Name: tracking superparamagnetic iron oxide-labeled mesenchymal stem cells using mri after intranasal delivery in a traumatic brain injury murine model
Uploaded: 2019-11-21T15:00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le Ministère des subventions du ministère des Sciences et de la Technologie, Taiwan (MOST 104-2923-B-038-004 -MY2, MOST 107-2314-B-038-063, et MOST 107-2314-B-038-042) et Taipei Medical University (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400, DP2-107-21121-01-N-05 et DP2-108-21121-01-N-05-01).

Toutes les procédures impliquant des animaux dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux, avec l'approbation du Comité d'éthique de l'utilisation des animaux à l'Université médicale de Taipei (approbation no. BAC-2018-0574; 15.03.2019).
1. Étiquetage des MSC avec des nanoparticules SPIO
<ol><li>Pour étiqueter les MSC avec SPIO, ajouter 6 ml de milieu x d'étiquetage (25 g/mL de SPIO dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco [DMEM] sans sérum bovin fœtal [FBS]) à un flacon T75 contenant des MSC (80 % de confluence).</li>
	<li>
Incuber les cellules avec le support d'étiquetage dans un incubateur de CO2 (37 oC, 5 % CO2) sans trembler. Après 24 h, retirer délicatement le support d'étiquetage à l'aide d'une pipette stérile Pasteur avec une pointe en plastique fixée à un vide. Laver les cellules monocouches 2x avec 6 ml de phosphate tamponné saline (PBS) pour enlever toute trace de SPIO non internalisé.
	<ol>
<li>Pour déterminer si les cellules ont été étiquetées avec succès, vérifiez les cellules étiquetées sous un microscope fluorescent ou un microscope confocal si le SPIO est étiqueté avec un fluorophore (c.-à-d., comme ceux utilisés ici; Figure 1B,C). Alternativement, effectuer la coloration bleue prussienne pour les cellules (voir les étapes 6.2-6.4 pour le protocole de coloration).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Récoltez les cellules adhérentes par traitement avec 3 ml de trypsine et incuber à 37 oC. Après 5 min d'incubation, ajouter 7 ml de supports DMEM préréchauffés avec 10% FBS (v/v) pour inactiver la trypsine. Recueillir la suspension cellulaire à l'aide d'une pipette dans un tube conique de 15 ml.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min. Jetez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans PBS. Comptez les cellules viables à l'aide de colorant bleu trypan et d'un hémocytomètre. REMARQUE: La pastille cellulaire des cellules étiquetées apparaîtra comme une couleur foncée en raison de la charge de fer (Figure 1D). Ce protocole est pertinent pour l'étiquetage MSC et l'imagerie par IRM. La procédure d'étiquetage MSC6 a déjà été optimisée, et seules les étapes pour préparer les MSC étiquetés pour suivre in vivo sont incluses ici, puisque le suivi in vivo est au centre. Le protocole de culture et d'étiquetage d'autres types de cellules devrait être optimisé par le chercheur.</li>
	<li>Ajuster la concentration cellulaire à l'aide de PBS à 150 000 cellules (ou un nombre qui donne un signal d'IRM suffisant) dans 18 L de PBS (ou le volume total qui sera utilisé dans la procédure de livraison intranasale). REMARQUE: On l'a remarqué qu'une concentration cellulaire supérieure à 150 000 cellules/18 L de PBS conduit à l'agrégation cellulaire, ce qui peut affecter l'efficacité de la livraison intranasale. Si un plus grand nombre de cellules est nécessaire pour la livraison intranasale, augmenter le volume total de suspension cellulaire et augmenter le nombre d'administrations intranasales, comme l'administration intranasale est une procédure non-invasive, et le dosage multiple est possible.</li>
</ol>2. Blessures à l'impact cortical contrôlé (ICC)
REMARQUE: Dans ce protocole, les souris mâles C57 BL/6 (7-8 semaines) ont été maintenues dans un cycle de lumière/obscurité de 12/12 h avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau.
<ol><li>Pour préparer chaque souris aux blessures de l'ICC, administrer le zolazepam (50 mg/kg) et le xylazine (20 mg/kg) cocktail anesthésiant par injection intrapéritone (1 mL/kg). Assurez-vous que la profondeur de l'anesthésie est suffisante par un manque de réponse à l'orteil-pinch. Alternativement, placez la souris dans une chambre fournie avec 2%-4% isoflurane pour 60 s.
</li>
	<li>Raser la fourrure de la surface dorsale du crâne entre les oreilles à l'aide d'une tondeuse à cheveux électronique. Nettoyez la zone rasée plusieurs fois à l'aide d'un coton-tige stérile imbibé d'iode. Utilisez un coton-tige imbibé d'éthanol à 70 % pour nettoyer l'iode.</li>
	<li>Placez la souris anesthésié dans le cadre stéréotaxique et fixez la souris à l'aide de barres d'oreilles et de barres nasales. Faire une incision midsagittal (environ 2,5 cm) dans la peau rasée à l'aide de ciseaux stériles pour accéder à la surface du crâne.</li>
	<li>Enlever le tissu sur l'os à l'aide d'un tampon de coton pour exposer le crâne. Nettoyez la surface du crâne à l'aide d'un coton-tige imbibé de 3 % De2O2 pour 10 s, puis nettoyez-le à l'aide d'un tampon de coton sec. REMARQUE: Les sutures du crâne et le bregma et le lambda peuvent maintenant être facilement identifiés.</li>
	<li>Identifiez les coordonnées de choix sur la surface du crâne pour la blessure de l'ICC et dessinez un cercle (4 mm de diamètre) autour des coordonnées à l'aide d'un crayon ou d'un marqueur approprié. REMARQUE: Dans ce protocole, les coordonnées à l'antiéroposterior (AP) -2.0 mm et médiolatérale (ML) -1,5 mm ont été utilisées pour l'induction de l'ICC.</li>
	<li>Utilisez un microdrill et une bavure ronde (0,5 mm de diamètre) pour éclaircir le crâne au cercle marqué. Évitez d'appliquer de la pression pendant le forage, car le forage à travers l'os peut causer des dommages au parenchyme cérébral. Nettoyez la poussière osseuse à l'aide d'un coton-tige propre et sec.</li>
	<li>Retirez délicatement le lambeau osseux à l'aide de forceps fins stériles pour exposer le dura mater tout en le gardant intact. Retirez la souris du cadre stéréotaxique utilisé pour la préparation avant la blessure et placez-la dans le cadre stéréotaxique de l'appareil CCI.</li>
