Name: genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit
Uploaded: 2019-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

Forfatterne er taknemmelig for PHYCONET bioteknologi og biologisk Sciences Research Council (BBSRC) netværk i industriel bioteknologi og Bioenergy (NIBB) og Industrial Biotechnology innovation Center (IBioIC) for økonomisk støtte. GARG, AASO og AP anerkender støtte fra BBSRC EASTBIO-PhD-programmet (tilskudsnummer BB/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) ph. d.-programmet og IBioIC-BBSRC-programmet for samarbejdende Trænings partnerskab (CTP), Henholdsvis. Vi takker Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London), og Poul Eric Jensen og Julie Annemarie Zita Zedler (Københavns Universitet) for plasmid vektor og protokol bidrag og rådgivning.

1. vektor samling ved hjælp af anlæggets MoClo og Cyanogatværktøjssæt
Bemærk: før du fortsætter med vektor samling, anbefales det kraftigt, at brugerne sætter sig ind i anlæggets vektor niveau strukturer og cyanogate moclo systemer12,15.
<ol><li>Opførelse af niveau 0 dele Bemærk: niveau 0 dele kan syntetiseres som komplette vektorer eller som lineære sekvenser for montering med level 0 acceptorer (f. eks gBlocks, IDT)...

Golden Gate assembly har flere fordele i forhold til andre vektor montage metoder, især med hensyn til skalerbarhed20,21. Ikke desto mindre, opsætning af Golden Gate system i et laboratorium kræver tid til at udvikle et kendskab til de forskellige dele og acceptor vektor biblioteker og samlede montageprocesser. Omhyggelig planlægning er ofte nødvendig for mere komplekse samlinger eller ved udførelse af et stort antal komplekse samlinger parallelt (f. eks. a...

