Name: genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit
Uploaded: 2019-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم لشبكه التكنولوجيا الحيوية والبيولوجية الصناعية ومركز الابتكار في مجال التكنولوجيا الحيوية الصناعية (IBioIC) للدعم المالي. GARG, AASO و AP الاعتراف بالدعم التمويلي من برنامج الدكتوراه الحالة المالية BBSRC EASTBIO (منحه رقم BB/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) برنامج الدكتوراه, و IBioIC-BBSRC شراكه التدريب التعاوني (CTP) برنامج الدكتوراه, التوالي. نشكر كونراد موليليفو (جامعه الملكة ماري في لندن) ، وبول اريك جينسن ، وجولي Annemarie يتا زيسلر (جامعه كوبنهاجن) للحصول علي ناقلات البلازميد والمساهمات والمشورة في البروتوكول.

1. الجمعية ناقلات باستخدام أدوات MoClo النبات والسيانيد
ملاحظه: قبل المضي قدما مع الجمعية ناقلات, فمن المستحسن بشده ان المستخدمين التعرف علي هياكل مستوي المتجات من النبات ونظم mocogate موغلو12,15.
<ol><li>بناء أجزاء من المستوي 0 ملاحظه: يمكن توليف أجزا?...

البوابة الذهبية الجمعية لديها العديد من المزايا مقارنه مع غيرها من وسائل التجميع ناقلات, لا سيما من حيث قابليه20,21. ومع ذلك ، يتطلب إنشاء نظام البوابة الذهبية في المختبر وقتا لتطوير إلمام بالأجزاء المختلفة والمكتبات المتجهة المتقبلة وعمليات التجميع الشامل?...