	<li>Stabiliser la tête de la souris à l'aide des barres d'oreilles et des barres nasales. Assurez-vous que la tête de la souris est de niveau dans la direction rostrale-caudale et ajustez les barres nasales, si nécessaire.</li>
	<li>Suivez les instructions sur la boîte de contrôle pour zéro la pointe de l'impacteur à la surface corticale exposée. Assurez-vous que la pointe de l'impacteur est alignée directement au-dessus des coordonnées du cortex désiré pour être impactée à l'aide des roues de commande X et Y sur la base de l'impacteur.</li>
	<li>Définiz les paramètres de l'expérience à l'aide de la boîte de commande avec une vitesse de 5 m/s, un temps d'occupation de 250 ms et une profondeur de blessure de 1 mm pour induire des blessures légères chez la souris.</li>
	<li>Induire une blessure en appuyant sur le bouton ' impact' sur la boîte de commande. Écouvillonner tout saignement qui se produit à l'aide d'un coton-tige stérile.</li>
	<li>Retirez la souris du cadre stéréotaxique et fermez l'incision à l'aide de sutures chirurgicales en soie. N'utilisez pas de pinces métalliques pour fermer le site chirurgical, puisque la souris sera soumise à un champ magnétique pour l'IRM.</li>
	<li>Appliquer des antibiotiques topiques (neomycine bacitracin) sur le site chirurgical pour prévenir les infections. Gardez la souris sur le coussin chauffant et surveillez-la de près pendant la phase de récupération.</li>
	<li>Administrer le kétoprofène (2,5 mg/kg, IP) quotidiennement pendant 3 jours après la chirurgie, à moins que l'administration de kétoprofène ne soit contredite avec les objectifs de l'étude.</li>
</ol>3. Livraison intranasale
<ol><li>À l'induction post-CCI d'un jour, administrer le zolazepam (50 mg/kg) et le cocktail d'anesthésie de xylazine (20 mg/kg) par injection i.p. Assurez-vous que la souris est profondément anesthésié par le manque de réponse à l'orteil-pinch.</li>
	<li>
Préparer la souris pour l'accouchement intranasal de MSCs par traitement hyaluronidase.
	<ol>
<li>Prenez les éraflures de la souris et tournez fermement sur le dos tout en immobilisant le crâne. Placez la pointe d'une pipette qui contient de l'hyaluronidase dans le PBS stérile (4 U/L) près de la narine de la souris à un angle de 45 degrés.</li>
		<li>Administrer 3 llde de suspension hyaluronidase dans chaque narine. Maintenez la souris immobilisée et orientée vers le haut sur un tampon propre pendant 5 min. Répétez le traitement hyaluronidase 4x (total de 100 U suspension hyaluronidase).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après le traitement à l'hyaluronidase, gardez la souris traitée sur un coussinet propre vers le haut pendant 30 min.</li>
	<li>Pour délivrer des MSC dans le cerveau, maintenez la souris fermement, comme décrit à l'étape 3.2.1. Administrer 3 l/narine de suspension MSC avec un intervalle de 3 s. Continuez à maintenir la souris dans la même position pendant 30 s jusqu'à ce que les gouttes d'échantillon aient complètement disparu. REMARQUE: Évitez de former des bulles d'air pendant l'administration.</li>
	<li>Répétez l'administration avec un intervalle de 2 min jusqu'à 3x. REMARQUE: Le nombre total de cellules à livrer est de 150 000, de sorte que 18 l de la suspension cellulaire peuvent être livrées à une dose de 3 l pour chaque narine, 3x chacune.</li>
	<li>Remettre la souris dans sa cage et la surveiller de près jusqu'à ce qu'elle se rétablisse complètement de l'anesthésie.</li>
</ol>4. Imagerie par résonance magnétique in Vivo
REMARQUE: La coloration histologique du tissu cérébral a été précédemment employée pour confirmer la livraison réussie des cellules souches après administration intranasale. Cependant, cette méthode ne peut être utilisée que comme point de terminaison d'une étude, et non pas longitudinalement. L'utilisation de sondes IRM pour étiqueter les cellules souches thérapeutiques permettra un suivi in vivo longitudinal des cellules à l'aide de l'IRM. Fait important, ce protocole réduit efficacement le nombre d'animaux requis. Dans ce protocole, la balayage de MRI a été exécutée aux jours 1, 7, et 14 post-livraison des MSCs.
<ol><li>Pour préparer la souris à l'IRM, anesthésiez la souris à l'isoflurane (5% d'isoflurane en 1 L/min d'O2 pour l'induction, 1,5% à 2% d'isoflurane pour l'entretien). Effectuer un pincement d'orteil pour s'assurer que la souris atteint le niveau d'anesthésie requis.</li>
	<li>Placez la souris sur le support d'imagerie et fixez sa position à l'aide de robinets ou de toute autre méthode appropriée. Déplacez le support vers le centre de la bobine IRM (aimant de 7 T/40 cm) et connectez la connexion de surveillance.</li>
	<li>Pour acquérir des scans pondérés en T2 à l'aide d'une séquence spin-écho, définir le temps de répétition (TR) à 1500 ms et le temps d'écho (TE) à 2,8 ms.</li>
	<li>Utilisez un champ de vision de 16 mm x 16 mm (FOV), une matrice d'acquisition de 128 x 128 (MTX) et une épaisseur de tranche de 0,75 x 0,8 mm2 avec quatre moyennes de signal et un angle de bascule de 90 degrés (FA).</li>
	<li>Retirez le support de la souris du centre de bobine d'IRM après avoir terminé les balayages. Remettre la souris dans sa cage et la surveiller de près jusqu'à ce qu'elle se remette complètement de l'anesthésie.</li>
	<li>
Pour suivre et quantifier les MSC étiquetés sur les images pondérées par T2, utilisez le logiciel ITK-SNAP (version 3.8.0)7.
	<ol>
<li>Transférer les données brutes des IRM de l'ordinateur de l'appareil d'IRM à l'ordinateur utilisé pour l'analyse dans un format DICOM (imagerie numérique et communications en médecine).</li>
		<li>Exécutez le logiciel ITK-SNAP et chargez les images IRM en cliquant sur le bouton Fichier. Ensuite, cliquez sur Open Main Image dans le menu. Appuyez sur le bouton Image ouverte dans la fenêtre d'affichage, puis localisez et ouvrez les images IRM à l'aide du bouton Parcourir. REMARQUE: La visualisation des cellules étiquetées dans les images IRM apparaîtra sous forme de zones hypointenses. Si le contraste d'image doit être ajusté, sélectionnez Outils Contraste d'image.</li>