Cyanobakterier er autotrofisk bakterier, der kan anvendes til biosyntesen af en bred vifte af naturlige og heterologe høj værdi metaboliske produkter1,2,3,4,5, 6. Flere forhindringer skal stadig overvindes for at udvide deres kommercielle levedygtighed, især de relativt dårlige udbytter i forhold til heterotrofisk bio-platforme (f. eks. Escherichia coli og gær)7. Den nylige udvidelse af de tilgængelige genteknologiske værktøjer og udbredelsen af det syntetiske biologi paradigme inden for cyanobakteriel forskning bidrager til at overvinde sådanne udfordringer og videreudvikle cyanobakterier som effektive biofactorier8, 9,10.
De vigtigste tilgange til indførelse af DNA i cyanobakterier er omdannelse, konjugering og elektroporation. De vektorer, der overføres til cyanobakterier ved omdannelse eller elektroporation, er "selvmords vektorer" (dvs. Integrative vektorer, som letter homologe rekombination), mens selvkopierende vektorer kan overføres til cyanobakterier ved omdannelse, konjugering eller elektroporation. For førstnævnte, en protokol er tilgængelig for Engineering model arter modtagelig for naturlig transformation11. For nylig, en modulær kloning (MoClo) Toolkit for cyanobakterier kaldet Cyanogat er blevet udviklet, der beskæftiger en standardiseret Golden Gate vektor montage metode til teknik ved hjælp af naturlig transformation, elektro poration eller konjugering12.
Golden Gate-type montage teknikker er blevet stadig mere populære i de seneste år, og montage standarder og del biblioteker er nu tilgængelige for en række organismer13,14,15,16 ,17. Golden Gate brugertype IIS restriktionsenzymer (f. eks BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI og AarI) og en dragt af acceptorer og unikke udhæng for at lette retningsbestemt hierarkisk samling af flere sekvenser i en "en pot" assembly reaktion. Type IIS-begrænsnings enzymer genkender en unik asymmetrisk sekvens og skærer en defineret afstand fra deres genkendelses steder for at generere en forskudt, "klæbrig ende" udskæring (typisk en 4 nucleotid [NT] udhæng), som efterfølgende kan udnyttes til at drive bestilt DNA monterings reaktioner15,18. Dette har lettet udviklingen af store biblioteker af modulære niveau 0 dele (f. eks initiativtagere, åbne læse rammer og terminatorer) defineret ved en fælles syntaks, såsom PhytoBricks standard19. Niveau 0 dele kan derefter let samles i niveau 1 udtryk kassetter, hvorefter mere komplekse højere ordre samlinger (f. eks multi gene Expression konstruktioner) kan bygges i en acceptor vektor af valg12,15. En vigtig fordel ved montering af gyldne Gate-typer er deres modtagelighed for automatisering ved højkapacitets anlæg, såsom DNA-støberier20,21, som kan muliggøre afprøvning af komplekse eksperimentelle designs, der kan ikke nemt opnås ved manuel arbejdskraft.
Cyanogat bygger på det etablerede Plant moclo system12,15. For at indarbejde en ny del i Cyanogat, skal den del sekvens først være domesticerede, dvs "ulovlige" anerkendelse sites for BsaI og BpiI skal fjernes. I tilfælde af en del kodning for en åben læse ramme (dvs. en kodnings sekvens, cd'er), kan genkendelses stederne forstyrres ved at generere synonyme mutationer i sekvensen (dvs. ændre en codon til et alternativ, der koder for den samme aminosyre rest). Dette kan opnås ved en række forskellige tilgange, lige fra DNA-syntese til polymerase kædereaktion (PCR) forstærknings baserede strategier som Gibson assembly22. Afhængigt af det udtryk vært, der anvendes, bør der udvises forsigtighed for at undgå indførelsen af sjældne kodon, der kan hæmme effektiviteten af oversættelse23. Fjernelse af genkendelses websteder i promotor-og terminatorsekvenser er typisk en mere risikobetonet bestræbelse, da ændringer kan påvirke funktionen, og delen muligvis ikke fungerer som forventet. For eksempel kan ændringer i formodede transskriptionsfaktor bindingssteder eller ribosom-bindingsstedet i en promotor ændre styrke og reaktionsevne over for induktion/undertrykkelse. På samme måde kan ændringer af centrale Terminator strukturelle funktioner (f. eks GC rige stilk, loop og poly-U hale) ændre termineringseffekten og effekt genekspression24,25. Selv om der er flere online ressourcer til rådighed til at forudsige aktiviteten af promotor-og terminatorsekvenser og oplyse, om en foreslået mutation vil påvirke ydeevnen26,27, er disse værktøjer ofte dårlige prædiktorer for ydeevne i cyanobakterier28,29,30.. Som sådan, in vivo karakterisering af modificerede dele anbefales stadig at bekræfte aktiviteten. For at hjælpe med kloning af genstridige sekvenser, cyanogate omfatter en lav kopi kloning acceptor vektor baseret på biobrick vektor pSB4K512,16,31. Desuden er en "design og build" Portal tilgængelig gennem Edinburgh Genome Foundry til at hjælpe med vektor design (dab.genomefoundry.org). Endelig, og vigtigst af alt, omfatter CyanoGate to niveau T acceptor vektor designs (svarende til niveau 2 acceptor vektorer)15 for at indføre DNA i cyanobakterier ved hjælp af selvmords vektorer, eller brede Host-Range vektorer i stand til selv-replikation i flere cyanobakteriale arter32,33,34.
Her vil vi fokusere på at beskrive en protokol til generering af niveau T selvkopierende vektorer og den genetiske modifikation af Synechocystis pcc 6803 og Synechococcus elongatus Utex 2973 (synechocystis PCC 6803 og S. elongatus Utex 2973 herefter) ved konjugering (også kendt som Tri-Parental Mating). Conjugal overførsel af DNA mellem bakterieceller er en velbeskrevet proces og er tidligere blevet anvendt til ingeniør cyanobakteriale arter, især dem, der ikke er naturligt kompetente, såsom S. elongatus utex 297335, 36,37,38,39,40,41. Kort sagt inkuberes cyanobakteriale kulturer med en E. coli -stamme, der bærer vektoren, og som skal overføres ("Cargo"-vektoren) og vektorer (enten i den samme E. coli -stamme eller i yderligere stammer) for at muliggøre konjugering ("mobilizer" og "hjælpe" vektorer). Der er behov for fire nøglebetingelser for overførsel af konjugering: 1) direkte kontakt mellem de celler, der er involveret i DNA-overførsel, 