ved at fordybe slidene i 30 min i Farvningsopløsningen, som indeholder lige dele saltsyre (10%) og kaliumferrocyanid (10%) tilberedes umiddelbart før brug.</li>
	<li>Vask 3x med destilleret vand, i 5 minutter hver. Counterstain afsnittene med nuklear fast rød i 5 min. Skyl gliderne 2x med destilleret vand.</li>
	<li>Dehydrere sektionerne gradvist ved at fordybe diassene i 95% og 100% alkohol i 2 minutter hver. Tilføj dækglas med et rungende monterings medium.</li>
	<li>Brug et let mikroskop til at detektere de farvede celler i hjernen sektioner. Bemærk: Strygejernet i de mærkede celler vises som blå farvede aflejringer.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pelled, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad8/BMP2-engineered+mesenchymal+stem+cells+induce+accelerated+recovery+of+the+biomechanical+properties+of+the+Achilles+tendon.">Smad8/BMP2-engineered mesenchymal stem cells induce accelerated recovery of the biomechanical properties of the Achilles tendon.</a> Journal of Orthopedic Research. 30 (12), 1932-1939 (2012).</li><li>Shahror, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Overexpressing+Fibroblast+Growth+Factor+21+Facilitates+Cognitive+Recovery+and+Enhances+Neurogenesis+in+a+Mouse+Model+of+Traumatic+Brain+Injury.">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 Facilitates Cognitive Recovery and Enhances Neurogenesis in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury.</a> Journal of Neurotrauma. , (2019).</li><li>Danielyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+cells+to+the+brain.">Intranasal delivery of cells to the brain.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (6), 315-324 (2009).</li><li>Karussis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunological+effects+of+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+patients+with+multiple+sclerosis+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Archives in Neurology. 67 (10), 1187-1194 (2010).</li><li>Danielyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells,+macrophages,+and+microglia+to+the+brain+in+mouse+models+of+Alzheimer's+and+Parkinson's+disease.">Intranasal delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, macrophages, and microglia to the brain in mouse models of Alzheimer's and Parkinson's disease.</a> Cell Transplant. 23, 123-139 (2014).</li><li>Shahror, R. A., Ali, A. A. A., Wu, C. C., Chiang, Y. H., Chen, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Homing+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Overexpressing+Fibroblast+Growth+Factor+21+to+Injury+Site+in+a+Mouse+Model+of+Traumatic+Brain+Injury.">Enhanced Homing of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 to Injury Site in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury.</a> International Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li><li>Yushkevich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=User-guided+3D+active+contour+segmentation+of+anatomical+structures:+significantly+improved+efficiency+and+reliability.">User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability.</a> Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Li, Y., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+stromal+cell+transplantation+in+stroke+and+traumatic+brain+injury.">Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury.</a> Neuroscience Letters. 456 (3), 120-123 (2009).</li><li>Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+CNS+repair+following+TBI.">Strategies for CNS repair following TBI.</a> Experimental Neurology. 275, 411-426 (2016).</li><li>Ohtaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/progenitor+cells+from+bone+marrow+decrease+neuronal+death+in+global+ischemia+by+modulation+of+inflammatory/immune+responses.">Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14638-14643 (2008).</li><li>Mahmood, A., Lu, D., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+marrow+stromal+cells+(MSCs)+increases+the+expression+of+growth+factors+in+rat+brain+after+traumatic+brain+injury.">Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 21 (1), 33-39 (2004).</li><li>Hoehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+implanted+stem+cell+migration+in+vivo:+a+highly+resolved+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+investigation+of+experimental+stroke+in+rat.">Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16267-16272 (2002).