		<li>Créez des segmentations des zones hypointenses et des lésions ou d'autres parties du cerveau en sélectionnant active Label dans la section étiquettes de segmentation. Utilisez différentes couleurs d'étiquette s'il y a différents segments (si la segmentation de plus d'une partie est nécessaire).</li>
		<li>Utilisez l'outil Polygon dans la barre d'outils principale pour dessiner autour des zones hypointenses représentant les MSC étiquetés SPIO. Select Accept, situé en dessous de l'image IRM. Les zones segmentées apparaîtront comme la même couleur de l'étiquette active assignée à ce segment particulier. Répétez cette étape de segmentation pour toutes les tranches d'IRM.</li>
		<li>Développer une carte 3D des zones segmentées pour représenter la distribution MSC dans l'ensemble du cerveau en sélectionnant l'outil Scalpel au bas de la barre d'outils 3D, situé dans la section Étiquettes de segmentation au bas de la boîte à outils TheITK-SNAP. Ensuite, appuyez sur Accepter au bas de la carte 3D créée.</li>
		<li>Pour effectuer une analyse quantitative (volume et intensité moyenne) des zones hypointenses segmentées représentant les cellules étiquetées, appuyez sur le bouton segmentation dans le panneau supérieur et sélectionnez Volume et Statistiques.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Fixation du cerveau de la souris et cryosectioning
<ol><li>
Pour fixer le cerveau de souris, effectuer la perfusion transcardiaque avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) après la dernière IRM, comme précédemment décrit8.
	<ol>
<li>Décapiter la tête et extraire le cerveau8. Fixer le cerveau avec 4% de PFA pendant au moins 48 h à 4 oC.</li>
		<li>Déshydratez le cerveau en l'immergeant dans une solution de saccharose de 30 % à 4 oC jusqu'à ce que le cerveau s'enfonce au fond de la solution.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Intégrer le cerveau dans la solution optimale de température de coupe (OCT) et congeler à -20 oC. Sectionnez le cerveau avec un microtome cryostat en tranches d'une épaisseur de 14 m et montez-les sur des lames. Conserver les diapositives des sections à -20 oC jusqu'à ce qu'elles soient utilisées davantage.</li>
</ol>6. Staining bleu prussien
REMARQUE: La coloration bleue prussienne est couramment utilisée pour détecter la teneur en fer des cellules étiquetées SPIO. Ici, la coloration bleue prussienne est utilisée pour confirmer que les signaux hypointenses dans les images d'IRM correspondent aux MSC étiquetés SPIO et non aux artefacts. La coloration bleue prussienne est l'une des méthodes histochimiques les plus sensibles utilisées pour détecter le fer dans les tissus et peut être utilisée pour identifier ne serait-ce qu'un seul granule de fer dans les cellules.
<ol><li>Laver les diapositives des sections du cerveau avec de l'eau distillée pendant 5 min.</li>
	<li>Effectuer la coloration bleue prussienne en immergeant les diapositives pendant 30 min dans la solution de coloration, qui contient de l'acide chlorhydrique à parts égales (10%) et ferrocyanide de potassium (10%) préparé immédiatement avant utilisation.</li>
	<li>Laver 3x avec de l'eau distillée, pendant 5 min chacun. Counterstain les sections avec le rouge rapide nucléaire pendant 5 min. Rincer les diapositives 2x avec de l'eau distillée.</li>
	<li>Déshydrater les sections graduellement en immergeant les lames dans 95% et 100% d'alcool pendant 2 min chacun. Ajouter le bordereau avec un support de montage résineux.</li>
	<li>Utilisez un microscope léger pour détecter les cellules tachées dans les sections du cerveau. REMARQUE: Le fer dans les cellules étiquetées apparaîtra sous forme de dépôts de couleur bleue.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pelled, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad8/BMP2-engineered+mesenchymal+stem+cells+induce+accelerated+recovery+of+the+biomechanical+properties+of+the+Achilles+tendon.">Smad8/BMP2-engineered mesenchymal stem cells induce accelerated recovery of the biomechanical properties of the Achilles tendon.</a> Journal of Orthopedic Research. 30 (12), 1932-1939 (2012).</li><li>Shahror, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Overexpressing+Fibroblast+Growth+Factor+21+Facilitates+Cognitive+Recovery+and+Enhances+Neurogenesis+in+a+Mouse+Model+of+Traumatic+Brain+Injury.">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 Facilitates Cognitive Recovery and Enhances Neurogenesis in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury.</a> Journal of Neurotrauma. , (2019).</li><li>Danielyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+cells+to+the+brain.">Intranasal delivery of cells to the brain.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (6), 315-324 (2009).</li><li>Karussis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunological+effects+of+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+patients+with+multiple+sclerosis+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Archives in Neurology. 67 (10), 1187-1194 (2010).</li><li>Danielyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells,+macrophages,+and+microglia+to+the+brain+in+mouse+models+of+Alzheimer's+and+Parkinson's+disease.">Intranasal delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, macrophages, and microglia to the brain in mouse models of Alzheimer's and Parkinson's disease.</a> Cell Transplant. 23, 123-139 (2014).</li><li>Shahror, R. A., Ali, A. A. A., Wu, C. C., Chiang, Y. H., Chen, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Homing+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Overexpressing+Fibroblast+Growth+Factor+21+to+Injury+Site+in+a+Mouse+Model+of+Traumatic+Brain+Injury.">Enhanced Homing of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 to Injury Site in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury.</a> International Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li><li>Yushkevich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=User-guided+3D+active+contour+segmentation+of+anatomical+structures:+significantly+improved+efficiency+and+reliability.">User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability.</a> Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+CNS+repair+following+TBI.">Strategies for CNS repair following TBI.</a> Experimental Neurology. 