2) last vektoren skal være kompatibel med konjugations systemet (dvs. den skal indeholde en egnet overførings kilde (Orit), også kendt som en bom (grund af mobilitet) site), 3) et DNA nicking protein (f. eks, kodet af Mob genet), at Nicks DNA på Orit at initiere enkelt-strandede overførsel af DNA til cyanobacterium skal være til stede og udtrykkes fra enten lasten eller hjælpe vektorer, og 4) det overførte DNA må ikke destrueres i recipient cyanobacterium (dvs. skal være modstandsdygtig over for nedbrydning ved f. eks. begrænsningens endonukleaseaktivitet)35,42. For at last vektoren kan fortsætte, skal Replikeringens oprindelse være kompatibel med modtageren cyanobacterium for at give mulighed for selv-replikering og spredning i datter celler post division. For at støtte med betingelser 3 og 4 er flere hjælpe vektorer tilgængelige via Addgene og andre kommercielle kilder, der koder for Mob samt flere methylaser for at beskytte mod indfødte endonukleaser i værten cyanobacterium43. I denne protokol blev konjugering lettet af en MC1061 E. coli -stamme, der bærer mobilizer-og hjælpe vektorer pRK24 (henholdsvis www. addgeneorg/51950) og pRL528 (www.addgene.org/58495). Man skal være forsigtig, når man vælger de vektorer, der skal anvendes til konjugat overførsel. For eksempel, i CyanoGate kit den selvkopierende Cargo vektor pPMQAK1-T koder for en Mob protein12. Men, pSEVA421-T ikke44, og som sådan, Mob skal udtrykkes fra en egnet hjælper vektor. De vektorer, der anvendes, bør også være passende for målorganismen. For eksempel kræver effektiv konjugat overførsel i Anabaena Sp. pcc 7120 en hjælpe vektor, der beskytter mobilizer-vektoren mod fordøjelsen (f. eks. pRL623, som koder for de tre Methylaser Avaim, Eco47iiM og Ecot22iM)45, 46.
I denne protokol skitserer vi yderligere, hvordan man karakteriserer ydeevnen af dele (dvs. initiativtagere) med en fluorescerende markør ved hjælp af en plade læser eller et flow cytometer. Flowcytometre er i stand til at måle fluorescens på en enkelt celle basis for en stor population. Desuden giver flow cytometre brugerne mulighed for at "gate" de erhvervede data og fjerne baggrundsstøj (f. eks. fra partikler i kulturen eller kontaminering). I modsætning hertil erhverver plade læsere en samlet fluorescens måling af en given mængde kultur, typisk i flere replikat brønde. De vigtigste fordele ved plade læsere over cytometre omfatter lavere omkostninger, højere tilgængelighed og typisk ingen krav til specialsoftware til downstream-dataanalyser. De største ulemper ved plade læsere er den relativt lavere følsomhed sammenlignet med cytometre og potentielle problemer med den optiske tæthed af målte kulturer. Ved sammenlignende analyser skal prøveeksemplarer af plade læseren normaliseres for hver brønd (f. eks. til en måling af dyrkningstætheden, der typisk tages som absorbansen ved den optiske tæthed ved 750 nm [OD750]), hvilket kan føre til unøjagtigheder for prøver, der er for tætte og/eller ikke godt blandet (f. eks. når de er tilbøjelige til at aggregere eller flokkulering).
Som en oversigt, her viser vi i detaljer principperne for at generere niveau 0 dele, efterfulgt af hierarkisk samling ved hjælp af cyanogate kit og kloning i en vektor egnet til ægteskabelige overførsel. Vi viser derefter konjugal overførselsprocessen, udvælgelse af axeniske transconjugant stammer, der udtrykker en fluorescerende markør, og efterfølgende erhvervelse af fluorescens data ved hjælp af et flow flowcytometer eller en plade læser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0404</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (microbiology tested)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-500g</td>
			<td>Used in 8.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41026</td>
			<td>Used in 6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BpiI (BbsI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI (Eco31I)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0291</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>A1491.0005</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used in 4.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>Used in 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td>DNA extraction kit. Used in 5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega Microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td>Used in 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10021083</td>
			<td>Used in 2.3.1, 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10356553</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11815-024</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filters (0.45 &#956;m)</td>
			<td>MF-Millipore</td>
			<td>HAWP02500</td>
			<td>Used in 3.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) &#181;CLEAR</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td>Used in 4.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1020S</td>
			<td>Used in 1.1.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td>DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro incubator with LEDs</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>-</td>
			<td>Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21108</td>
			<td>Used in 7.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used in 2.3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 chemically competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td>Used in 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>K813</td>
			<td>Used in 4.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>Used in 1.1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load 1 kb DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0468S</td>
			<td>Used in Figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>72.692.210</td>
			<td>Used in 3.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>J61820.06</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>612U96</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill. Used in 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit

Cyanobakterier er en mangfoldig gruppe af prokaryotiske fotosyntetiske organismer, der kan modificeres genetisk til vedvarende produktion af brugbare industrivarer. Nylige fremskridt inden for syntetisk biologi har ført til udvikling af flere klonings værktøjssæt som cyanogat, et standardiseret modulært klonings system til opbygning af plasmid-vektorer til efterfølgende omdannelse eller ægteskabelige overførsel til cyanobakterier. Her skitserer vi en detaljeret metode til montering af en selvkopierende vektor (f. eks. med et fluorescerende markør udtryks kassette) og konjugeret overførsel af vektoren til cyanobakteriale stammer Synechocystis Sp. pcc 6803 eller Synechococcus elongatus utex 2973. Derudover skitserer vi, hvordan man karakteriserer udførelsen af en genetisk del (f. eks. en promotor) ved hjælp af en plade læser eller flow cytometri.

For at demonstrere den gyldne Gate assembly arbejdsgang, en Expression kassette blev samlet i niveau 1 position 1 (fremad) acceptor vektor (pICH47732), der indeholder følgende niveau 0 dele: promotoren af C-phycocyanin operon Pcpc560 (PC 0,005), kodnings sekvensen for eYFP (pC 0.008) og den dobbelte Terminator TrrnB (PC 0.082)12. Efter omdannelsen af samlings reaktionen blev vellykkede forsamlinger identificeret ved hjælp a...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Her præsenterer vi en protokol, der beskriver hvordan i) samler en selvkopierende vektor ved hjælp af den modulære CyanoGate klonings værktøjssæt, II) indfører vektoren i en cyanobakterial vært ved konjugering, og III) karakteriserer transgene cyanobakterier stammer ved hjælp af en plade læseren eller flowcytometri.

Genetisk modifikation af cyanobakterier ved konjugering ved hjælp af det modulære Cyanogat klonings værktøjssæt