</li><li>Reddy, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+mesenchymal+stem+cells+labeled+with+a+novel+chitosan-coated+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+using+3.0T+MRI.">In vivo tracking of mesenchymal stem cells labeled with a novel chitosan-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles using 3.0T MRI.</a> Journal of Korean Medical Science. 25 (2), 211-219 (2010).</li><li>Roeder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-response+of+superparamagnetic+iron+oxide+labeling+on+mesenchymal+stem+cells+chondrogenic+differentiation:+a+multi-scale+in+vitro+study.">Dose-response of superparamagnetic iron oxide labeling on mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation: a multi-scale in vitro study.</a> PLoS ONE. 9 (5), e98451 (2014).</li><li>Schafer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+human+mesenchymal+stromal+cells+with+superparamagnetic+iron+oxide+leads+to+a+decrease+in+migration+capacity+and+colony+formation+ability.">Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability.</a> Cytotherapy. 11 (1), 68-78 (2009).</li><li>Kostura, L., Kraitchman, D. L., Mackay, A. M., Pittenger, M. F., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feridex+labeling+of+mesenchymal+stem+cells+inhibits+chondrogenesis+but+not+adipogenesis+or+osteogenesis.">Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis.</a> NMR in Biomedicine. 17 (7), 513-517 (2004).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Den protokol, der er beskrevet her, repræsenterer generelle procedurer for SPIO-mærkningen af MSCs og MRI-sporing af SPIO-mærket MSCs post-intranasal levering. Protokollen giver mulighed for at studere migration og Biodistribution af MSCs efterleve ring in vivo i hjernen, ved hjælp af en ikke-invasiv metode.
MSCS er attraktive kandidater til stamcelle-baserede terapier for CNS lidelser og skader på grund af deres evne til at udskiller trofiske faktorer, der 1) udløser neurorestorative processer og 2) give neuroprotection, på grund af deres anti-inflammatoriske virkninger inden for skadeområde9,10,11,12. Selv om langsigtet MRI-sporing og detektion af SPIO-mærkede MSCs kan være begrænset på grund af fortynding af intercellulære SPIO med celledeling, kan mærkede celler påvises i op til flere uger efter transplantation i hjernen af dyremodeller13.
Også beskrevet her er mærknings protokollen for MSCS med spio nanopartikler belagt med dextran uden transfektering agenter. Andre protokoller er blevet anvendt i litteraturen14,15,16. I alle tilfælde bør disse protokoller dog justeres for celletype, SPIO-størrelse, inkubationstid og SPIO-koncentration. MSCS har vist sig at have nedsat chondrogenic differentiering potentiale, men ikke adipogenisk differentiering på spio mærkning17. Derfor anbefales det stærkt, at differentierings assays udføres før stamcelle levering for at evaluere SPIO'S indflydelse på stamcellernes differentierings styrke. I en tidligere undersøgelse, det blev påvist, at MSC mærkning med samme spio type og koncentration, der anvendes i her ikke påvirkede osteogen eller adipogenisk differentiering styrken af MSCS6.
Den intranasale vej af terapeutisk stamcelle levering for hjernen lidelser og skader er en lovende tilgang til den kliniske anvendelse af stamceller. Men de iboende og molekylære mekanismer, der dikterer opførsel af stamceller i næsehulen forbliver uklare. Selv om den intranasale rute er bredt udforsket for levering af små molekyler, er størrelsen og Biodistribution opførsel af den terapeutiske stamme adskiller sig fra små molekyler. Den nuværende protokol viser, at MSCs har tendens til at migrere mod skadestedet efter intranasal levering.
Her blev der brugt T2 *-vægtede billeder til at spore de SPIO-mærkede MSCs. Andre rapporter har brugt gradient ECHO Imaging. Men, følsomhed artefakter er ofte observeret i gradient ekko Imaging på grund af intercellulære SPIO. I den nuværende protokol var placeringen af de hypoinspændte områder, der repræsenterede de SPIO-mærkede MSCs på T2 *-vægtede billeder, den samme som placeringen af SPIO i hjerne sektioner som påvist ved histologisk undersøgelse (figur 3). Dette indikerer den passende følsomhed af T2 *-vægtet spin ECHO Imaging for SPIO-mærket MSC tracking i hjernen.
Sammenfattende er den beskrevne protokol gavnlig for in vivo stamcelle tracking undersøgelser af hjerneskader og lidelser. Den langsgående sporing af stamceller in vivo er traditionelt blevet udført ved at ofre dyr på flere tidspunkter. Den nuværende protokol giver en ikke-invasiv og effektiv tilgang til MSCs levering og sporing, som repræsenterer en potentiel procedure for stamcelle-baserede terapi for hjerneskader og lidelser i kliniske miljøer.