275, 411-426 (2016).</li><li>Ohtaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/progenitor+cells+from+bone+marrow+decrease+neuronal+death+in+global+ischemia+by+modulation+of+inflammatory/immune+responses.">Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14638-14643 (2008).</li><li>Mahmood, A., Lu, D., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+marrow+stromal+cells+(MSCs)+increases+the+expression+of+growth+factors+in+rat+brain+after+traumatic+brain+injury.">Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 21 (1), 33-39 (2004).</li><li>Hoehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+implanted+stem+cell+migration+in+vivo:+a+highly+resolved+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+investigation+of+experimental+stroke+in+rat.">Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16267-16272 (2002).</li><li>Reddy, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+mesenchymal+stem+cells+labeled+with+a+novel+chitosan-coated+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+using+3.0T+MRI.">In vivo tracking of mesenchymal stem cells labeled with a novel chitosan-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles using 3.0T MRI.</a> Journal of Korean Medical Science. 25 (2), 211-219 (2010).</li><li>Roeder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-response+of+superparamagnetic+iron+oxide+labeling+on+mesenchymal+stem+cells+chondrogenic+differentiation:+a+multi-scale+in+vitro+study.">Dose-response of superparamagnetic iron oxide labeling on mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation: a multi-scale in vitro study.</a> PLoS ONE. 9 (5), e98451 (2014).</li><li>Schafer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+human+mesenchymal+stromal+cells+with+superparamagnetic+iron+oxide+leads+to+a+decrease+in+migration+capacity+and+colony+formation+ability.">Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability.</a> Cytotherapy. 11 (1), 68-78 (2009).</li><li>Kostura, L., Kraitchman, D. L., Mackay, A. M., Pittenger, M. F., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feridex+labeling+of+mesenchymal+stem+cells+inhibits+chondrogenesis+but+not+adipogenesis+or+osteogenesis.">Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis.</a> NMR in Biomedicine. 17 (7), 513-517 (2004).</li></ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le protocole décrit ici représente les procédures générales pour l'étiquetage SPIO des MSC et le suivi PAR IRM des MSC étiquetés SPIO après l'accouchement intranasal. Le protocole permet d'étudier la migration et la biodistribution des MSC après la livraison in vivo dans le cerveau, en utilisant une méthode non invasive.
Les MSC sont des candidats attrayants pour les thérapies à base de cellules souches pour les troubles et les blessures du SNC en raison de leur capacité à sécréter des facteurs trophiques qui 1) déclenchent des processus neuroréparateurs et 2) fournissent une neuroprotection, en raison de leurs effets anti-inflammatoires dans la zone des blessures9,10,11,12. Bien que le suivi et la détection à long terme par IRM des MSC étiquetés SPIO puissent être limités en raison de la dilution du SPIO intercellulaire avec division cellulaire, les cellules étiquetées peuvent être détectées pendant plusieurs semaines après la transplantation dans le cerveau des modèles animaux13.
Le protocole d'étiquetage des MSC avec des nanoparticules SPIO recouvertes de dextran sans agents de transfection est également décrit ici. D'autres protocoles ont été utilisés dans la littérature14,15,16. Cependant, dans tous les cas, ces protocoles devraient être ajustés pour le type de cellule, la taille de SPIO, le temps d'incubation, et la concentration de SPIO. Il a été démontré que les MSC avaient un potentiel de différenciation chondrogénique altéré, mais non une différenciation adipogénique sur l'étiquetage SPIO17. Par conséquent, il est fortement recommandé que les tests de différenciation soient effectués avant la livraison des cellules souches afin d'évaluer l'influence de SPIO sur la puissance de différenciation des cellules souches. Dans une étude précédente, il a été démontré que l'étiquetage MSC avec le même type de SPIO et la concentration utilisée dans l'ici n'a pas affecté la puissance de différenciation ostéogénique ou adipogénique de MSCs6.
La voie intranasale de la livraison thérapeutique de cellules souches pour des désordres et des dommages de cerveau est une approche prometteuse pour l'application clinique des cellules souches. Cependant, les mécanismes intrinsèques et moléculaires qui dictent les comportements des cellules souches dans la cavité nasale restent flous. Bien que la voie intranasale soit largement explorée pour la livraison de petites molécules, la taille et le comportement de biodistribution de la tige thérapeutique diffèrent des petites molécules. Le protocole actuel démontre que les SSM ont tendance à migrer vers le site des blessures après l'accouchement intranasal.
Ici, des images pondérées en T2 ont été utilisées pour suivre les MSC étiquetés SPIO. D'autres rapports ont utilisé l'imagerie par écho de gradient. Cependant, les artefacts de susceptibilité sont souvent observés dans l'imagerie d'écho de gradient due au SPIO intercellulaire. Dans le protocole actuel, l'emplacement des zones hypointenses représentant les MSC étiquetés SPIO sur les images pondérées en T2 était le même que celui de l'OIP dans les sections cérébrales détectées par l'examen histologique(figure 3). Cela indique la sensibilité adéquate de l'imagerie par écho de spin pondérée par T2 pour le suivi MSC étiqueté SPIO dans le cerveau.
En résumé, le protocole décrit est bénéfique pour les études in vivo de suivi des cellules souches des lésions cérébrales et des troubles. Le suivi longitudinal des cellules souches in vivo a traditionnellement été effectué en sacrifiant des animaux à plusieurs moments. Le protocole actuel fournit une approche non invasive et efficace pour l'administration et le suivi des SSM, ce qui représente une procédure potentielle pour la thérapie à base de cellules souches pour les lésions cérébrales et les troubles dans les milieux cliniques.

