Name: tracking superparamagnetic iron oxide-labeled mesenchymal stem cells using mri after intranasal delivery in a traumatic brain injury murine model
Uploaded: 2019-11-21T15:00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model at JoVE.com

Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı hibe, tarafından desteklenmiştir Tayvan (EN FAZLA 104-2923-B-038-004 -MY2, EN 107-2314-B-038-063 ve MOST 107-2314-B-038-042) ve Taipei Tıp Üniversitesi (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-T04, 400 106-5310-001-400, DP2-107-21121-01-N-05 ve DP2-108-21121-01-N-05-01).

Bu protokolde hayvanları içeren tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı, Taipei Tıp Üniversitesi hayvan kullanımı için Etik Komitesi onayı ile (onay no. BAĞ-2018-0574; 15.03.2019).
1. SPIO Nano tanecikleri ile MSC'lerin etiketlemesi
<ol><li>MSC'leri SPIO ile etiketlemek için, 6 mL etiketleme ortamı (Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM'de 25 μg/mL SPIO) fetal sığır serumu olmadan [FBS]) MSC içeren bir T75 şişesine (%80 birleşme) ekleyin.</li>
	<li>
Hücreleri etiketleme ortamıyla bir CO2 kuluçka makinesinde (37 °C, %5 CO2)titremeden kuluçkaya yatırın. 24 saat sonra, vakuma bağlı plastik uçlu steril bir Pasteur pipeti kullanarak etiketleme ortamını nazikçe çıkarın. Hücreleri monolayer 2x 6 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
	<ol>
<li>Hücrelerin başarılı bir şekilde etiketlenip etiketlenmediğini belirlemek için, flüoresan mikroskobu nisbeten veya konfokal mikroskop altında etiketlenmiş hücreleri kontrol edin, SPIO bir florofor la etiketlendi mi (yani, burada kullanılanlar gibi); Şekil 1B,C). Alternatif olarak, hücreler için Prusya mavisi boyama gerçekleştirin (bkz. boyama protokolü için 6.2-6.4 adımlarını).</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 mL tripsin ve 37 °C'de inkübün ile tedavi ile yapışık hücreleri hasat edin. 5 dakika kuluçkadan sonra, trypsinin inaktive etmek için %10 FBS (v/v) ile 7 mL önceden ısıtılmış DMEM ortam ekleyin. 15 mL konik tüp içine bir pipet kullanarak hücre süspansiyon toplayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonuna 300 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı atın ve PBS'deki hücre peletini yeniden askıya alın. Trypan mavi boya ve hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın. NOT: Etiketli hücrelerin hücre peleti demir yüklemesi nedeniyle koyu renk olarak görünür (Şekil 1D). Bu protokol MSC etiketleme ve MRGörüntüleme için geçerlidir. MSC etiketleme 6 yordamıiçin yordam daha önce optimize edilmiş ve in vivo izleme etiketli MSC'ler hazırlamak için sadece adımlar burada yer almaktadır, in vivo izleme odak noktası olduğundan. Diğer hücre türlerinin kültüre alınması ve etiketlemesi için protokol araştırmacı tarafından optimize edilmelidir.</li>
	<li>PBS kullanarak hücre konsantrasyonu 18 μL PBS (veya intranazal doğum prosedüründe kullanılacak toplam hacim) 150.000 hücre (veya yeterli MRG sinyali ile sonuçlanan bir sayı) ayarlayın. NOT: PBS'nin 150.000 hücre/18 μL'den daha yüksek bir hücre konsantrasyonunun hücre agregasyonuna yol açtığı ve intranazal doğumun verimliliğini etkileyebileceği fark edilmiştir. İntranazal doğum için daha fazla sayıda hücre gerekiyorsa, intranazal uygulama non-invaziv bir işlem olduğu için hücre süspansiyonunun toplam hacmini artırın ve intranazal yönetimlerin sayısını artırın ve birden fazla dozlama mümkündür.</li>
</ol>2. Kontrollü Kortikal Etki (CCI) Yaralanması
NOT: Bu protokolde erkek C57 BL/6 fareler (7-8 haftalık) 12/12 h açık/karanlık bir döngü içinde tutuldu ve reklam libitum gıda ve suya erişim sağladı.
<ol><li>CcI yaralanması için her fare hazırlamak için, zolazepam (50 mg / kg) ve ksilazin (20 mg / kg) intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon (1 mL / kg) ile anestezi kokteyl uygulayın. Anestezi derinliğinin, parmak ucuyanıtı eksikliğinden yeterli olduğundan emin olun. Alternatif olarak, 60 s için% 2-4 izofluran ile birlikte bir odaya fareyerleştirin.
</li>
	<li>Elektronik bir saç makası kullanarak kulakların arasındaki kafatasının sırt yüzeyinin kürktıraş. İyotla ıslatılmış steril pamuklu bir bez kullanarak tıraş alanını birkaç kez temizleyin. İyot temizlemek için % 70 etanol batırılmış bir pamuklu bez kullanın.</li>
	<li>Anestezili fareyi stereotaktik çerçeveye yerleştirin ve kulak çubukları ve burun çubuklarını kullanarak fareyi sabittutun. Kafatası yüzeyine erişmek için steril makas kullanarak traş deride bir midsagittal kesi (yaklaşık 2,5 cm) olun.</li>
	<li>Kafatası ortaya çıkarmak için bir pamuk ped kullanarak kemik doku çıkarın. Kafatası yüzeyini %3 H2O2'ye batırılmış bir pamuk lu bez kullanarak 10 s'ye temizleyin, ardından kuru bir pamuk pedle temizleyin. NOT: Kafatası dikişleri ve hem bregma ve lambda artık kolayca tespit edilebilir.</li>
	<li>CCI yaralanması için kafatası yüzeyinde tercih edilen koordinatları belirleyin ve bir kalem veya uygun marker kullanarak koordinatların etrafına bir daire (4 mm çapında) çizin. NOT: Bu protokolde CCI indüksiyonu için anteeroposterior (AP) -2.0 mm ve mediolateral (ML) +1.5 mm koordinatları kullanıldı.</li>
	<li>İşaretli dairedeki kafatasını inceltmek için mikro matkap ve yuvarlak çapak (0,5 mm çapında) kullanın. Delme sırasında basınç uygulamaktan kaçının, kemik yoluyla delme beyin parankim hasara neden olabilir gibi. Temiz ve kuru pamuklu bir bez kullanarak kemik tozunu temizleyin.</li>
	<li>Dura mater'i sağlam tutarken ortaya çıkarmak için steril ince terlikler kullanarak kemik kapağını hafifçe çıkarın. Fareyi yaralanma öncesi hazırlık için kullanılan stereotaktik çerçeveden çıkarın ve CCI aygıtının stereotaktik çerçevesine yerleştirin.</li>