البكتيريا الزرقاء التغذية هي بكتريا يمكن استخدامها في التخليق الحيوي لمجموعه واسعه من المنتجات الايضيه ذات القيمة العالية الطبيعية وغير المتجانسة1،2،3،4،5، 6- ولا تزال هناك عده عقبات تحتاج إلى التغلب عليها لتوسيع صلاحيتها التجارية ، ولا سيما الغلات الضعيفة نسبيا مقارنه بالمنصات الحيوية غير المتجانسة (مثل القولونية والخميرة)7. ويساعد التوسع الأخير في الاداات الهندسية الوراثية المتاحة واستيعاب نموذج البيولوجيا التركيبية في البحوث الترتبطه علي التغلب علي هذه التحديات وزيادة تطوير البكتيريا الزرقاء كمصانعحيوية فعاله 8، 9و10.
النهج الرئيسية لإدخال الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء هي التحول والاقتران والكهربية. والمتجات المنقولة إلى البكتيريا الزرقاء بالتحويل أو بالكهرباء هي ناقلات "انتحاريه" (اي المتجات التكاملية التي تسهل أعاده الدمج الذاتي) ، في حين يمكن نقل ناقلات النسخ المتماثل بنفسها إلى البكتيريا الزرقاء التحويل ، الاقتران أو الكهربية. النسبة للنوع الأول ، هناك بروتوكول متاح للأنواع النموذجية الهندسية القابلة للتحول الطبيعي11. في الاونه الاخيره ، تم تطوير مجموعه أدوات الاستنساخ (MoClo) وحدات لبكتيريا السيانيد يسمي سيانوكوبالامين التي توظف طريقه موحده لتجميع ناقلات البوابة الذهبية للهندسة باستخدام التحويل الطبيعي ، الكهربي أو الاقتران12.
وقد أصبحت تقنيات الجمعية الذهبية من نوع شعبيه متزايدة في السنوات الاخيره ، ومعايير الجمعية والمكتبات جزء متاحه الآن لمجموعه متنوعة من الكائنات الحية13،14،15،16 ،17. البوابة الذهبية يستخدم نوع الانزيمات تقييد IIS (علي سبيل المثال ، BsaI ، BpiI ، BsmBI ، BtgZI و AarI) وبدله من متقبلين وتعليق فريد لتسهيل التجمع الهرمي الاتجاهي لمتواليات متعددة في "وعاء واحد" رد فعل الجمعية. تعرف الانزيمات المقيدة لنوع IIS علي تسلسل غير متماثل فريد وتقطع مسافة محدده من مواقع التعرف عليها لإنشاء قطع متداخلة ، "نهاية لزجه" (عاده ما تكون 4 نوكليوتيد [NT] المتراكمة) ، والتي يمكن استغلالها لاحقا لدفع الحمض النووي المطلوب ردود فعلالجمعية 15,18. وقد سهل هذا تطوير المكتبات الكبيرة من أجزاء المستوي 0 وحدات (علي سبيل المثال ، والمروجين ، وإطارات القراءة المفتوحة والمنهيون) المعرفة من قبل بناء جمله مشتركه ، مثل معيار PhytoBricks19. ويمكن بعد ذلك تجميع أجزاء المستوي 0 بسهوله في أشرطه التعبير المستوي 1 ، وبعد ذلك أكثر تعقيدا التجميعات ترتيب اعلي (علي سبيل المثال ، التعبير المتعدد الجينات يبني) يمكن ان يبني في ناقلات متقبل من الاختيار12،15. ومن المزايا الرئيسية لتقنيات الجمعية الذهبية من نوع البوابة هي قدرتها علي الاتمته في مرافق عاليه الانتاجيه ، مثل الحمض النووي المصهر20،21، والتي يمكن ان تسمح للاختبار التصاميم التجريبية المعقدة التي لا يمكن تحقيقه بسهوله عن طريق العمل اليدوي.
سيانوكوبالامين يبني علي نظام المصنع الثابتة moclo12،15. ولادراج جزء جديد في السيسونات ، يجب أولا ان تكون التسلسلات الجزئية مستانسه ، اي انه يجب أزاله مواقع الاعتراف "غير القانوني" لشركتي BsaI و BpiI. في حاله الترميز جزء لاطار القراءة المفتوحة (اي تسلسل الترميز ، الاقراص المدمجة) ، يمكن ان تتعطل مواقع التعرف عن طريق توليد طفرات مرادفه في التسلسل (اي تغيير كودون إلى بديل ان الرموز لنفس بقايا الأحماض الامينيه). ويمكن تحقيق ذلك من خلال مجموعه متنوعة من النهج ، بدءا من توليف الحمض النووي إلى الاستراتيجيات القائمة علي تضخيم تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) مثل جمعيه جيبسون22. اعتمادا علي المضيف التعبير المستخدمة ، ينبغي توخي الحذر لتجنب إدخال المخطوطات النادرة التي يمكن ان تمنع كفاءه الترجمة23. أزاله مواقع التعرف في تسلسل المروج والمنهي عاده مسعى أكثر خطورة ، كما قد تؤثر التعديلات علي الدالة وقد لا يؤدي الجزء كما هو متوقع. علي سبيل المثال ، يمكن ان تغير التغييرات في مواقع ربط عامل النسخ المفترض أو موقع ربط الريبوسوم داخل المروج القوه والاستجابة للتوجيه/القمع. المثل ، فان التعديلات علي الملامح الهيكلية الرئيسية المنهي (علي سبيل المثال ، الجذعية الغنية GC ، حلقه وبولي U الذيل) قد تغير كفاءه إنهاء وتاثير التعبيرالجيني 24 ،25. علي الرغم من ان العديد من الموارد علي الإنترنت