Les cellules souches mésenchymales (MSC) sont des candidats attrayants pour les thérapies à base de cellules souches dans les traitements des troubles du système nerveux central (SNC) et des blessures chez l'homme. En outre, les MSC ont été utilisés comme un véhicule pour la livraison de protéines thérapeutiques sur les sites de blessures1,2. Au cours des dernières années, des innovations prometteuses ont été développées pour établir 1) de nouvelles voies d'administration cellulaire et 2) le suivi cellulaire pour les thérapies à base de cellules souches des troubles du SNC. La livraison intranasale des cellules souches dans le cerveau dépend de la capacité des cellules à contourner la plaque cribriforme et entrer dans l'ampoule olfactive partiellement par une voie parenchymale3. La combinaison de la livraison intranasale et de l'étiquetage des MSC avec des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnetic (SPIO) représente une approche prometteuse pour les applications cliniques des MSC dans le traitement des troubles de la SNC, puisque les nanoparticules SPIO sont des sondes sûres pour l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et permettent le suivi longitudinal sensible non invasif des MSC après la livraison par IRM3,4,5. En outre, la livraison intranasale est une voie sûre et non-invasive qui permet l'administration répétée dans un court laps de temps.
Cet article décrit une technique très sensible et non-invasive pour suivre MSCs in vivo post-intranasal delivery dans un modèle de souris de lésions cérébrales traumatiques (TBI), qui emploie des cellules étiquetées SPIO et MRI. Un avantage important de l'étiquetage SPIO est la détection sensible de SPIO dans les tissus par IRM, ce qui permet de suivre les cellules efficacement et non-invasivement. Les nanoparticules SPIO utilisées ici sont disponibles dans le commerce et étiquetées avec un fluorophophore isothiocyanate (FITC) de fluoréiocyanate (FITC), qui permet la détection de SPIO dans les tissus sans immunostaining ou traitement supplémentaire. En outre, il est possible d'effectuer un suivi longitudinal en temps réel et d'étudier la biodistribution des SDC livrés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Cell culture supplies (Plastics)</td>
			<td style="width:197px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">Varies</td>
			<td style="width:171px;">Replaceable with any source</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Disposable Microtome Blade</td>
			<td style="width:197px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">95057-832</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">10565-018</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:181px;">Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.)</td>
			<td style="width:197px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:179px;">4583</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">12662-029</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Fluorescence Wild Field Microscope</td>
			<td style="width:197px;">Olympus</td>
			<td style="width:179px;">Olympus BX43</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Forcept</td>
			<td style="width:197px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:179px;">11293-00</td>
			<td style="width:171px;">Surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">15710-064</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Hair clipper</td>
			<td style="width:197px;">Pet Club</td>
			<td style="width:179px;">PC-400</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Head Trauma Contusion device</td>
			<td style="width:197px;">Precision Systems and Instrumentation</td>
			<td>Model TBI-0310</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td style="width:197px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:179px;">H3506</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:181px;">ITK-SNAP Software</td>
			<td style="width:197px;">Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah</td>
			<td>ITK-SNAP 3.8.0</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Ketamine (Ketavet)</td>
			<td style="width:197px;">Pfizer</td>
			<td style="width:179px;">778-551</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Mice</td>
			<td style="width:197px;">National Laboratory Animal Center, Taiwan</td>
			<td style="width:179px;">C57BL6</td>
			<td style="width:171px;">Wild type mice strain used in the study</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:181px;">Microdrill</td>
			<td style="width:197px;">Nakanishi</td>
			<td style="width:179px;">NE50</td>
			<td style="width:171px;">Combine with Burrs for generating the bone window</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Microtome</td>
			<td style="width:197px;">Leica</td>
			<td style="width:179px;">RM2265</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">S1502-100</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">MRI scanner</td>
			<td style="width:197px;">Bruker Biospec</td>
			<td></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td style="width:197px;">Corning Cellgro/ThermoFisher</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Povidone-iodine 7.5%</td>
			<td style="width:197px;">Purdue product L.P.</td>
			<td></td>
			<td style="width:171px;">Surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Prussian Blue Stain</td>
			<td style="width:197px;">Abcam</td>
			<td style="width:179px;">ab150674</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Scissor</td>
			<td style="width:197px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:179px;">14084-08</td>
			<td style="width:171px;">Surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Stereotaxic frame</td>
			<td style="width:197px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:179px;">Model 900</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:181px;">Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles</td>
			<td style="width:197px;">BioPAL</td>
			<td style="width:179px;">Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51</td>
			<td style="width:171px;">stem cells labeling for in vivo tracking using MRI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Suture monofilament</td>
			<td style="width:197px;">Ethicon</td>
			<td style="width:179px;">G697</td>
			<td style="width:171px;">Suture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Timer</td>
			<td style="width:197px;">Wisewind</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:171px;">Replaceable with any source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">TrypLE</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">12604-013</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Xylazine (Rompun)</td>
			<td style="width:197px;">Bayer</td>
			<td style="width:179px;">QN05 cm92</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking superparamagnetic iron oxide-labeled mesenchymal stem cells using mri after intranasal delivery in a traumatic brain injury murine model