Mesenchymal stamceller (MSC) er attraktive kandidater til stamcelle-baserede terapier i behandlinger af centralnervesystemet (CNS) lidelser og skader hos mennesker. Desuden har MSCS været anvendt som et middel til levering af terapeutiske proteiner på skades områder1,2. I de seneste år, lovende innovationer er blevet udviklet til at etablere 1) nye ruter af celle levering og 2) celle sporing for stamcelle-baserede behandlinger af CNS lidelser. Den intranasale levering af stamceller i hjernen afhænger af cellernes evne til at omgå cribriform pladen og ind i olfaktoriske pære delvist via en parentchymal rute3. Kombinationen af intranasal levering og mærkning af MSCS med superparamagnetiske jernoxid (spio) nanopartikler repræsenterer en lovende tilgang til kliniske anvendelser af MSCS i behandling af CNS-lidelser, da spio nanopartikler er sikre sonder for magnetisk resonans imaging (MRI) og tillader ikke-invasiv følsom langsgående sporing af MSCS efterleve ring af MRI3,4,5. Desuden er intranasal levering en sikker og ikke-invasiv rute, der giver mulighed for gentagen administration inden for en kort tidsperiode.
Denne artikel beskriver en meget følsom og ikke-invasiv teknik til sporing af MSCs in vivo post-intranasal levering i en musemodel af traumatisk hjerneskade (TBI), som beskæftiger SPIO-mærkede celler og MRI. En vigtig fordel ved SPIO-mærkningen er den følsomme påvisning af SPIO i vævet af MRI, hvilket gør det muligt at spore cellerne effektivt og ikke-invasivt. De SPIO nanopartikler, der anvendes her, er kommercielt tilgængelige og mærket med en fluorescein isothiocyanat (FITC) fluorophore, som giver mulighed for påvisning af SPIO i væv uden immun farvning eller yderligere behandling. Desuden er det muligt at udføre realtidssporing i længderetningen og undersøge biodistributionen af de leverede MSCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Cell culture supplies (Plastics)</td>
			<td style="width:197px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">Varies</td>
			<td style="width:171px;">Replaceable with any source</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Disposable Microtome Blade</td>
			<td style="width:197px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">95057-832</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">10565-018</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:181px;">Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.)</td>
			<td style="width:197px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:179px;">4583</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">12662-029</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Fluorescence Wild Field Microscope</td>
			<td style="width:197px;">Olympus</td>
			<td style="width:179px;">Olympus BX43</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Forcept</td>
			<td style="width:197px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:179px;">11293-00</td>
			<td style="width:171px;">Surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">15710-064</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Hair clipper</td>
			<td style="width:197px;">Pet Club</td>
			<td style="width:179px;">PC-400</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Head Trauma Contusion device</td>
			<td style="width:197px;">Precision Systems and Instrumentation</td>
			<td>Model TBI-0310</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td style="width:197px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:179px;">H3506</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:181px;">ITK-SNAP Software</td>
			<td style="width:197px;">Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah</td>
			<td>ITK-SNAP 3.8.0</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Ketamine (Ketavet)</td>
			<td style="width:197px;">Pfizer</td>
			<td style="width:179px;">778-551</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Mice</td>
			<td style="width:197px;">National Laboratory Animal Center, Taiwan</td>
			<td style="width:179px;">C57BL6</td>
			<td style="width:171px;">Wild type mice strain used in the study</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:181px;">Microdrill</td>
			<td style="width:197px;">Nakanishi</td>
			<td style="width:179px;">NE50</td>
			<td style="width:171px;">Combine with Burrs for generating the bone window</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Microtome</td>
			<td style="width:197px;">Leica</td>
			<td style="width:179px;">RM2265</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">S1502-100</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">MRI scanner</td>
			<td style="width:197px;">Bruker Biospec</td>
			<td></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td style="width:197px;">Corning Cellgro/ThermoFisher</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Povidone-iodine 7.5%</td>
			<td style="width:197px;">Purdue product L.P.</td>
			<td></td>
			<td style="width:171px;">Surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Prussian Blue Stain</td>
			<td style="width:197px;">Abcam</td>
			<td style="width:179px;">ab150674</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Scissor</td>
			<td style="width:197px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:179px;">14084-08</td>
			<td style="width:171px;">Surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Stereotaxic frame</td>
			<td style="width:197px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:179px;">Model 900</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:181px;">Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles</td>
			<td style="width:197px;">BioPAL</td>
			<td style="width:179px;">Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51</td>
			<td style="width:171px;">stem cells labeling for in vivo tracking using MRI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Suture monofilament</td>
			<td style="width:197px;">Ethicon</td>
			<td style="width:179px;">G697</td>
			<td style="width:171px;">Suture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Timer</td>
			<td style="width:197px;">Wisewind</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:171px;">Replaceable with any source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">TrypLE</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">12604-013</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Xylazine (Rompun)</td>
			<td style="width:197px;">Bayer</td>
			<td style="width:179px;">QN05 cm92</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking superparamagnetic iron oxide-labeled mesenchymal stem cells using mri after intranasal delivery in a traumatic brain injury murine model