متاحه للتنبؤ بنشاط متواليات المروج والمنهي ، وإبلاغ ما إذا كانت الطفرة المقترحة ستؤثر علي الأداء26،27، وهذه الاداات غالبا ما تكون ضعيفه من التنبؤات الأداء في البكتيريا الزرقاء28،29،30.. علي هذا النحو ، في توصيف الجسم المجري للأجزاء المعدلة لا يزال يوصي بتاكيد النشاط. وللمساعدة في استنساخ المتواليات المتمردة ، يتضمن السيسونات نسخه منخفضه من النسخ التي يقبلها الاستنساخ علي أساس ناقل بيوريك pSB4K512،16،31. وعلاوة علي ذلك ، فان بوابه "التصميم والبناء" متاحه من خلال مسبك الجينوم في ادنبره للمساعدة في تصميم ناقلات الامراض (dab.genomefoundry.org). وأخيرا ، والاهم من ذلك ، وتشمل سيانوكوبالامين اثنين من التصميمات ناقلات المستوي T متقبل (ما يعادل المستوي 2 المتجات متقبل)15 لإدخال الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء باستخدام ناقلات الانتحار ، أو ناقلات واسعه النطاق المضيف قادره علي النسخ المتماثل الذاتي في عده ترتبط الأنواع32،33،34.
هنا سوف نركز علي وصف بروتوكول لتوليد مستوي T ناقلات النسخ المتماثل الذاتي والتعديل الجيني لل synechالونجاتوس sti الشركة ال6803ه للامراض و Synechكوكوس الونجاتوس Utex 2973 (Synechёts الشركة الخاصة 6803 و s. Utex 2973 الاخره) عن طريق الاقتران (المعروف أيضا باسم التزاوج ثلاثي الوالدين). النقل الزوجي للحمض النووي بين الخلايا البكتيرية هو عمليه موصوفه جيدا وقد استخدمت سابقا للهندسة ترتبط الأنواع ، وخاصه تلك التي ليست مختصة بشكل طبيعي ، مثل s. الونجاتوس utex 297335، 36،37،38،39،40،41. وباختصار ، يتم احتضان الثقافات الترتبطه بسلاله كولاي التي تحمل المتجه الذي سيتم نقله (ناقل "الحمولة") والمتجات (اما في نفس سلاله e. كولاي أو في سلالات اضافيه) لتمكين الاقتران ("المعبئ" ومتجات "المساعد"). مطلوب أربعه شروط رئيسيه لنقل الزوجية ان يحدث: 1) الاتصال المباشر بين الخلايا المتورطة في نقل الحمض النووي ، 2) يجب ان يكون ناقل البضائع متوافقا مع نظام التصريف (اي انه يجب ان يحتوي علي مصدر مناسب للتحويل (Orit) ، المعروف أيضا باسم شجره المواد (أساس التنقل) الموقع) ، 3) الحمض النووي الذي يخدع البروتين (علي سبيل المثال ، المشفرة من قبل الجينات الغوغاء ) التي نيكس الحمض النووي في orit لبدء نقل واحد تقطعت بهم السبل للحمض النووي في السيانيد يجب ان تكون موجودة وأعرب اما من ناقلات البضائع أو المساعدين ، و 4) يجب الا يدمر الحمض النووي المنقول في السيانيد المستلم (اي ، يجب ان يكون مقاوما للتدهور بواسطة ، علي سبيل المثال ، تقييد النشاط الأحادي النواة)35،42. ولكي يستمر ناقل البضائع ، يجب ان يكون منشا النسخ المتماثل متوافقا مع زرقه المتلقي للسماح بالنسخ المتماثل الذاتي والانتشار في القسم الخاص بالخلايا التابعة للابنة. للمساعدة في الظروف 3 و 4 ، تتوفر العديد من ناقلات المساعد من خلال Addgene والمصادر التجارية الأخرى التي ترمز للغوغاء وكذلك العديد من ميثيل أسيس للحماية من الكريات المحلية الاصليه في المضيف سيانوكوبالامين43. في هذا البروتوكول ، تم تسهيل الاقتران بسلاله MC1061 e. القولونية التي تحمل المعبئ وناقلات المساعد pRK24 (www. addgeneorg/51950) و pRL528 (www.addgene.org/58495) ، علي التوالي. يجب توخي الحذر عند اختيار المتجات التي سيتم استخدامها للتحويل الزوجي. علي سبيل المثال ، في عده سيانوكوبالامين الذاتي--النسخ المتماثل ناقلات البضائع pPMQAK1 الترميز للبروتين الغوغاء12. ومع ذلك ، pSEVA421 لا44، وعلي هذا النحو ، يجب ان يتم التعبير عن الغوغاء من ناقل المساعد مناسبه. وينبغي ان تكون المتجات المستخدمة مناسبه أيضا للكائن المستهدف. فعلي سبيل المثال ، يتطلب النقل الزوجي الفعال في شركه انابينا sp. 7120 ناقل المساعد الذي يحمي ناقلات المعبئ ضد الهضم (علي سبيل المثال ، pRL623 ، الذي يشفر لثلاثه ميثيل أسيس Avaim ، Eco47iiM و Ecot22iM)45، 46.