Les thérapies à base de cellules souches pour les lésions cérébrales, telles que les lésions cérébrales traumatiques (ITC), sont une approche prometteuse pour les essais cliniques. Cependant, les obstacles techniques tels que l'administration et le suivi invasifs de cellules avec l'efficacité peu de transplantation demeurent des défis dans la thérapie translationnelle de tige-basée. Cet article décrit une technique émergente pour l'étiquetage et le suivi des cellules souches basés sur l'étiquetage des cellules souches mésenchymales (MSC) avec des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnetic (SPIO), ainsi que la livraison intranasale des MSC étiquetés. Ces nanoparticules sont de la fluorescéine isothiocyanate (FITC) intégrée et sans danger pour étiqueter les MSC, qui sont ensuite livrés au cerveau des souris induites par TBI par la voie intranasale. Ils sont ensuite suivis in vivo de façon non invasive par imagerie par résonance magnétique en temps réel (IRM). Les avantages importants de cette technique qui combine SPIO pour l'étiquetage cellulaire et la livraison intranasale incluent (1) non-invasif, suivi in vivo de MSC après livraison pendant de longues périodes de suivi, (2) la possibilité de régimes de dosage multiples dus au non-invasif l'itinéraire de la livraison de MSC, et (3) les applications possibles aux humains, en raison de la sûreté de SPIO, nature non envahissante de la méthode de cellule-tracking par MRI, et itinéraire d'administration.