Stamcelle-baserede terapier for hjerneskader, såsom traumatisk hjerneskade (TBI), er en lovende tilgang til kliniske forsøg. Tekniske forhindringer såsom invasiv celle levering og sporing med lav transplantations effektivitet er dog fortsat udfordringer i translationel Stam baseret behandling. Denne artikel beskriver en ny teknik til stamcelle mærkning og sporing baseret på mærkning af mesenchymal stamceller (MSCs) med superparamagnetiske jernoxid (SPIO) nanopartikler, samt intranasal levering af de mærkede MSCs. Disse nanopartikler er fluorescein isothiocyanat (FITC)-indlejret og sikkert at mærke MSCs, som efterfølgende leveres til hjernen af TBI-induceret mus ved intranasal rute. De spores derefter ikke-invasivt in vivo ved real-time magnetisk resonans imaging (MRI). Vigtige fordele ved denne teknik, der kombinerer SPIO for celle mærkning og intranasal levering omfatter (1) non-invasiv, in vivo MSC tracking efterleve ring for lange tracking perioder, (2) muligheden for flere doseringsregimer på grund af den ikke-invasive rute for MSC levering, og (3) mulige applikationer til mennesker, på grund af sikkerheden af SPIO, ikke-invasiv karakter af celle-tracking metode ved MRI, og administrationsvej.