وفي هذا البروتوكول ، نقوم بتوضيح كيفيه توصيف أداء الأجزاء (اي المروجين) بعلامة فلورية باستخدام قارئ اللوحة أو مقياس التدفق الخلوي. تدفق الخلايا الخلوية قادره علي قياس الفلوري علي أساس خليه واحده لعدد كبير من السكان. وعلاوة علي ذلك ، تسمح مقاييس التدفق الخلوي للمستخدمين "ببوابه" البيانات المكتسبة وأزاله الضوضاء الخلفية (علي سبيل المثال ، من الجسيمات في الثقافة أو التلوث). وعلي النقيض من ذلك ، فان قراء اللوحات يكتسبون قياسا مضانا لحجم معين من الثقافة ، وعاده ما يكون ذلك في العديد من الآبار المتماثلة. وتشمل المزايا الرئيسية للقراء لوحه علي أجهزه قياس الكريات الخلوية انخفاض التكلفة ، وتوافر اعلي وعاده لا حاجه لبرامج متخصصة لتحليل البيانات المصب. العيوب الرئيسية للقراء لوحه هي حساسية اقل نسبيا بالمقارنة مع المضخمات الخلوية والقضايا المحتملة مع كثافة بصريه من الثقافات المقاسه. النسبة للتحليلات المقارنة ، يجب ان تكون عينات قارئ اللوحات بشكل تطبيع لكل بئر (علي سبيل المثال ، لقياس كثافة الثقافة ، التي تؤخذ عاده علي انها الامتصاص في الكثافة البصرية عند 750 نانومتر [OD750]) ، والتي يمكن ان تؤدي إلى عدم دقه العينات التي هي أيضا كثيفه و/أو غير مختلطة جيدا (علي سبيل المثال ، عندما تكون عرضه للتجميع أو التلبد).
كلمحه عامه ، وهنا نظهر بالتفصيل مبادئ توليد مستوي 0 أجزاء ، تليها الجمعية الهرمية باستخدام مجموعه سيانوكوبالامين والاستنساخ إلى ناقلات مناسبه لنقل الزوجية. ثم نقوم بإثبات عمليه النقل الزوجية ، واختيار سلالات التحويلات التي تعبر عن علامة فلورية ، والحصول لاحقا علي البيانات الفلورية باستخدام مقياس التدفق الخلوي أو قارئ اللوحة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0404</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (microbiology tested)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-500g</td>
			<td>Used in 8.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41026</td>
			<td>Used in 6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BpiI (BbsI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI (Eco31I)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0291</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>A1491.0005</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used in 4.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>Used in 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td>DNA extraction kit. Used in 5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega Microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td>Used in 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10021083</td>
			<td>Used in 2.3.1, 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10356553</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11815-024</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filters (0.45 &#956;m)</td>
			<td>MF-Millipore</td>
			<td>HAWP02500</td>
			<td>Used in 3.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) &#181;CLEAR</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td>Used in 4.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1020S</td>
			<td>Used in 1.1.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td>DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro incubator with LEDs</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>-</td>
			<td>Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21108</td>
			<td>Used in 7.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used in 2.3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 chemically competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td>Used in 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>K813</td>
			<td>Used in 4.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>Used in 1.1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load 1 kb DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0468S</td>
			<td>Used in Figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>72.692.210</td>
			<td>Used in 3.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>J61820.06</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>612U96</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill. Used in 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit

البكتيريا الزرقاء هي مجموعه متنوعة من الكائنات الضوئية الاصطناعية النواة التي يمكن تعديلها وراثيا للإنتاج المتجدد للسلع الصناعية المفيدة. وقد أدت التطورات الاخيره في البيولوجيا التركيبية إلى تطوير عده مجموعات من أدوات الاستنساخ مثل السيسونات ، وهو نظام معياري للاستنساخ النمطي لبناء ناقلات البلازميد للتحول اللاحق أو الانتقال الزوجي إلى البكتيريا الزرقاء. هنا نحن الخطوط العريضة طريقه مفصله لتجميع ناقلات ذاتية التكرار (علي سبيل المثال ، تحمل كاسيت التعبير علامة الفلورسنت) ونقل الزوجية من المتجه إلى سلالات ترتبط Synechocystis sp. 6803 أو Synechكوكوس الونجاتوس utex 2973. الاضافه إلى ذلك ، فاننا نقدم وصفا لكيفيه توصيف أداء الجزء الوراثي (علي سبيل المثال ، المروج) باستخدام قارئ اللوحة أو قياس التدفق الخلوي.

لإظهار سير عمل تجميع البوابة الذهبية ، تم تجميع كاسيت التعبير في الموضع 1 للمستوي 1 (إلى الامام) المتجه متقبل (pICH47732) الذي يحتوي علي الأجزاء التالية من المستوي 0: المروج لل C-phycocyanin Pcpc560 (pc 0.005) ، تسلسل الترميز eYFP (pC 0.008) والمنهي مزدوجة Trr (pc 0.082)12....

