Name: genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit
Uploaded: 2019-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

De auteurs zijn dankbaar voor de FYCONET biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council (BBSRC) netwerk in de industriële biotechnologie en bio-energie (NIBB) en de industriële biotechnologie Innovation Centre (IBioIC) voor financiële ondersteuning. GARG, AASO en AP erkennen financieringssteun van het BBSRC EASTBIO CASE PhD programma (grantnummer BB/M010996/1), het Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) PhD programma, en het IBioIC-BBSRC collaborative training Partnership (CTP) PhD programma, Respectievelijk. We danken Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London), en Poul Eric Jensen en Julie Anne Marie Zita Zedler (Universiteit van Kopenhagen) voor plasmide vector-en Protocol bijdragen en advies.

1. vector assemblage met behulp van de plant MoClo en CyanoGate toolkits
Opmerking: voordat u doorgaat met de vector assemblage, is het sterk aanbevolen dat gebruikers zich vertrouwd maken met de vector niveau structuren van de plant en cyanogate moclo systemen12,15.
<ol><li>Bouw van onderdelen van niveau 0 Opmerking: onderdelen van niveau 0 kunnen worden gesynthetiseerd als volledige vectoren of als lineaire sequenties voor assem...

Golden Gate Assembly heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere vector assemblage methoden, met name in termen van schaalbaarheid20,21. Niettemin, het opzetten van de Golden Gate systeem in een Lab vergt tijd om een vertrouwdheid met de verschillende onderdelen en acceptor vector bibliotheken en algemene assemblageprocessen te ontwikkelen. Een zorgvuldige planning is vaak nodig voor complexere assemblages of bij het parallel uitvoeren van een groot aan...