	<li>Kulak çubuklarını ve burun çubuklarını kullanarak farenin başını stabilize edin. Farenin başının rostral-kaudal yönde düz olduğundan emin olun ve gerekirse burun çubuklarını ayarlayın.</li>
	<li>Kontrol kutusundaki talimatları uygulayın ve darbe ucunu açık kortikal yüzeye sıfırlayın. Darbeci ucun, darbecinin tabanındaki X ve Y kontrol tekerlekleri kullanılarak etkilenecek istenilen korteks koordinatlarının hemen üzerinde hizalandığından emin olun.</li>
	<li>Farede hafif yaralanmalara neden olmak için kontrol kutusunu 5 m/s hız, 250 ms çalışma süresi ve 1 mm yaralanma derinliği ile deneme parametrelerini ayarlayın.</li>
	<li>Kontrol kutusundaki ''impact'' düğmesine basarak yaralanmaya neden olun. Steril pamuklu bir bez kullanılarak oluşan herhangi bir kanamayı temizle.</li>
	<li>Fareyi stereotaktik çerçeveden çıkarın ve ipek cerrahi dikişleri kullanarak kesikapatın. Fare MRI için manyetik alana maruz kalacağı için cerrahi alanı kapatmak için metal klipsler kullanmayın.</li>
	<li>Enfeksiyonları önlemek için topikal antibiyotikler (bacitracin neomisin) cerrahi bölgeye uygulayın. Fareyi ısıtma yastığında tutun ve kurtarma aşamasında yakından izleyin.</li>
	<li>Ketoprofen uygulaması çalışma hedefleri ile çelişmediği sürece, ameliyattan sonra 3 gün boyunca her gün ketoprofen (2.5 mg/kg, IP) uygulayın.</li>
</ol>3. İntranazal Doğum
<ol><li>CCI sonrası 1 gün indüksiyonda, i.p. enjeksiyonu ile zolazepam (50 mg/kg) ve ksilazin (20 mg/kg) anestezi kokteylini uygulayın. Farenin, parmak kıstırma yanıtı eksikliği nden derinden anestezi yaptığından emin olun.</li>
	<li>
Hyaluronidaz tedavisi ile MSCs intranazal teslim için fare hazırlayın.
	<ol>
<li>Farenin scruff kapmak ve kafatası hareketsiz iken sıkıca sırtını açın. Steril PBS'de hyaluronidaz içeren bir pipetin ucunu farenin burun deliğini 45° açıyla yakınına yerleştirin.</li>
		<li>Her burun deliğinde 3 μL hyaluronidase süspansiyon uygulayın. Fareyi hareketsiz ve 5 dakika boyunca temiz bir ped üzerinde yukarı bakacak şekilde tutun. Hyaluronidaz tedavisini 4x (toplam 100 U hyaluronidase süspansiyonu) tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hyaluronidase tedavisinden sonra, tedavi edilen fareyi 30 dk kadar bakan temiz bir ped üzerinde tutun.</li>
	<li>MSC'leri beyne teslim etmek için fareyi adım 3.2.1'de açıklandığı gibi sıkıca tutun. 3 s aralıklı 3 μL/burun deliği MSC süspansiyonuyguluyor. Örnek damlatamamen kaybolana kadar fareyi 30 s boyunca aynı pozisyonda tutun. NOT: Uygulama sırasında hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.</li>
	<li>3x'e kadar 2 dk arayla yönetimi tekrarlayın. NOT: Teslim edilecek toplam hücre sayısı 150.000'dir, böylece hücre süspansiyonunun 18 μL'si her burun deliği için 3 μL dozda, her biri 3 kat daha fazla dozda teslim edilebilir.</li>
	<li>Fareyi kafesine geri döndürün ve anesteziden tamamen iyileşene kadar yakından izleyin.</li>
</ol>4. In Vivo Manyetik Rezonans Görüntüleme
NOT: Beyin dokusunun histolojik boyama daha önce intranazal uygulama dan sonra kök hücrelerin başarılı doğum onaylamak için kullanılmıştır. Ancak, bu yöntem sadece bir çalışmanın bitiş noktası olarak kullanılabilir, longitudinally değil. Terapötik kök hücreleri etiketlemek için MRG probları kullanmak, MRG kullanarak hücrelerin uzunlamasına, non-invaziv, in vivo takibine olanak sağlayacaktır. Daha da önemlisi, bu protokol gerekli hayvan sayısını etkin bir şekilde azaltır. Bu protokolde, MSC'lerin 1, 7 ve 14'ü doğum sonrası 1, 7 ve 14'te MRG taraması yapıldı.
<ol><li>Fareyi MRG taraması için hazırlamak için fareyi izoflurane ile anestezi edin (indüksiyon için 1 L/dk O2'de %5 izofluran, bakım için %1,5-2 izofluran). Farenin gerekli anestezi düzeyine ulaştığından emin olmak için bir parmak ucutu yapın.</li>
	<li>Fareyi görüntüleme tutucunun üzerine yerleştirin ve musluklar veya başka bir uygun yöntem kullanarak konumunu sabittutun. Tutucuyu MR bobininin (7 T/40 cm mıknatıs) merkezine taşıyın ve izleme bağlantısını bağlayın.</li>
	<li>Spin-echo dizisi kullanarak T2*ağırlıklı taramalar elde etmek için tekrarlama süresini (TR) 1500 ms'e, yankı süresini (TE) 2,8 ms'e ayarlayın.</li>
	<li>16 mm x 16 mm görüş alanı (FOV), 128 x 128 satın alma matrisi (MTX) ve dilim kalınlığını dört sinyal ortalaması ve 90° çevirme açısı (FA) ile 0,75 x 0,8 mm2 kullanın.</li>
	<li>Taramaları tamamladıktan sonra fare tutucuyu MRBobin merkezinden geri çekin. Fareyi kafesine geri döndürün ve anesteziden tamamen iyileşene kadar yakından izleyin.</li>
	<li>
T2*ağırlıklı görüntülerde etiketli MSC'leri izlemek ve ölçmek için ITK-SNAP yazılımını (sürüm 3.8.0)7kullanın.
	<ol>
<li>MRI taramasının ham verilerini MRI makinesinin bilgisayarından DICOM (tıpta dijital görüntüleme ve iletişim) formatında analiz için kullanılan bilgisayara aktarın.</li>
		<li>ITK-SNAP yazılımını çalıştırın ve Dosya düğmesine tıklayarak MR görüntülerini yükleyin. Ardından menüde Ana Resmi Aç'a tıklayın. Ekran penceresindeki Resmi Aç düğmesine basın ve Gözat düğmesini kullanarak MR görüntülerini bulun ve açın. NOT: MR görüntülerinde etiketli hücrelerin görselleştirilmesi hipoyoğun alanlar olarak görünecektir. Görüntü kontrastı ayarlanması gerekiyorsa, Araçlar | Görüntü Kontrastı.</li>
		<li>Segmentasyon etiketleri bölümünde Active Label'ı seçerek hipoyoğun alanların ve lezyonun veya diğer beyin parçalarının segmentasyonlarını oluşturun. Farklı segmentler için farklı etiket renkleri kullanın (birden fazla parçanın segmentasyonu gerekiyorsa).</li>