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

هنا ، نقدم بروتوكولا يصف كيفيه القيام بتجميع ناقل النسخ المتماثل ذاتيا باستخدام مجموعه أدوات الاستنساخ النموذجية سيانوكوبالامين ، ii) إدخال المتجه إلى مضيف ترتبط عن طريق الاقتران ، و iii) توصيف سلالات البكتيريا الوراثية المحورة جينيا باستخدام قارئ لوحه أو تدفق الخلوية.

التحوير الجيني لبكتيريا السيانيد بالاقتران باستخدام مجموعه أدوات الاستنساخ النموذجية السيسونات

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Cyanobacteria هي فيبلوم مهم من الميكروبات الضوئية التي يتم الاعتراف بها بشكل متزايد كمنصات مفيدة لبيولوجيا التركيبية وتطبيقات التكنولوجيا الحيوية المتجددة. لذلك من المهم تطوير تقنيات قوية لتبسيط التصميم والاستنساخ وإدخال الحمض النووي غير المتغاير في الأنواع الزرقاء المختلفة. لذلك هذه التقنية يوضح طريقة راسخة تسمى الاقتران أو التزاوج ثلاثي الأعراق لإدخال الحمض النووي في الأنواع الزرقاء التي ليست قابلة للتحويل بشكل طبيعي.وقد أجريت بنجاح في اجتان في مجموعة واسعة من سلالات البكتيريا الزرقاء من خلية واحدة إلى الأنواع خيوط متعددة الخلايا. إذا كنت تحاول هذه التقنية للمرة الأولى، يرجى الحرص على التعامل مع كل من البكتيريا الزرقاء الخاصة بك وسلالات الإشريكية القولونية الخاصة بك مع الرعاية. على سبيل المثال، لا الطرد المركزي فوق القيم الواردة في البروتوكول ولا دوامة.خلط البكتيريا والبكتيريا الزرقاء قد يبدو غريبا للمستخدمين لأول مرة. ونأمل أن نساعد على توضيح ذلك من خلال إظهار عملية الاقتران. بعد إنشاء تجميعات مستوى واحد، اختر مستوى مناسب T acceptor المتجه.اختيار وصلة نهاية مناسبة لligate ثلاثة رئيس نهاية النهائي من مستوى واحد إلى مستوى العمود الفقري T. لتجميع تجميع واحد أو أكثر من مستوى واحد في المستوى T، قم بإعداد مزيج تفاعل مع PBI1 و متجه الارتباط النهائي المطلوب. إعداد برنامج دورة الحرارية والمضي قدما وفقا للمخطوطة.في اليوم الأول ، تنمو الثقافة البكتيريا الزرقاء من خلال إنشاء ثقافة جديدة من Synechocystis PCC 6803 أو Synechococcus elongatus UTEX 2973. مع حلقة معقم الحرارة، كشط الخلايا من لوحة أجار axenic BG-11 ووضعها في قارورة مخروطية 100 ملليلتر مليئة 50 ملليلتر من الطازجة BG-11 المتوسطة إلى تلقيح. ضع القارورة في حاضنة تهتز مع الإضاءة لتنمو Synechocystis PCC 6803 الثقافات الخلية في 30 درجة مئوية في 100 دورة في الدقيقة.بالنسبة لـ Synechococcus elongatus UTEX 2973، تنمو ثقافات الخلايا عند 40 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة. بعد يوم إلى يومين، رسم ملليلتر واحد من ثقافة الخلية وقياس على مقياس الطيف. امتصاص في OD 750 تصل إلى 0.5 إلى 1.5.في اليوم الثاني، تلقيح سلالة مساعدة MC1061 E.coli التي تحتوي على ناقلات PRK24 وPRL528 في خمسة ملليلتر من LB المتوسطة مع الأمبيسيلين بتركيز 100 ميكروغرام لكل ملليلتر وكلورامفينيكول بتركيز 25 ميكروغرام لكل ملليلتر. تنمو عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في 225 دورة في الدقيقة في حاضنة تهتز. ثم تلقيح خمسة ملليلترات من متوسطة LB تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة مع ثقافة الإشريكية القولونية التي تحمل متجه البضائع T المستوى.تنمو الثقافة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في 225 دورة في الدقيقة في حاضنة تهتز. في اليوم الثالث، الطرد المركزي المساعد والبضائع E.coli الثقافات بين عشية وضحاها في 3، 000 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المناط دون إزعاج بيليه الخلية.غسل الكريات بإضافة خمسة ملليلتر من متوسطة LB الطازجة دون المضادات الحيوية. إعادة تعليق بيليه عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا والطرد المركزي لإزالة الفائق. كرر هذه الخطوة غسل ثلاث مرات لإزالة المضادات الحيوية المتبقية من ثقافة بين عشية وضحاها.بعد الغسيل الأخير، resuspend بيليه الخلية في نصف حجم متوسطة LB من حجم الثقافة الأولية. ثم الجمع بين 450 ميكرولترات من سلالة المساعد مع 450 ميكرولترات من سلالة البضائع في أنبوب ملليلتر اثنين وترك في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، إعداد ثقافة البكتيريا الزرقاء عن طريق الطرد المركزي ملليلتر واحد من الثقافة البكتيريا الزرقاء في 1، 500 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.