Vingt-quatre heures après la livraison intranasale, les MSC étiquetés SPIO ont été détectés comme des zones hypointenses fortes médiales à la blessure corticale sur les images t2 -weighted (figure 2B), indiquant la migration ciblée de SPIO au site de blessure. Cette migration est demeurée visible jusqu'à 14 jours après la livraison, car les signaux hypointenses se sont avérés visibles sans réduction significative pour cette période(figure 2B). Les animaux blessés traités par PBS n'ont montré aucune zone hypointense, ce qui indique que les zones hypointenses observées correspondent aux MSC étiquetés SPIO et non à signaler les artefacts (Figure 2A) La biodistribution des MSC étiquetés qui ont été observés in vivo avec IRM a été visualisée à l'aide de la reconstruction 3D(figure 2C,D). La migration des MSC vers le cortex blessé a été confirmée histologiquement par la coloration bleue prussienne et la détection du canal FITC du SPIO étiqueté FITC dans les MSC étiquetés(figure 3A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig1.jpg"> Figure 1 : Diagramme schématique du protocole et confirmation in vitro de l'utilisation de SPIO par mSCs. (A) MSCs ont été incubés avec SPIO pendant 24 h pour l'étiquetage. Ensuite, les MSC étiquetés ont été livrés dans un modèle de souris TBI via un itinéraire intranasal (IN). L'IRM à différents moments a été effectuée pour suivre les MSC étiquetés. La confirmation d'un étiquetage suffisant des MSC par SPIO a été obtenue par microscopie à fluorescenceB) et (C) microscopie confocale à l'aide du canal FITC, puisque les nanoparticules SPIO ont été étiquetées avec FITC. (D) La pastille cellulaire des MSC étiquetés semblait de couleur foncée en raison de la charge de fer. FITC - isothiocyanate de fluorescéine; SPIO - particules superparamagnetic d'oxyde de fer; MSCs et cellules souches mésenchymales; IRM et imagerie par résonance magnétique; IN intranasal; TBI - traumatisme crânien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig2.jpg"> Figure 2 : L'IRM en temps réel permet la détection et le suivi de la migration du MSC étiqueté e sPIO vers les sites de blessures dans le cerveau des souris induites par le TBI. (A) Les souris ont été soumises à tBI, suivi d'un traitement avec des MSC étiquetés PBS ou SPIO, administrés par voie intranasale 24 h après des blessures. Les sections coronales des images pondérées en T2 ont montré que les MSC étiquetés étaient une zone hypointense (tête de flèche) sur le bord du site de blessures (zone décrite) à 1, 7 et 14 jours après la livraison. Les souris PBS-traitées ne montrent aucune zone hypointense. (B) Processus de segmentation de la zone du site de blessures (vert) et mSC étiquetés (rouge) à partir d'images coronales T2MD-IRM. (C) reconstruction 3D du traitement du cerveau de la souris basée sur des images pondérées en T2 illustrant la biodistribution des MSC étiquetés SPIO dans le cerveau 14 jours après la livraison. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig3.jpg"> Figure 3 : L'analyse histologique confirme la présence de SSC étiquetés SPIO dans le cerveau des animaux traités. La coloration bleue prussienne des sections de cerveau d'une souris(A) traitée avec PBS (contrôle) et (C) souris traitée avec des MSC SPIO-étiquetés. Les cellules SPIO-positives ont été détectées dans la souris MSC-traitée (cellules boxed, bleue), alors que la souris de commande n'a montré aucune cellules positives au site de blessure dans le cortex à 14 jours après la livraison, confirmant des observations de MRI. L'analyse de microscopie de fluorescence du cortex d'une souris témoin(B) traitée avec PBS et (D) souris traitée avec des MSC SPIO-étiquetés a été effectuée 14 jours après la livraison. L'analyse a révélé la présence de cellules SPIO-positives marquées par le FITC (cellules en boîte, vertes) au cortex blessé dans la souris MSC-traitée, mais aucun signal FITC n'a été observé dans le cortex de la souris PBS-traitée. Barres d'échelle de 50 m, sauf indication contraire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model