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Cyanobakterier er en vigtig phylum af fotosyntetiske mikrober, der i stigende grad anerkendes som nyttige platforme for syntetisk biologi og vedvarende bioteknologi applikationer. Så udvikling af robuste teknikker til at forenkle design, kloning og indførelse af heterolog DNA i forskellige cyanobakterielle arter er vigtig. Så denne teknik viser en veletableret metode kaldet bøjning eller triparental parring for at indføre DNA i cyanobakterielle arter, der ikke er naturligt transformerbare.Bøjning er med succes blevet udført i en bred vifte af cyanobakterielle stammer fra encellede til flercellede filamentøse arter. Hvis du forsøger denne teknik for første gang, skal du passe på at håndtere både din cyanobakterielle og din E.coli stammer med omhu. For eksempel ikke centrifuge over de værdier, der er angivet i protokollen og ikke vortex.Blanding bakterier og Cyanobakterier kan synes mærkeligt at første gang brugere. Vi håber, at vi ved at demonstrere bøjningsprocessen vil bidrage til at afklare dette. Efter konstruktion af niveau et forsamlinger, skal du vælge et passende niveau T acceptor vektor.Vælg en passende ende link til ligate de tre primære ende af det endelige niveau en forsamling til niveau T rygraden. For at samle en eller flere niveau et forsamlinger i niveau T, forberede en reaktion mix med PBI1 og den nødvendige ende link vektor. Opsæt det termiske cykelprogram, og fortsæt i henhold til manuskriptet.På dag ét skal du dyrke cyanobakteriel kultur ved at oprette en ny kultur af Synechocystis PCC 6803 eller Synechococcus elongatus UTEX 2973. Med en varmesterilsøjle skrabes cellerne fra den axenic BG-11 agarplade og anbringes i en 100 milliliter konisk kolbe fyldt med 50 milliliter frisk BG-11 medium til at inokulere. Kolben anbringes i en rystende inkubator med belysning for at dyrke Synechocystis PCC 6803 cellekulturer ved 30 grader Celsius ved 100 omdr./min.For Synechococcus elongatus UTEX 2973 skal cellekulturerne vokses ved 40 grader Celsius ved 100 omdr./min. Efter en til to dage tegnes en milliliter cellekultur og måles på et spektrofotometer. Absorbansen ved OD 750 når 0,5 til 1,5.På dag to, vaccinere en MC1061 E.coli hjælper stamme indeholdende vektorer PRK24 og PRL528 i fem milliliter LB medium med ampicillin i en koncentration på 100 mikrogram per milliliter og chloramphenicol i en koncentration på 25 mikrogram per milliliter. Vokse ved 37 grader Celsius natten over på 225 RPM i en rystende inkubator. Derefter vaccineres fem milliliter LB-medium, der indeholder passende antibiotika med E.coli-kulturen, der bærer niveau T-lastvektoren.Dyrk kulturen ved 37 grader Celsius natten over på 225 RPM i en rystende inkubator. På dag tre, centrifuge hjælperen og lasten E.coli natten kulturer på 3, 000 g i 10 minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten uden at forstyrre cellepellet.Vask pellets ved at tilføje fem milliliter frisk LB medium uden antibiotika. Opspjæfte pellet ved forsigtigt pipettering op og ned og centrifuge for at fjerne supernatant. Gentag dette vasketrin tre gange for at fjerne resterende antibiotika fra natten kultur.Efter den sidste vask, resuspend cell pellet i halvdelen af mængden af LB medium af den oprindelige kultur volumen. Derefter kombineres 450 mikroliter af hjælperstammen med 450 mikroliter af laststammen i et to milliliterrør og lad ved stuetemperatur. Dernæst forberede cyanobakterielle kultur ved centrifugering en milliliter cyanobakterielle kultur på 1, 500 g i 10 minutter ved stuetemperatur.Kassér derefter supernatanten forsigtigt uden at forstyrre cellepellet. Vask pellet fire gange ved at tilføje frisk BG-11 medium af samme oprindelige volumen. Tilsæt 900 mikroliter af den vaskede cyanobakterielle kultur til 900 mikroliter af de kombinerede E.coli-stammer i et to milliliterrør.Bland kulturerne ved forsigtigt at pipettere op og ned. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 30 minutter for Synechocystis PCC 6803 eller to timer for Synechococcus elongatus UTEX 2973. Centrifuge blandingen ved 1, 500 g i 10 minutter ved stuetemperatur.Fjern 1,6 milliliter af supernatanten og opsbrug pellet i den resterende supernatant. Placer en 0,45 mikron membran filter på en LB BG-11 agar plade uden antibiotika. Spred omhyggeligt 200 mikroliter af E.coli/cyanobakterielle kulturblanding på membranen med en steril spreder eller en steril bøjet spids.Pladen forsegles med paraffinfilm, og pladen hældes i en oplyst inkubator i 24 timer. Efter 24 timer, omhyggeligt overføre membranen ved hjælp af flamme steriliserede snævler til en frisk BG-11 agar plade, der indeholder passende antibiotika til at vælge til lasten vektor. Pladen forsegles med paraffinfilm og inkuberes under de samme betingelser som tidligere, indtil kolonierne vises.Kolonier vises typisk efter 7-14 dage for Synechocystis PCC 6803 og 3-7 dage for Synechococcus elongatus UTEX 2973. For at vælge konjugants, ved hjælp af en varme steril inoculating stang, skal du vælge mindst to individuelle kolonier fra membranen og streak på en ny BG-11 agar plade, der indeholder passende antibiotika. Derefter indokeres en stribe cyanobakteriel kultur i et 15 millilitercentrifugerør indeholdende fem milliliter LB-medium og inkuberes ved 37 grader Celsius natten over ved 225 omdr./min. i en rystende inkubator.Den klare kultur bekræfter fraværet af E.coli-forurening. Efter en tilstrækkelig vækstperiode på syv dage skal du vælge individuelle økseniske kolonier for at oprette flydende kulturer til langtidsbyoopbevaring eller efterfølgende eksperimenter. I denne undersøgelse blev golden gate assembly workflow demonstreret.Efter omdannelsen af samlingsreaktionen blev vellykkede forsamlinger identificeret ved hjælp af standardblå hvid screening af E.coli-kolonier. EYFP-udtrykskassetten i niveau et vektor og endelinket en vektor blev derefter samlet i en niveau T-acceptorvektor for at give vektoren cpcBA-eYFP. Den samlede cpcBA-eYFP vektor blev verificeret af begrænsning fordøjelse.Vellykket ægteskabelig overførsel af cpcBA-eYFP eller pPMQAK1-T vektor resulterede i vækst på op til flere hundrede kolonier på membranen for Synechocystis PCC 6803 og Synechococcus elongatus UTEX 2973. Som forventet for den stærke Pcpc560 promotor var værdierne for normaliseret eYFP fluorescens fra pladelæseren og eYFP fluorescens per celle fra flowcytometeret høje sammenlignet med den negative kontrol. Med både pladelæseren og flowcytometeret var fluorescensværdierne højere i Synechococcus elongatus UTEX 2973 end i Synechocystis PCC 6803.Sørg for, at du inkuberer i den mindste tid, i henhold til hvilken stamme du konjugerer.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Et højt indhold Imaging Workflow til Uddannelse Grb2 signalering Komplekser ved ekspressionskloning

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genetisk modifikation og Rekombination af spytkirtel organkulturer

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fækal Glukokortikoid Analyse: Non-invasive Adrenal Overvågning i dyr fra hestefamilien

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporation, Isolering og Imaging af -myofibre

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig måling af Mitokondriel Calcium og mitokondriemembranen Potentiale i levende celler ved Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering af DNA jordpakning i cyanobakterier af høj spænding Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

En rørledning, der bruger bilateral in Utero Electroporation til at afhøre genetiske påvirkninger af gnaveradfærd

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...