		<li>SPIO etiketli MSC'leri temsil eden hipoyoğun alanların etrafını çizmek için Ana Araç Çubuğu'ndaki Çokgen aracını kullanın. MRI görüntüsünün altında bulunan Kabul Et'iseçin. Parçalı alanlar, belirli bir kesime atanan etkin etiketin aynı rengi olarak görünür. Tüm MR Dilimleri için bu segmentasyon adımLarını tekrarlayın.</li>
		<li>ITK-SNAP araç kutusunun altındaki Segmentasyon Etiketleri bölümünde bulunan 3B Araç Çubuğu'nunaltındaki Neşter Aracı'nı seçerek tüm beyindeki MSC dağılımını temsil edecek segmentli alanların 3B haritasını geliştirin. Ardından, oluşturulan 3B haritanın altındaki Kabul et'e basın.</li>
		<li>Etiketli hücreleri temsil eden parçalı hipoyoğun alanların nicel analizini (hacim ve yoğunluk ortalaması) gerçekleştirmek için, üst paneldeki Segmentasyon düğmesine basın ve Birim ve İstatistik'iseçin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Fare Beyninin Fiksasyonu ve Kriyodinasyon
<ol><li>
Fare beynini düzeltmek için, daha önce açıklandığı gibi, son MRI taraması sonrasında% 4 paraformaldehit (PFA) ile transkardiyak perfüzyon gerçekleştirmek8.
	<ol>
<li>Kafasını kes vebeyni8. Beyni 4 °C'de en az 48 saat boyunca %4 PFA ile düzeltin.</li>
		<li>Beyin çözeltinin dibine banına kadar 4 °C'de %30 sakaroz çözeltisine daldırarak beyni kurutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beyni en uygun kesme sıcaklığına (OCT) solüsyonuna gömün ve -20 °C'de donun. 14 μm kalınlığında dilimler halinde bir kriyostat mikrotom ile bölüm beyin ve slaytlar üzerine monte. Bölümleri slaytları daha fazla kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>6. Prusya Mavi boyama
NOT: Prusya mavisi boyama genellikle SPIO etiketli hücrelerde demir içeriğini tespit etmek için kullanılır. Burada, Prusya mavisi boyama, MR Görüntüleri'ndeki hipoyoğun sinyallerin, eserlere değil SPIO etiketli MSC'lere karşılık geldiğini doğrulamak için kullanılır. Prusya mavisi boyama dokularda demir tespit etmek için kullanılan en hassas histokimyasal yöntemlerden biridir ve hücrelerde demir bile tek bir granül tanımlamak için kullanılabilir.
<ol><li>5 dakika boyunca distile su ile beyin bölümleri slaytlar yıkayın.</li>
	<li>Eşit parça hidroklorik asit (%10) içeren boyama çözeltisi, 30 dakika boyunca slaytlar batırarak Prusya mavisi boyama gerçekleştirin ve potasyum ferrosid (%10) kullanıma hemen önce hazırlanır.</li>
	<li>Her biri 5 dakika boyunca 3x distile su ile yıkayın. 5 dakika boyunca nükleer hızlı kırmızı ile karşı lekeler ilerler.</li>
	<li>Slaytları %95 ve %100 alkolle 2'şer dakika ya da %100'e batırarak bölümleri kademeli olarak kurutun. Rekenatli montaj ortamı ile coverslip ekleyin.</li>
	<li>Beyin bölümlerinde lekeli hücreleri tespit etmek için bir ışık mikroskop kullanın. NOT: Etiketli hücrelerdeki demir mavi renkli tortular olarak görünür.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pelled, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad8/BMP2-engineered+mesenchymal+stem+cells+induce+accelerated+recovery+of+the+biomechanical+properties+of+the+Achilles+tendon.">Smad8/BMP2-engineered mesenchymal stem cells induce accelerated recovery of the biomechanical properties of the Achilles tendon.</a> Journal of Orthopedic Research. 30 (12), 1932-1939 (2012).</li><li>Shahror, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Overexpressing+Fibroblast+Growth+Factor+21+Facilitates+Cognitive+Recovery+and+Enhances+Neurogenesis+in+a+Mouse+Model+of+Traumatic+Brain+Injury.">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 Facilitates Cognitive Recovery and Enhances Neurogenesis in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury.</a> Journal of Neurotrauma. , (2019).</li><li>Danielyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+cells+to+the+brain.">Intranasal delivery of cells to the brain.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (6), 315-324 (2009).</li><li>Karussis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunological+effects+of+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+patients+with+multiple+sclerosis+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Archives in Neurology. 67 (10), 1187-1194 (2010).</li><li>Danielyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells,+macrophages,+and+microglia+to+the+brain+in+mouse+models+of+Alzheimer's+and+Parkinson's+disease.">Intranasal delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, macrophages, and microglia to the brain in mouse models of Alzheimer's and Parkinson's disease.</a> Cell Transplant. 23, 123-139 (2014).</li><li>Shahror, R. A., Ali, A. A. A., Wu, C. C., Chiang, Y. H., Chen, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Homing+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Overexpressing+Fibroblast+Growth+Factor+21+to+Injury+Site+in+a+Mouse+Model+of+Traumatic+Brain+Injury.">Enhanced Homing of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 to Injury Site in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury.</a> International Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li><li>Yushkevich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=User-guided+3D+active+contour+segmentation+of+anatomical+structures:+significantly+improved+efficiency+and+reliability.">User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability.</a> Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Li, Y., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+stromal+cell+transplantation+in+stroke+and+traumatic+brain+injury.">Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury.</a> Neuroscience Letters. 456 (3), 120-123 (2009).</li><li>Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+CNS+repair+following+TBI.">Strategies for CNS repair following TBI.