Fireogtyve timer efter intranasal levering blev de SPIO-mærkede MSCs detekteret som stærke hypointense områder mediale til den kortikale skade på T2 *-vægtede billeder (figur 2b), hvilket indikerer den målrettede migrering af spio til skades stedet. Denne migration forblev synlig op til 14 dage efterleve ring, da de hypointense signaler blev fundet at være synlige uden signifikant reduktion for denne periode (figur 2b). De skadede dyr, der blev behandlet med PBS viste ingen hypointense områder, hvilket indikerer, at de observerede hypointense områder svarer til SPIO mærket MSCs og ikke at signalere artefakter (figur 2a) biodistributionen af de mærkede MSCS, der blev observeret in vivo med MRI, blev visualiseret ved hjælp af 3D-genopbygning (figur 2C, D). Migrationen af MSCs til den skadede cortex blev bekræftet histologisk af preussisk blå farvning og FITC-kanal detektering af den FITC-mærkede SPIO i de mærkede MSCs (figur 3A, B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig1.jpg"> Figur 1: skematisk rutediagram af protokollen og in vitro bekræftelse af spio optagelse af MSCS. (A) MSCS blev inkuberet med spio i 24 timer for mærkning. Derefter blev de mærkede MSCs leveret til en TBI-musemodel via en intranasal (IN)-rute. MRI på forskellige tidspunkter blev udført for at spore de mærkede MSCs. bekræftelse af tilstrækkelig mærkning af MSCs ved SPIO blev opnået ved (B) Fluorescens mikroskopi og (C) Konfokal mikroskopi ved hjælp af FITC-kanalen, da spio nanopartikler blev mærket med FITC. (D) celle pellet af de mærkede MSCs syntes mørk i farve på grund af jern lastning. FITC = fluorescein isothiocyanat; SPIO = superparamagnetiske partikler af jernoxid; MSCs = mesenchymal stamceller; MRI = magnetisk resonansbilleddannelse; I = intranasal; TBI = traumatisk hjerneskade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig2.jpg"> Figur 2: MRI i realtid gør det muligt at registrere og spore SPIO-mærket MSC migration mod skade sites i hjernen hos TBI-inducerede mus. A) mus blev underkastet TBI, efterfulgt af behandling med PBS eller spio-mærkede MSCS, administreret via en intranasal rute 24 timer efter skade. Coronal sektioner af T2 *-vægtede billeder viste de mærkede MSCs som et hypointense område (Arrowhead) på kanten af skades stedet (skitseret område) ved 1, 7 og 14 dage efterleve ring. De PBS-behandlede mus viser intet hypointense område. (B) segmenterings processen for skades området (grøn) og mærket MSCS (rød) baseret på koronalsektion T2 *-MRI-billeder. (C) 3D rekonstruktion af muse hjernens behandling baseret på T2 *-vægtede billeder, som illustrerer biodistributionen af spio-mærkede MSCS i hjernen 14 dage efter fødslen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig3.jpg"> Figur 3: histologisk analyse bekræfter tilstedeværelsen af SPIO-mærkede MSCs i hjernen hos de behandlede dyr. Prussian blå farvning af hjernen sektioner af a (a) mus behandlet med PBS (Control) og (C) mus behandlet med Spio-mærket MSCS. spio-positive celler blev påvist i MSC-behandlet mus (boxed celler, blå), mens kontrol musen viste ingen positive celler på skadestedet i cortex på 14 dage efterleve ring, bekræfter Mr observationer. Fluorescens mikroskopi analyse af cortex af a (B) kontrol mus behandlet med PBS og (D) mus behandlet med Spio-mærket MSCS blev udført 14 dage efterleve ring. Analysen afslørede tilstedeværelsen af FITC-mærkede SPIO-positive celler (boxed celler, grøn) på den skadede cortex i MSC-behandlede mus, men ingen FITC signaler blev observeret i cortex af PBS-behandlede mus. Skala stænger = 50 μm, medmindre andet er angivet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model at JoVE.com

Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model

Præsenteret her er en protokol for ikke-invasiv mesenchymal stamcelle (MSC) levering og sporing i en musemodel af traumatisk hjerneskade. Superparamagnetiske jernoxid nanopartikler er ansat som en MRI-sonde (magnetisk resonans imaging) til MSC-mærkning og ikke-invasiv in vivo-sporing efter intranasal levering ved hjælp af MRI i realtid.

Tracking superparamagnetisk jernoxid-mærket Mesenchymal stamceller ved hjælp af MRI efter intranasal levering i en traumatisk hjerneskade murine model

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical ...

Denne metode kan hjælpe med at bestemme basisfordelingen af den lobitic stamceller efter intranasal levering til hjernen. Den største fordel ved denne teknik er, at letter ikke-invasiv levering og sporing af mesenkymale stamceller til hjernen. Også, de mange doser er muligt at maksimere de terapeutiske virkninger af de transplanterede celler på det kroniske stadium efter skader.Denne teknik maksimerer antallet af celler leveret til skadesstedet og minimerer udviklingen af lobitic celle i andre væv. Selv om denne teknik giver indsigt i brugen af mesenkymale stamceller i traumatiske hjerneskade behandlinger, det kan også bruges til undersøgelse af ikke-traumatiske hjerneskader. For mesenkymal stamcelle mærkning med super paramagnetisk jernoxid, tilsættes seks milliliter mærkning medium til en 80% sammenløbet mesenkymal stamcellekultur i en T 75 kolbe for en 24-timers inkubation ved 37 grader celsius og 5% kuldioxid.Den næste dag, omhyggeligt aspirere super natant og vask cellerne to gange med seks milliliter PBS per vask. For at afgøre, om cellerne er blevet mærket med succes, skal du kontrollere kulturen under et lysstofmikroskop. For at fremkalde en CCI skade, efter at have bekræftet en manglende reaktion på pedal refleks, bruge elektroniske klippere til at barbere pelsen fra rygoverfladen af kraniet, og rense det barberede område flere gange med en steril vatpind dyppet i jod.Brug en vatpind dyppet i 70% ethanol til at fjerne jod efter den sidste podning og placere dyret i en stereotaktisk ramme. Fastgør musen med øre og næse stænger og gøre en 2,5 centimeter midsagittal snit i den barberede hud for at få adgang til overfladen af kraniet. Brug en vatrondel til at fjerne det væv, der dækker kraniet og rense kraniets overflade i 10 sekunder med en vatpind dyppet med 3% hydrogenperoxid.Tør kraniet med en frisk vatrondel og bruge en blyant til at tegne en fire millimeter cirkel omkring koordinaterne for valg på den eksponerede knogle. Ved hjælp af en mikro boremaskine udstyret med en 0,5 millimeter diameter runde bor, omhyggeligt tynde kraniet på den markerede cirkel uden at anvende pres. Fjern eventuelt knoglestøv med en ren og tør vatpind, og brug sterile arkiverede kraftbelinringer til forsigtigt at fjerne den resulterende knogleklap.Når dura mater er blevet udsat, overføre musen ind i stereotaktiske ramme af CCI enheden, og sikre dyret med øre og næse barer, således at hovedet er niveau i rostrocaudal retning. Efter instruktionerne på kontrolboksen skal slaggespidsen nulstilles på den eksponerede kortikale overflade ved hjælp af X- og Y-kontrolhjulene i bunden af slaganen for at justere slaghuggerspidsen direkte over de ønskede cortex-koordinater, der skal påvirkes. Brug kontrolboksen til at indstille eksperimentparametrene til en hastighed på fem meter i sekundet, en dvæletid på 250 millisekunder og skadesdybde på en millimeter for at fremkalde en mild skade.Tryk derefter på kollisionsknappen på kontrolboksen. Podning enhver blødning, der opstår med en steril vatpind og fjerne musen fra rammen. Luk snittet med silke kirurgiske suturer og anvende aktuelle antibiotika til webstedet, før du placerer musen på en varmepude med overvågning, indtil fuld recumbency.En dag efter skaden, behandle super paramagnetisk jernoxid mærket mesenkymal stamcellekultur med tre milliliter trypsin. Efter fem minutter ved 37 grader Celsius påbegyndes reaktionen med syv milliliter forvarmt DMEM-medium suppleret med 10 % føtalt kvægserum og cellesuspensionen opsames i et 15 milliliter konisk rør. Cellerne sedimenters ved centrifugering, og pellet i PBS suspenderes igen til optælling.Juster derefter cellekoncentrationen til 1,5 gange 10 til de fem celler pr. 18 mikroliter PBS. For celle levering, efter at have bekræftet den manglende reaktion på tå knivspids, scruff musen, mens immobilisere kraniet. Placer spidsen af en pipette, der indeholder fire enheder hyaluronidase per microliter af PBS nær nare af musen i en 45 graders vinkel, og administrere tre mikroliter hyaluronidase suspension i hvert næsebor.Placer dyret med billedsiden op på en ren pude i fem minutter, før behandlingen gentages fire gange for i alt 100 enheder af hyaluronidase behandling. Efter den sidste behandling skal du placere musen tilbage på puden i 30 minutter, før du fastholder musen som netop demonstreret. Når hovedet er immobiliseret, skal du administrere