Présenté ici est un protocole pour la livraison non-invasive de cellules souches mésenchymales (MSC) et le suivi dans un modèle de souris de lésions cérébrales traumatiques. Les nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnetic sont employées comme sonde d'imagerie par résonance magnétique (IRM) pour l'étiquetage mSC et le suivi in vivo non invasif suivant la livraison intranasale utilisant l'IRM en temps réel.

Suivi des cellules souches mésenchymales étiquetées à l'oxyde de fer superparamagnetic à l'aide de l'IRM après la livraison intranasale dans un modèle de murine traumatique de lésions cérébrales

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical ...

Cette méthode peut aider à déterminer la distribution de base de la cellule souche lobitique après l’accouchement intranasal au cerveau. Le principal avantage de cette technique est que facilite la livraison non invasive et le suivi des cellules souches mésenchymales au cerveau. En outre, les dosages multiples sont possibles pour maximiser les effets thérapeutiques des cellules transplantées au stade chronique après les blessures.Cette technique maximise le nombre de cellules livrées au site de la blessure et minimise la progression de la cellule lobitique dans d’autres tissus. Bien que cette technique donne un aperçu de l’utilisation des cellules souches mésenchymales dans les thérapies traumatiques de lésion cérébrale, elle peut également être employée pour l’investigation des dommages non traumatiques de cerveau. Pour l’étiquetage des cellules souches mésenchymales avec l’oxyde de fer super paramagnetic, ajouter six millilitres d’étiquetage moyen à une culture mésenchymale de cellules souches 80% confluent dans un flacon T 75 pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Le lendemain, aspirez soigneusement le super natant et lavez les cellules deux fois avec six millilitres de PBS par lavage. Pour déterminer si les cellules ont été étiquetées avec succès, vérifiez la culture au microscope florescent. Pour induire une blessure à l’ICC, après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de la pédale, utilisez des tondeuses électroniques pour raser la fourrure de la surface dorsale du crâne et nettoyez la zone rasée à plusieurs reprises avec un coton-tige stérile trempé dans de l’iode.Utilisez un coton-tige trempé dans 70% d’éthanol pour enlever l’iode après le dernier écouvillon et placer l’animal dans un cadre stéréotaxique. Fixez la souris avec les barres d’oreille et de nez et faites une incision midsagittal de 2,5 centimètres dans la peau rasée pour accéder à la surface du crâne. Utilisez un tampon de coton pour enlever le tissu qui recouvre le crâne et nettoyer la surface du crâne pendant 10 secondes avec un coton-tige imbibé de peroxyde d’hydrogène à 3 %.Séchez le crâne avec un tampon de coton frais et utilisez un crayon pour dessiner un cercle de quatre millimètres autour des coordonnées de choix sur l’os exposé. À l’aide d’une micro foreuse équipée d’un bur rond de 0,5 millimètre de diamètre, éclaircissez soigneusement le crâne au cercle marqué sans exercer de pression. Enlevez toute poussière osseuse à l’l’huile de coton propre et sèche et utilisez des forceps stériles déposés pour enlever soigneusement le rabat d’os qui en résulte.Lorsque le dura mater a été exposé, transférez la souris dans le cadre stéréotaxique de l’appareil CCI et fixez l’animal avec les barres de l’oreille et du nez de sorte que la tête soit de niveau dans la direction rostrocaudal. Suivant les instructions sur la boîte de commande, zéro la pointe de l’impacteur à la surface corticale exposée à l’aide des roues de commande X et Y sur la base de l’impacteur pour aligner la pointe de l’impacteur directement au-dessus des coordonnées du cortex désirées à impacter. Utilisez la boîte de commande pour définir les paramètres de l’expérience à une vitesse de cinq mètres par seconde, un temps de vie de 250 millisecondes, et une profondeur de blessure d’un millimètre pour induire une blessure légère.Ensuite, appuyez sur le bouton d’impact sur la boîte de commande. Écouvillonner tout saignement qui se produit avec un coton-tige stérile et retirer la souris du cadre. Fermez l’incision avec des sutures chirurgicales en soie et appliquez des antibiotiques topiques sur le site avant de placer la souris sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce qu’elle soit pleine.Un jour après la blessure, traiter l’oxyde de fer super paramagnetic étiqueté culture mésenchymale de cellules souches avec trois millilitres de trypsine. Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, commencer la réaction avec sept millilitres de milieu DMEM préchauffé, complété par 10% sérum bovin fœtal et de recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Sédimenter les cellules par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille dans PBS pour le comptage.Ensuite, ajustez la concentration cellulaire à 1,5 fois 10 aux cinq cellules par 18 microlitres de PBS. Pour l’accouchement cellulaire, après avoir confirmé l’absence de réponse au pincement des orteils, débrailler la souris tout en immobilisant le crâne. Placez la pointe d’une pipette contenant quatre unités d’hyaluronidase par microlitre de PBS près de la nare de la souris à un angle de 45 degrés, et administrez trois microlitres de suspension hyaluronidase dans chaque narine.Placez l’animal face vers le haut sur un tampon propre pendant cinq minutes avant de répéter le traitement quatre fois pour un total de 100 unités de traitement hyaluronidase. Après le dernier traitement, remettre la souris sur le coussin pendant 30 minutes, avant de retenir la souris comme il vient de le démontrer. Une fois la tête immobilisée, administrer trois microlitres de la suspension mésenchymale des cellules souches dans chaque narine sur une période de trois secondes par livraison de solution, en maintenant la souris en position pendant 30 secondes jusqu’à ce que les gouttes de l’échantillon aient complètement disparu.Après deux minutes, répéter l’accouchement jusqu’à trois fois jusqu’à ce que tout le volume de cellules souches mésenchymiques ait été livré. Ensuite, retournez la souris dans sa cage avec surveillance jusqu’à la pleine récumbence. Pour suivre la migration des cellules souches mésenchymales par IRM, placez la souris anesthésiée sur le support d’imagerie de l’imageur MR.Ensuite, fixez l’animal en place et déplacez le support au centre de la bobine d’IRM. Réglez le temps de répétition à 1500 millisecondes et le temps d’écho à 2,8 millisecondes. Ensuite, réglez le champ de vision à 16 par 16 millimètres, la matrice d’acquisition à 128 par 128, et l’épaisseur de la tranche à 0,75 par 0,8 millimètres avec quatre moyennes de signal et un angle de retournement de 90 degrés pour acquérir des scans pondérés T2 étoiles à l’aide d’une séquence d’écho spin.Après avoir terminé les scans, rétractez le porte-souris du centre de bobine d’IRM, et retournez la souris dans sa cage avec surveillance jusqu’à la pleine récumbence. Pour suivre et quantifier les cellules souches mésenchymales étiquetées sur les images pondérées de l’étoile T2, ouvrez les données du logiciel de prise de cas informatique et sélectionnez l’étiquette active. Pour créer des segmentations des zones hypointense et la lésion ou d’autres parties du cerveau d’intérêt, en utilisant différentes couleurs d’étiquette pour chaque segment.Utilisez l’outil polygone dans la barre d’outils principale pour sélectionner les zones hypointense qui représentent l’oxyde de fer super paramagnetic étiqueté cellules souches mésenchymales et cliquez sur accepter. Les zones segmentées apparaîtront dans la même couleur que l’étiquette active attribuée à ce segment particulier. Lorsque toutes les tranches ont été segmentées, utilisez l’outil scalpel pour développer une carte 3D des zones segmentées pour représenter la distribution des cellules souches mésenchymales dans l’ensemble du cerveau.Effectuer une analyse quantitative de la moyenne de volume et d’intensité des zones hypointense segmentées représentant les cellules étiquetées, cliquez sur segmentation et sélectionnez le volume et les statistiques. 24 heures après la livraison intranasale, l’oxyde de fer super paramagnetic étiqueté cellules souches mésenchymales sont détectés comme zones hypointense forte médial à la lésion corticale sur les images pondérées étoiles T2, indiquant la migration ciblée de l’oxyde de fer super paramagnetic au site de blessure. Cette migration reste visible jusqu’à 14 jours après la livraison sans aucune réduction notable du signal.Les animaux blessés traités par PBS n’présentent pas de zones hypointense à aucun moment, ce qui indique que les zones hypointense observées correspondent aux super oxydes de fer paramagnetiques étiquetés cellules souches mésenchymales, et ne sont pas dues à des artefacts de signal. La bio-distribution des cellules souches mésenchymales étiquetées peut être visualisée à l’aide de la reconstruction 3D, histologiquement par coloration bleue prussienne, ou par détection de florescence de l’oxyde de fer super paramagnetic marqué FITC dans les cellules souches mésenchymales étiquetées. Assurez-vous de valider les résultats de l’IRM avec de l’esthologie ou d’autres méthodes.Comme les particules d’oxyde de fer super magnétique peuvent rester dans les tissus après la mort de la cellule, conduisant à de faux signaux positifs. À la suite de cette procédure, un suivi non invasif possible de la quantification peut être appliqué pour répondre aux questions concernant l’affûtage des capacités et la rétention des cellules souches mésenchymales dans le cerveau. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie pour les chercheurs dans le domaine de la médecine régénérative à explorer des méthodes pour améliorer le perfectionnement cellulaire à des zones spécifiques du cerveau.

Research

JoVE Journal

Medicine

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Guidée par IRM rupture de la barrière hémato-encéphalique en utilisant transcrânienne d&#39;ultrasons focalisés dans un modèle de rat

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Recherche

Médecine

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F IRM pour le suivi cellulaire

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Étirer dans le cerveau cellules endothéliales microvasculaires (CEND) comme<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisme modèle du cerveau de la barrière hémato-encéphalique

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Contrôlée corticale modèle d&#39;impact pour Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

Un modèle Roman de lésions cérébrales traumatiques légères pour les jeunes rats

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Modèle murin de l&#39;artère fémorale fil des blessures à l&#39;implantation d&#39;un périvasculaire Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Imagerie in vivo et le suivi de technétium 99m Étiqueté moelle osseuse Cellules souches mésenchymateuses dans Tendinopathie Hippique

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

Un modèle de lésion de la moelle épinière à base de déplacement tissulaire à base de tissus chez les souris

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

Un modèle de souris de blessures cérébrales traumatiques légères et répétitives légères

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...