</a> Experimental Neurology. 275, 411-426 (2016).</li><li>Ohtaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/progenitor+cells+from+bone+marrow+decrease+neuronal+death+in+global+ischemia+by+modulation+of+inflammatory/immune+responses.">Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14638-14643 (2008).</li><li>Mahmood, A., Lu, D., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+marrow+stromal+cells+(MSCs)+increases+the+expression+of+growth+factors+in+rat+brain+after+traumatic+brain+injury.">Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 21 (1), 33-39 (2004).</li><li>Hoehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+implanted+stem+cell+migration+in+vivo:+a+highly+resolved+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+investigation+of+experimental+stroke+in+rat.">Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16267-16272 (2002).</li><li>Reddy, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+mesenchymal+stem+cells+labeled+with+a+novel+chitosan-coated+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+using+3.0T+MRI.">In vivo tracking of mesenchymal stem cells labeled with a novel chitosan-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles using 3.0T MRI.</a> Journal of Korean Medical Science. 25 (2), 211-219 (2010).</li><li>Roeder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-response+of+superparamagnetic+iron+oxide+labeling+on+mesenchymal+stem+cells+chondrogenic+differentiation:+a+multi-scale+in+vitro+study.">Dose-response of superparamagnetic iron oxide labeling on mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation: a multi-scale in vitro study.</a> PLoS ONE. 9 (5), e98451 (2014).</li><li>Schafer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+human+mesenchymal+stromal+cells+with+superparamagnetic+iron+oxide+leads+to+a+decrease+in+migration+capacity+and+colony+formation+ability.">Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability.</a> Cytotherapy. 11 (1), 68-78 (2009).</li><li>Kostura, L., Kraitchman, D. L., Mackay, A. M., Pittenger, M. F., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feridex+labeling+of+mesenchymal+stem+cells+inhibits+chondrogenesis+but+not+adipogenesis+or+osteogenesis.">Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis.</a> NMR in Biomedicine. 17 (7), 513-517 (2004).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan protokol, MSC'lerin SPIO etiketlemesi ve SPIO etiketli MSC'lerin intranazal sonrası doğumun MRI takibi için genel prosedürleri temsil eder. Protokol, non-invaziv bir yöntem kullanarak beyinde in vivo in-in-in MSC'lerin göç ve biyodağıtım çalışma fırsatı sağlar.
MsCs CNS bozuklukları ve yaralanmalar için kök hücre tabanlı tedaviler için cazip adaylar nedeniyle trofik faktörleri salgılama yeteneği nedeniyle 1) nörorestoratif süreçleri tetiklemek ve 2) nörokoruma sağlamak, yaralanma alanı içinde anti-inflamatuar etkileri nedeniyle9,10,11,12. SPIO etiketli MSC'lerin uzun süreli MRG takibi ve saptanması hücre bölünmesi ile hücreler arası SPIO seyreltilmesi nedeniyle sınırlı olsa da, etiketli hücreler hayvan modellerinin beyinlerinde transplantasyon sonrası birkaç haftaya kadar tespit edilebilir13.
Ayrıca burada transfeksiyon ajanları olmadan dextran ile kaplanmış SPIO nano tanecikleri ile MSCs etiketleme protokolü açıklanmıştır. Diğer protokoller literatürde kullanılmıştır14,15,16. Ancak, her durumda, bu protokoller hücre tipi, SPIO boyutu, kuluçka süresi ve SPIO konsantrasyonu için ayarlanmalıdır. MSC'lerin kondrojenik farklılaşma potansiyelini bozmuş olduğu, ancak SPIO etiketlemesi üzerine adipojenik farklılaşma olmadığı gösterilmiştir17. Bu nedenle SPIO'nun kök hücrelerin farklılaşma gücü üzerindeki etkisini değerlendirmek için kök hücre dağıtımından önce farklılaşma tözlerinin yapılması tavsiye edilir. Bir önceki çalışmada, burada kullanılan aynı SPIO tipi ve konsantrasyonu ile MSC etiketleme mscs osteojenik veya adipojenik farklılaşma potens etkilemediği gösterilmiştir6.
Beyin bozuklukları ve yaralanmalar için terapötik kök hücre tesliminin intranazal yolu kök hücrelerin klinik uygulaması için umut verici bir yaklaşımdır. Ancak, burun boşluğundaki kök hücrelerin davranışlarını belirleyen içsel ve moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. İntranazal yol küçük moleküllerin teslimi için yaygın olarak araştırılsa da, terapötik sapın büyüklüğü ve biyodağılım davranışı küçük moleküllerden farklıdır. Mevcut protokol, MSC'lerin intranazal doğumdan sonra yaralanma bölgesine doğru göç etme eğiliminde olduğunu göstermektedir.
Burada, SPIO etiketli MSC'leri izlemek için T2*ağırlıklı görüntüler kullanılmıştır. Diğer raporlarde degrade yankı görüntüleme kullanılmıştır. Ancak, septiyer SPIO nedeniyle gradyan eko görüntülemede genellikle duyarlılık görülür. Mevcut protokolde, T2*ağırlıklı görüntülerde SPIO etiketli MSC'leri temsil eden hipoyoğun alanların konumu histolojik inceleme ile saptanan beyin kesitlerinde SPIO'nun konumuyla aynıydı(Şekil 3). Bu, beyindeki SPIO etiketli MSC takibi için T2*ağırlıklı spin eko görüntülemenin yeterli hassasiyetini gösterir.
Özetle, açıklanan protokol beyin yaralanmaları ve bozukluklarının in vivo kök hücre takibi çalışmaları için yararlıdır. In vivo kök hücrelerinin uzunlamasına takibi geleneksel olarak hayvanların birden fazla zaman noktasında kurban edilerek gerçekleştirilmiştir. Mevcut protokol, klinik ortamlarda beyin yaralanmaları ve bozuklukları için kök hücre tabanlı tedavi için potansiyel bir prosedürü temsil eden MSC'lerin doğum ve takibi için non-invaziv ve verimli bir yaklaşım sağlamaktadır.