tre mikroliter af mesenkymal stamcellesuspensionen i hvert næsebor over en periode på tre sekunder pr. opløsningslevering, holde musen på plads i 30 sekunder, indtil prøvedråberne er helt forsvundet.Efter to minutter gentages leveringen op til tre gange, indtil hele mængden af mesenkymal stamceller er leveret. Derefter returnere musen til sit bur med overvågning, indtil fuld recumbency. For at spore migration af mesenkymale stamceller ved MR, placere bedøvet musen på billedbehandling indehaveren af MR imager.Derefter sikre dyret på plads og flytte indehaveren til midten af MR-spolen. Indstil gentagelsestiden til 1500 millisekunder og ekkotiden til 2,8 millisekunder. Derefter indstilles synsfeltet til 16 med 16 millimeter, erhvervelsesmatrixen til 128 med 128 og skivetykkelsen til 0,75 gange 0,8 millimeter med fire signalgennemsnit og en 90 graders flip vinkel for at erhverve T2-stjernevægtede scanninger ved hjælp af en spin echo-sekvens.Når scanningerne er afsluttet, trækkes museholderen tilbage fra MR-spolecentret, og musen returneres til buret med overvågning, indtil den er fuld recumbency. Hvis du vil spore og kvantificere de mærkede mesenkymale stamceller på T2-stjernevægtede billeder, skal du åbne dataene i it-case-snap-softwaren og vælge aktiv etiket. For at oprette segmenteringer af hypointense områder og læsion eller andre hjerne dele af interesse, ved hjælp af forskellige etiket farver for hvert segment.Brug polygonværktøjet i hovedværktøjslinjen til at vælge de hypointense-områder, der repræsenterer den super paramagnetiske jernoxid mærket mesenkymale stamceller og klik acceptere. De segmenterede områder vises i samme farve som den aktive etiket, der er tildelt det pågældende segment. Når alle skiverne er blevet segmenteret, skal du bruge skalpelværktøjet til at udvikle et 3D-kort over de segmenterede områder for at repræsentere mesenkymal stamcellefordelingen i hele hjernen.Hvis du vil udføre en kvantitativ analyse af volumen- og intensitetsforstÃ ̧ et af de segmenterede hypointense-områder, der repræsenterer de markerede celler, skal du klikke på segmentering og vælge volumen og statistik. 24 timer efter intranasal levering, super paramagnetisk jernoxid mærket mesenkymale stamceller påvises som stærke hypointense områder mediale til kortikale skade på T2 stjerne vægtede billeder, der angiver den målrettede migration af super paramagnetisk jernoxid til skade site. Denne migrering forbliver synlig op til 14 dage efter levering uden nogen mærkbar reduktion i signalet.Tilskadekomne dyr behandlet med PBS udviser ikke hypointense-områder på noget tidspunkt, hvilket indikerer, at de observerede hypointense-områder svarer til de superparamagnetiske jernoxidmærkede mesenkymale stamceller og ikke skyldes signalartefakter. Bio-distribution af de mærkede mesenkymale stamceller kan visualiseres ved hjælp af 3D rekonstruktion, histologisk af preussiske blå farvning, eller ved florescence påvisning af FITC mærkede super paramagnetisk jernoxid i mærket mesenkymale stamceller. Sørg for at validere MR-resultaterne med estologi eller andre metoder.Som super magnetisk jernoxid partikler kan forblive i væv efter cellen dør, fører til falske positive signaler. Efter denne procedure, mulige temperale ikke-invasiv sporing i kvantificering kan anvendes til at besvare spørgsmål vedrørende honing evner og fastholdelse af mesenkymale stamceller i hjernen. Efter denne udvikling, denne teknik har banet vejen for forskere inden for regenerativ medicin til at udforske metoder til at forbedre celle honing til specifikke områder af hjernen.

Research

JoVE Journal

Medicine

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

MR-guided Forstyrrelse af blod-hjerne barrieren ved hjælp af Transcranial fokuseret ultralyd i en rottemodel

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MR for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stræk i Brain mikrovaskulære endotelceller (cEND) som et<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisk Hjerneskade Model af blod-hjerne barrieren

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Kontrolleret Cortical Impact Model for Traumatisk Hjerneskade

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

A Novel Model af Mild traumatisk hjerneskade for unge rotter

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Musemodel af lårarterien Wire Skade med implantation af en Perivaskulær Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In vivo-billeddannelse og sporing af technetium-99m-mærkede Bone Marrow mesenchymale stamceller i Equine tendinopati

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studere i bugspytkirtlen Kræft stamceller Karakteristik for udvikling af nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

En vævsforskydningsbaseret kontusiv rygmarvsskadesmodel i mus

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

En musemodel af enkelt og gentagen mild traumatisk hjerneskade

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...