ثم تجاهل المابير بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. غسل بيليه أربع مرات عن طريق إضافة الطازجة BG-11 المتوسطة من نفس الحجم الأولي. أضف 900 ميكرولترات من ثقافة البكتيريا الزرقاء المغسولة إلى 900 ميكرولترات من سلالات الإشريكية القولونية مجتمعة في أنبوب ملليلتر اثنين.اخلط الثقافات عن طريق الخفقان بلطف صعودا وهبوطا. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لSynechocystis PCC 6803 أو ساعتين لSانيتشيككوس elongatus UTEX 2973. الطرد المركزي الخليط في 1, 500 غ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.إزالة 1.6 ملليلتر من عظمى و resuspend بيليه في عظمى المتبقية. ضع فلتر غشاء 0.45 ميكرون على صفيحة LB BG-11 agar بدون مضادات حيوية. انتشار بعناية 200 ميكرولترات من مزيج ثقافة E.coli/cyanobacterial على الغشاء مع موزع معقمة أو طرف منحنى العقيمة.ختم لوحة مع فيلم البارافين ووضع لوحة في حاضنة مضيئة لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة، نقل بعناية الغشاء باستخدام ملقط معقمة لهب إلى لوحة Agar BG-11 الطازجة التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة لتحديد لناقلات البضائع. ختم لوحة مع فيلم البارافين واحتضان تحت نفس الظروف كما في السابق حتى تظهر المستعمرات.تظهر المستعمرات عادة بعد 7-14 يومًا لـ Synechocystis PCC 6803 و 3-7 أيام لـ Synechococcus elongatus UTEX 2973. لتحديد الاقتران، وذلك باستخدام قضيب التلقيح معقمة الحرارة، حدد ما لا يقل عن اثنين من المستعمرات الفردية من الغشاء و streak على لوحة Agar BG-11 الجديدة التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. ثم تلقيح سلسلة من الثقافة البكتيريا الزرقاء في أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من LB المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في 225 دورة في الدقيقة في حاضنة تهتز.الثقافة الواضحة تؤكد عدم وجود تلوث الإشريكية القولونية. بعد فترة نمو كافية من سبعة أيام، واختيار المستعمرات أكسل الفردية لاقامة الثقافات السائلة لتخزين التبريد على المدى الطويل أو التجارب اللاحقة. في هذه الدراسة، تم إظهار سير عمل تجميع البوابة الذهبية.بعد تحول من تفاعل الجمعية، تم تحديد الجمعيات الناجحة باستخدام الفحص الأبيض الأزرق القياسي لمستعمرات الإشريكية القولونية. ثم تم تجميع الكاسيت التعبير eYFP في المستوى واحد متجه ونهاية وصلة متجه واحد في مستوى T acceptor ناقلات لإعطاء متجه cpcBA-eYFP. تم التحقق من ناقل cpcBA-eYFP المجمعة عن طريق الهضم المقيد.أدى النقل الزوجي الناجح لل cpcBA-eYFP أو متجه pPMQAK1-T إلى نمو ما يصل إلى عدة مئات من المستعمرات على الغشاء لـ Synechocystis PCC 6803 وSyechococcus elongatus UTEX 2973. كما هو متوقع للمروج Pcpc560 قوية، كانت قيم لفلورسينسي eYFP تطبيع من قارئ لوحة وeYFP fluorescence لكل خلية من تدفق مقياس الخلايا عالية بالمقارنة مع السيطرة السلبية. مع كل من قارئ لوحة ومقياس التدفق، كانت قيم الفلوريسين أعلى في Synechococcus elongatus UTEX 2973 مما كانت عليه في Synechocystis PCC 6803.تأكد من احتضان الحد الأدنى من الوقت وفقا لأي سلالة كنت مترافق.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

مقايسة لتحريض العصبية في الأجنة الفرخ

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

سير عمل التصوير عالي المحتوى لدراسة Grb2 مجمعات اشارة عن طريق الاستنساخ التعبير

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

تعديل وإعادة التركيب الوراثي للاللعابية الثقافات الجهاز الغدة

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation لل، عزل والتصوير من Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

التصور للضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بالتصوير المقطعي الفولت العالي Cryo-إلكترون

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

خط أنابيب باستخدام ثنائي في القطب الرحمي لاستجواب التأثيرات الوراثية على سلوك القوارض

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...