Mezenkimal kök hücreler (MSC) insanlarda merkezi sinir sistemi (CNS) bozuklukları ve yaralanmalarının tedavisinde kök hücre bazlı tedaviler için cazip adaylardır. Ayrıca, MSCs yaralanma sitelerinde terapötik proteinlerin teslimi için bir araç olarak kullanılmıştır1,2. Son yıllarda, cns bozukluklarının kök hücre temelli tedavileri için 1) hücre tesliminin yeni yollarını ve 2) hücre takibini sağlamak için umut verici yenilikler geliştirilmiştir. Kök hücrelerin beyne intranazal olarak verilmesi, hücrelerin kribriform plakayı atlayıp parenkim yolu üzerinden kısmen koku alma ampulüne girme yeteneğine bağlıdır3. Spio nano partikülleri manyetik rezonans görüntüleme (MRG) için güvenli problar olduğundan ve MRI3,4,5tarafından MSC'lerin non-invaziv hassas uzunlamasına izleme izin, intranazal doğum ve süperparamanyetik demir oksit (SPIO) nano tanecikleri ile MSCs etiketleme kombinasyonu, CNS bozukluklarının tedavisinde MSCs klinik uygulamalar için umut verici bir yaklaşım temsil eder . Ayrıca intranazal doğum, kısa bir süre içinde tekrarlanan bir uygulama sağlayan güvenli ve non-invaziv bir yoldur.
Bu makalede, SPIO etiketli hücreler ve MRG kullanan travmatik beyin hasarı (TBI) bir fare modelinde vivo post-intranazal doğumda MSC'leri izlemek için son derece hassas ve non-invaziv bir teknik açıklanmaktadır. SPIO etiketlemenin önemli bir avantajı da, hücrelerin etkin ve non-invaziv olarak izlenmesini mümkün kılan, MRG ile dokudaki SPIO'nun hassas tespitidir. Burada kullanılan SPIO nano tanecikleri ticari olarak mevcuttur ve bir floresan izotiyoyanat ile etiketlenmiş (FITC) florofor, hangi immünboyama veya ek işleme olmadan dokuda SPIO tespiti için izin verir. Ayrıca, uzunlamasına gerçek zamanlı izleme yapmak ve teslim MSCs biyodağılımı araştırmak mümkündür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Cell culture supplies (Plastics)</td>
			<td style="width:197px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">Varies</td>
			<td style="width:171px;">Replaceable with any source</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Disposable Microtome Blade</td>
			<td style="width:197px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">95057-832</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">10565-018</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:181px;">Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.)</td>
			<td style="width:197px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:179px;">4583</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">12662-029</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Fluorescence Wild Field Microscope</td>
			<td style="width:197px;">Olympus</td>
			<td style="width:179px;">Olympus BX43</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Forcept</td>
			<td style="width:197px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:179px;">11293-00</td>
			<td style="width:171px;">Surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">15710-064</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Hair clipper</td>
			<td style="width:197px;">Pet Club</td>
			<td style="width:179px;">PC-400</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Head Trauma Contusion device</td>
			<td style="width:197px;">Precision Systems and Instrumentation</td>
			<td>Model TBI-0310</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td style="width:197px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:179px;">H3506</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:181px;">ITK-SNAP Software</td>
			<td style="width:197px;">Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah</td>
			<td>ITK-SNAP 3.8.0</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Ketamine (Ketavet)</td>
			<td style="width:197px;">Pfizer</td>
			<td style="width:179px;">778-551</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Mice</td>
			<td style="width:197px;">National Laboratory Animal Center, Taiwan</td>
			<td style="width:179px;">C57BL6</td>
			<td style="width:171px;">Wild type mice strain used in the study</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:181px;">Microdrill</td>
			<td style="width:197px;">Nakanishi</td>
			<td style="width:179px;">NE50</td>
			<td style="width:171px;">Combine with Burrs for generating the bone window</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Microtome</td>
			<td style="width:197px;">Leica</td>
			<td style="width:179px;">RM2265</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">S1502-100</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">MRI scanner</td>
			<td style="width:197px;">Bruker Biospec</td>
			<td></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td style="width:197px;">Corning Cellgro/ThermoFisher</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Povidone-iodine 7.5%</td>
			<td style="width:197px;">Purdue product L.P.</td>
			<td></td>
			<td style="width:171px;">Surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Prussian Blue Stain</td>
			<td style="width:197px;">Abcam</td>
			<td style="width:179px;">ab150674</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Scissor</td>
			<td style="width:197px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:179px;">14084-08</td>
			<td style="width:171px;">Surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Stereotaxic frame</td>
			<td style="width:197px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:179px;">Model 900</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:181px;">Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles</td>
			<td style="width:197px;">BioPAL</td>
			<td style="width:179px;">Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51</td>
			<td style="width:171px;">stem cells labeling for in vivo tracking using MRI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Suture monofilament</td>
			<td style="width:197px;">Ethicon</td>
			<td style="width:179px;">G697</td>
			<td style="width:171px;">Suture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:181px;">Timer</td>
			<td style="width:197px;">Wisewind</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:171px;">Replaceable with any source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">TrypLE</td>
			<td style="width:197px;">GIBCO</td>
			<td style="width:179px;">12604-013</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:181px;">Xylazine (Rompun)</td>
			<td style="width:197px;">Bayer</td>
			<td style="width:179px;">QN05 cm92</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking superparamagnetic iron oxide-labeled mesenchymal stem cells using mri after intranasal delivery in a traumatic brain injury murine model

Travmatik beyin hasarı (TBI) gibi beyin yaralanmaları için kök hücre bazlı tedaviler klinik çalışmalar için umut verici bir yaklaşımdır. Ancak, invaziv hücre iletimi ve düşük transplantasyon verimliliği ile izleme gibi teknik engeller, çevirisel kök tabanlı tedavide zorluklar olmaya devam etmektedir. Bu makalede, süperparamanyetik demir oksit (SPIO) nano partikülleri ile mezenkimal kök hücrelerin (MSCs) etiketleme dayalı kök hücre etiketleme ve izleme için ortaya çıkan bir teknik açıklanmıştır, yanı sıra etiketli MSCs intranazal teslim. Bu nano tanecikleri floresan izotiyoyanat (FITC) gömülü ve güvenli MSCs etiketlemek için, daha sonra intranazal rota ile TBI kaynaklı farelerin beyinteslim edilir. Daha sonra gerçek zamanlı manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile non-invaziv in vivo izlenir. Hücre etiketlemesi ve intranazal doğum için SPIO'yu birleştiren bu tekniğin önemli avantajları arasında (1) non-invaziv, uzun takip sürelerinde doğumdan sonra in vivo MSC takibi, (2) non-invaziv nedeniyle birden fazla dosing rejimi olasılığı MSC teslimat yolu ve (3) insanlar için olası uygulamalar, SPIO güvenliği nedeniyle, MRG ile hücre izleme yönteminin non-invaziv doğası, ve yönetim yolu.

İntranazal doğumdan 24 saat sonra, SPIO etiketli MSC'ler, T2*ağırlıklı görüntülerde(Şekil 2B)kortikal yaralanmaya orta lıkta güçlü hipoyoğun alanlar olarak saptandı ve SPIO'nun yaralanma bölgesine hedefli geçişini gösteriyordu. Hipoyoğun sinyallerin bu süre boyunca önemli bir azalma olmaksızın görülebildiğinden, bu göç doğum sonrası 14 güne kadar görünür kalmıştır(Şekil 2B). PBS ile tedavi edilen yaralı hayvanlarda hipoyoğun alanlar görülmedi, gözlenen hipoyoğun alanların SPIO etiketli MSC'lere karşılık geldiğini ve objeleri işaret etmediğini belirterek (Şekil 2A) MRG ile invivo olarak gözlenen etiketli MSC'lerin biyodağılımı 3D rekonstrüksiyon kullanılarak görüntülendi (Şekil 2C,D). MsC'lerin yaralı kortekse geçişi, prusya mavisi boyama ve FITC etiketli SPIO'nun etiketli MSC'lerde histolojik olarak doğrulanmasıyla doğrulandı (Şekil 3A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig1.jpg"> Şekil 1: Protokolün şematik akış şeması ve MSC'ler tarafından SPIO alımının in vitro onayı. (A) MSC'ler etiketleme için 24 saat spio ile kuluçkaya yatırıldı. Daha sonra, etiketli MSC'ler intranazal (IN) rotası üzerinden TBI fare modeline teslim edildi. Etiketli MSC'lerin SPIO tarafından yeterli etiketlendiğinin doğrulanması için farklı zaman noktalarında MRG uygulandı. (B) floresan mikroskobu ve (C) confokal mikroskopi ile FITC kanalı kullanılarak sağlandı, çünkü SPIO nano tanecikleri FITC ile etiketlendi. (D) Etiketli MSC'lerin hücre peleti demir yüklemesi nedeniyle koyu renkte göründü. FITC = floresan isotiyosiyanat; SPIO = demir oksit süperparamanyetik parçacıklar; MSCs = mezenkimal kök hücreler; MRI = manyetik rezonans görüntüleme; IN = intranazal; TBI = travmatik beyin hasarı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig2.jpg"> Şekil 2: Gerçek zamanlı MRG, TBI'ye bağlı farelerin beyinlerinde bulunan yaralanma bölgelerine spio etiketli MSC göçünün saptanmasını ve izlenmesini sağlar. (A) Fareler TBI'ye maruz kaldı, ardından PBS veya SPIO etiketli MSC'ler ile tedavi edildi ve yaralanmadan 24 saat sonra intranazal bir yol ile uygulandı. T2*ağırlıklı görüntülerin koronal bölümleri, 1, 7 ve 14 gün sonra yaralanma bölgesinin kenarında (anahatlı alan) hipoyoğun bir alan (ok ucu) olarak etiketlenmiş MSC'leri gösterdi. PBS ile tedavi edilen farelerde hipoyoğun bir bölge görülmez. (B) Koronal T2*-MRG görüntülerine dayalı yaralanma alanının (yeşil) ve etiketli MSC'lerin (kırmızı) segmentasyon süreci. (C) Fare beyin tedavisinin 3Boyutlu rekonstrüksiyonu, doğumdan 14 gün sonra beyindeki SPIO etiketli MSC'lerin biyodağılımını gösteren T2*ağırlıklı görüntülere dayalı olarak yapılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig3.jpg"> Şekil 3: Histolojik analiz, tedavi edilen hayvanların beyinlerinde SPIO etiketli MSC'lerin varlığını doğrular. PBS (kontrol) ve(C)farespi etiketli MSC'ler ile tedavi edilen a(A)farenin beyin bölümlerinin prusya mavisi boyanması, MSC ile tedavi edilen farede (kutulu hücreler, mavi) tespit edilirken, kontrol faresi 14 gün sonra doğum sonrası korteksteki yaralanma yerinde pozitif hücre göstermedi ve MRI gözlemlerini doğruladı. PBS ve (D) fare spio etiketli MSCs ile tedavi edilen a (B) kontrol faresinin korteksin floresan mikroskopi analizi doğumdan 14 gün sonra yapıldı. Analiz, MSC ile tedavi edilen faredeki yaralı kortekste FITC etiketli SPIO pozitif hücrelerin (kutulu hücreler, yeşil) varlığını ortaya çıkardı, ancak PBS ile tedavi edilen farenin korteksinde FITC sinyali gözlenmedi. Ölçek çubukları = 50 μm, aksi belirtilmedikçe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model at JoVE.com

Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model

Burada sunulan non-invaziv mezenkimal kök hücre için bir protokol (MSC) teslim ve travmatik beyin hasarı bir fare modeli nde izleme. Süperparamanyetik demir oksit nano partikülleri, msc etiketlemesi için manyetik rezonans görüntüleme (MRG) prob ve gerçek zamanlı MRG kullanılarak intranazal doğumdan sonra invaziv in vivo izleme için non-invaziv in vivo izleme olarak kullanılır.

Travmatik Beyin Hasarı Murine Modelinde İntranazal Doğum sonrası MRG kullanarak Süperparamanyetik Demir Oksit etiketli Mezenkimal Kök Hücrelerin Takibi

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical ...

Bu yöntem beyne intranazal doğumdan sonra lobitik kök hücrenin baz dağılımını belirlemeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, mezenkimal kök hücrelerin beyne non-invaziv doğum ve takibini kolaylaştıran olmasıdır. Ayrıca, birden fazla dozda yaralanmalar dan sonra kronik aşamada nakledilen hücrelerin terapötik etkilerini maksimize etmek mümkündür.Bu teknik, yaralanma bölgesine teslim edilen hücre sayısını en üst düzeye çıkarır ve lobitik hücrenin diğer dokulara ilerlemesini en aza indirir. Bu teknik travmatik beyin hasarı tedavilerinde mezenkimal kök hücrelerin kullanımına ışık tokus etmekle birlikte, travmatik olmayan beyin yaralanmalarının araştırılmasında da kullanılabilir. Süper paramanyetik demir oksit ile mezenkimal kök hücre etiketleme için, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 24 saatlik kuluçka için bir T 75 şişesinde% 80 eşzamanlı mezenkimal kök hücre kültürüne etiketleme orta altı mililitre ekleyin.Ertesi gün, dikkatle süper natant aspire ve yıkama başına PBS altı mililitre ile hücreleri iki kez yıkayın. Hücrelerin başarılı bir şekilde etiketlenip etiketlenmediğini belirlemek için, floresan bir mikroskop altında kültürü kontrol edin. Bir CCI yaralanma neden olmak için, pedal refleks yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, kafatasının dorsal yüzeyinden kürk tıraş için elektronik makas kullanın, ve iyot batırılmış steril bir pamuklu bez ile birkaç kez traş alanı temiz.Son bezden sonra iyot çıkarmak ve bir stereotaktik çerçeve içinde hayvan yerleştirmek için% 70 etanol batırılmış bir pamuklu bez kullanın. Fareyi kulak ve burun çubuklarıyla sabittutun ve kafatası yüzeyine erişmek için tıraşlı deride 2,5 santimetrelik orta sagital kesi yapın. Kafatası kapsayan doku kaldırmak ve% 3 hidrojen peroksit ile ıslatılmış bir pamuklu bez ile 10 saniye boyunca kafatası yüzeyini temizlemek için bir pamuk ped kullanın.Taze bir pamuk ped ile kafatası kuru ve maruz kemik üzerinde tercih koordinatları etrafında dört milimetrelik bir daire çizmek için bir kalem kullanın. 0,5 milimetre çapında yuvarlak bur ile donatılmış bir mikro matkap kullanarak, dikkatle basınç uygulamadan işaretli daire de kafatası inceltin. Temiz ve kuru pamuklu bir bezle kemik tozunu çıkarın ve ortaya çıkan kemik kapağını dikkatlice çıkarmak için steril kılıflar kullanın.Dura mater maruz kaldığında, cci cihazının stereotaktik çerçeve içine fare aktarın ve baş rostrocaudal yönde düzeyde olacak şekilde kulak ve burun çubukları ile hayvan güvenli. Kontrol kutusundaki talimatları izleyerek, darbeci ucu doğrudan istenilen korteks koordinatlarının üzerine hizalamak için darbeci ucuetkilemek için darbeci nin tabanındaki X ve Y kontrol tekerleklerini kullanarak maruz kalan kortikal yüzeye darbe ucunu sıfırlayın. Deneme parametrelerini saniyede beş metre hıza, 250 milisaniyelik bir çalışma süresine ve hafif bir yaralanmaya neden olmak için bir milimetrelik yaralanma derinliğine ayarlamak için kontrol kutusunu kullanın.Ardından, kontrol kutusunun üzerindeki darbe düğmesine basın. Steril pamuklu bir bezle oluşan herhangi bir kanamayı temizle ve fareyi çerçeveden çıkarın. Kesiyi ipek cerrahi dikişlerle kapatın ve fareyi tam tedavi edilene kadar izleyerek bir ısıtma yastığına yerleştirmeden önce siteye topikal antibiyotik uygulayın.Yaralanmadan bir gün sonra, mezenkimal kök hücre kültürünü üç mililitre tripsin ile etiketlenmiş süper paramanyetik demir oksit tedavi edin. 37 santigrat derecede beş dakika sonra, önceden ısıtılmış DMEM orta yedi mililitre ile reaksiyona başlamak, 10% fetal sığır serum ile takviye ve 15 mililitre konik tüp içine hücre süspansiyon toplamak. Hücreleri santrifüj ile çökün ve pbs'deki peleti saymak için yeniden askıya alın.Daha sonra, hücre konsantrasyonu 1,5 kez 10 PBS 18 mikrolitre başına beş hücre ayarlayın. Hücre teslimatı için, parmak sıkışmayanıt eksikliği doğruladıktan sonra, kafatası immobilizing sırasında fare scruff. PBS mikrolitre başına dört birim hyaluronidase içeren bir pipetin ucunu farenin nareyakınını 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve her burun deliğe üç mikrolitre hyaluronidase süspansiyon uygulayın.Toplam 100 ünite hyaluronidase tedavisi için tedaviyi dört kez tekrarlamadan önce hayvanın yüzünü beş dakika boyunca temiz bir pedüzerine yerleştirin. Son tedaviden sonra fareyi sadece gösterildiği gibi dizginlemeden önce fareyi 30 dakika boyunca alti ye geri yerleştirin. Baş hareketsiz ken, çözelti teslim başına üç saniyelik bir süre boyunca her burun deliğine mezenkimal kök hücre süspansiyonunun üç mikrolitresini uygulayın ve numune damlaları tamamen kaybolana kadar fareyi 30 saniye pozisyonda tutarak yerleştirin.İki dakika sonra, mezenkimal kök hücre hacmi nin tamamı teslim edilene kadar teslimatı üç kez tekrarlayın. Daha sonra fareyi tam uygun olana kadar izleyerek kafesine geri döndürün. Mezenkimal kök hücrelerin MRG ile geçişini izlemek için, anestezili fareyi MR görüntüleyicinin görüntüleme tutucusu üzerine yerleştirin.Daha sonra hayvanı yerinde sabitle ve tutucuyu MR Bobini'nin ortasına taşıyın. Yineleme süresini 1500 milisaniyeye, yankı süresini ise 2,8 milisaniyeye ayarlayın. Daha sonra, görüş alanını 16'ya 16 milimetre, satın alma matrisini 128'e, dilim kalınlığını 0,75'e, 0,8 milimetreye, dört sinyal ortalaması ve 90 derece çevirme açısıyla ayarlayarak bir spin yankı dizisi kullanarak T2 yıldız ağırlıklı taramaları elde edin.Taramaları tamamladıktan sonra fare tutucuyu MRI bobini merkezinden geri çekin ve fareyi tam recumbency kadar izleyerek kafesine geri döndürün. T2 yıldız ağırlıklı görüntülerdeki etiketli mezenkimal kök hücreleri izlemek ve ölçmek için, BT kasa snap yazılımındaki verileri açın ve etkin etiketi seçin. Her segment için farklı etiket renkleri kullanarak hipoyoğun alanların ve lezyonun veya ilgi çeken diğer beyin parçalarının segmentasyonlarını oluşturmak.Mezenkimal kök hücreleri etiketli süper paramanyetik demir oksit temsil eden hipoyoğun alanları seçmek için ana araç çubuğunda çokgen aracını kullanın ve kabul edin. Parçalı alanlar, belirli bir kesime atanan etkin etiketle aynı renkte görünür. Tüm dilimler bölümlere ayrılmıştır, tüm beyinde mezenkimal kök hücre dağılımını temsil etmek için parçalı alanların bir 3D harita geliştirmek için neşter aracı nı kullanın.Etiketli hücreleri temsil eden parçalı hipoyoğun alanların hacim ve yoğunluk ortalamasının nicel analizini yapmak için segmentasyona tıklayın ve hacim ve istatistikleri seçin. İntranazal doğumdan 24 saat sonra, süper paramanyetik demir oksit etiketli mezenkimal kök hücreler, t2 yıldız ağırlıklı görüntülerde kortikal yaralanmaya orta kuvvette hipoyoğun alanlar olarak tespit edilir ve bu da süper paramanyetik demir oksitin yaralanma bölgesine hedefli göçettiğini gösterir. Bu geçiş, teslimat sonrası 14 güne kadar sinyalde gözle görülür bir azalma olmadan görünür kalır.PBS ile tedavi edilen yaralı hayvanlarda herhangi bir zamanda hipoyoğun alanlar sergilenmez, gözlenen hipoyoğun alanların mezenkimal kök hücreler olarak etiketlenmiş süper paramanyetik demir oksite karşılık geldiğini ve sinyal objelerinden kaynaklanmadığını gösterir. Etiketli mezenkimal kök hücrelerin biyo-dağılımı 3D rekonstrüksiyon, histolojik Prusya mavi boyama, ya da etiketli mezenkimal kök hücreler içinde süper paramanyetik demir oksit etiketli FITC floresan tespiti ile görselleştirilmiş olabilir. Estoloji veya diğer yöntemlerle MR Sonuçları doğrulamak için emin olun.Süper manyetik demir oksit parçacıkları hücre öldükten sonra dokularda kalabilir, yanlış pozitif sinyallere yol açar. Bu prosedürü takiben, sayısallaştırmada olası temperal non-invaziv izleme yetenekleri honlama ve beyinde mezenkimal kök hücrelerin tutulması ile ilgili soruları cevaplamak için uygulanabilir. Bu gelişmeden sonra, bu teknik beynin belirli bölgelerine honlama hücre geliştirmek için yöntemler keşfetmek için rejeneratif tıp alanında araştırmacılar için yol açmıştır.

Research

JoVE Journal

Medicine

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Sıçan Modelinde Transkraniyal Odaklanmış Ultrason kullanarak Kan-beyin bariyeri MRG eşliğinde bozulması

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

Hücre Takip için vivo 19 F MRG

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Bir olarak beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) olarak gerin<em&gt; In Vitro</emKan Beyin Bariyer&gt; Travmatik Beyin Hasarı Modeli

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Travmatik Beyin Hasarı için Kontrollü Kortikal Etki Modeli

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

Çocuk Rats için Hafif Travmatik Beyin Hasarı Yeni Bir Model

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Bir Perivasküler Drug Delivery Patch İmplantasyonunda ile Femoral Arter Tel Yaralanma sıçan Modeli

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Atçılık tendinopatisinde Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücreler Etiketli Teknesyum- 99m Vivo Görüntüleme ve Takip

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

Farelerde Doku Yerinden Olma Esaslı Taşan Spinal Kord Yaralanması Modeli

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

Tek ve Tekrarlayan Hafif Travmatik Beyin Hasarı İçin Bir Fare Modeli

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...