Cyanobacteriën zijn autotrofische bacteriën die kunnen worden gebruikt voor de biosynthese van een breed scala aan natuurlijke en heterologeuze hoge waarde metabolische producten1,2,3,4,5, 6. Er moeten nog verschillende hindernissen worden overwonnen om hun commerciële levensvatbaarheid te vergroten, met name de relatief slechte opbrengsten in vergelijking met heterotrofische bio-platformen (bijv. Escherichia coli en gist)7. De recente uitbreiding van de beschikbare genetische manipulatie tools en de opname van het synthetische biologie paradigma in cyanobacteriaal onderzoek helpt om dergelijke uitdagingen te overwinnen en cyanobacteriën verder te ontwikkelen als efficiënte biofabrieken8, 9,10.
De belangrijkste benaderingen voor de introductie van DNA in cyanobacteriën zijn transformatie, conjugatie en elektroporation. De vectoren die door transformatie of elektroporation naar cyanobacteriën worden overgebracht, zijn "zelfmoord vectoren" (d.w.z. integratieve vectoren die homologe recombinatie mogelijk maken), terwijl zelfreplicerende vectoren kunnen worden overgebracht naar cyanobacteriën door transformatie, conjugatie of elektroporation. Voor de eerste, een protocol is beschikbaar voor de technische model soorten die geschikt zijn voor natuurlijke transformatie11. Meer recentelijk is een modulaire kloon (MoClo) Toolkit voor cyanobacteriën genaamd CyanoGate ontwikkeld die een gestandaardiseerde Golden Gate vector assemblage methode gebruikt voor engineering met behulp van natuurlijke transformatie, elektroporation of conjugatie12.
Golden Gate-type assemblage technieken zijn in de afgelopen jaren steeds populairder geworden, en assemblage standaarden en deel bibliotheken zijn nu beschikbaar voor een verscheidenheid aan organismen13,14,15,16 ,17. Golden Gate gebruikt type IIS restrictie enzymen (bijv. bsai, bpii, bsmbi, btgzi en AarI) en een pak acceptoren en unieke uitsteeklengten om directionele hiërarchische assemblage van meerdere sequenties in een "One pot" assembly reactie te faciliteren. Type IIS restrictie enzymen herkennen een unieke asymmetrische sequentie en knippen een gedefinieerde afstand van hun herkennings locaties om een gespreide, "Sticky end" snede te genereren (meestal een 4 nucleotide [NT] overhang), die vervolgens kan worden benut om bestelde DNA te bestellen montage reacties15,18. Dit heeft de ontwikkeling vergemakkelijkt van grote bibliotheken van modulaire niveau 0-onderdelen (bijv. promotors, open reading frames en terminators) gedefinieerd door een gemeenschappelijke syntaxis, zoals de PhytoBricks Standard19. Niveau 0-onderdelen kunnen dan gemakkelijk worden geassembleerd in Expression cassettes van niveau 1, waarna complexere hogere bestel assemblages (bijvoorbeeld multigene Expression constructies) kunnen worden ingebouwd in een accepterende vector van keuze12,15. Een belangrijk voordeel van Golden Gate-type assemblage technieken is hun geschiktheid voor automatisering bij High-throughput faciliteiten, zoals DNA-gieterijen20,21, die kunnen leiden tot het testen van complexe experimentele ontwerpen die kan niet gemakkelijk worden bereikt door handmatige arbeid.
Cyanogate bouwt voort op de gevestigde plant moclo System12,15. Om een nieuw onderdeel in CyanoGate op te nemen, moet de deel volgorde eerst gedomesticeerd worden, d.w.z. "illegale" herkennings locaties voor BsaI en BpiI moeten worden verwijderd. In het geval van een deel codering voor een open Lees frame (d.w.z. een codeer volgorde, CD'S), kunnen herkennings plaatsen worden verstoord door het genereren van synoniemen mutaties in de sequentie (d.w.z. het veranderen van een codon naar een alternatief dat codeert voor hetzelfde aminozuur residu). Dit kan worden bereikt door een verscheidenheid aan benaderingen, variërend van DNA-synthese tot polymerase chain reaction (PCR) amplificatie strategieën zoals Gibson assembly22. Afhankelijk van de uitdrukkings gastheer die wordt gebruikt, moet worden gezorgd om de introductie van zeldzame Codons te voorkomen die de efficiëntie van translatie23kunnen remmen. Het verwijderen van herkennings locaties in promoter en Terminator-reeksen is meestal een risicovollere inspanning, omdat wijzigingen de functie kunnen beïnvloeden en het onderdeel mogelijk niet zoals verwacht presteert. Bijvoorbeeld, veranderingen in de putatieve transcriptiefactor binding sites of de ribosoom binding site binnen een organisator kunnen de kracht en het reactievermogen op inductie/onderdrukking veranderen. Evenzo kunnen wijzigingen in belangrijke Terminator-structurele kenmerken (bijv. de GC Rich stam, lus en poly-U tail) de terminatie efficiëntie en het effect van genexpressie24,25veranderen. Hoewel er verschillende online bronnen beschikbaar zijn om de activiteit van de Promoter-en Terminator-sequenties te voorspellen en te informeren of een voorgestelde mutatie invloed zal hebben op de prestaties26,27, zijn deze gereedschappen vaak slechte voorspellers van prestaties in cyanobacteriën28,29,30.. Als zodanig wordt in vivo de karakterisering van gewijzigde delen nog steeds aanbevolen om de activiteit te bevestigen. Om te helpen bij het klonen van recalcitrante sequenties, bevat cyanogate een lage kopie kloon acceptor vector gebaseerd op de biobrick vector pSB4K512,16,31. Verder is er een "Design and build" portaal beschikbaar via de Edinburgh Genome Foundry om te helpen met Vector Design (dab.genomefoundry.org). Tot slot, en nog belangrijker, bevat CyanoGate twee niveau T acceptor vector ontwerpen (equivalent aan niveau 2 acceptor vectoren)15 voor de invoering van DNA in cyanobacteriën met behulp van zelfmoord vectoren, of brede host-Range vectoren die in staat zijn zelfreplicatie in verschillende cyanobacteriële soorten32,33,34.
Hier zullen we ons concentreren op het beschrijven van een protocol voor het genereren van niveau T zichzelf replicerende vectoren en de genetische modificatie van synechocystis pcc 6803 en Synechococcus elongatus Utex 2973 (synechocystis PCC 6803 en S. elongatus Utex 2973 hierna) door conjugatie (ook bekend als Tri-Parental paring). Conjugal overdracht van DNA tussen bacteriële cellen is een goed beschreven proces en is eerder gebruikt voor technische cyanobacteriële soorten, in het bijzonder die welke niet van nature competent zijn, zoals S. elongatus utex 297335, 36,37,38,39,40,41. In het kort worden cyanobacteriële culturen geïnnobeerd met een E. coli stam die de vector draagt die moet worden overgebracht (de "lading" vector) en vectoren (hetzij in dezelfde E. coli stam of in extra stammen) om conjugatie mogelijk te maken ("mobilizer" en "helper" vectoren). Er zijn vier belangrijke voorwaarden vereist voor de overdracht van conjugaat: 1) direct contact tussen cellen die betrokken zijn bij DNA-overdracht, 2) de lading vector moet verenigbaar zijn met het conjugatiesysteem (d.w.z.moet een geschikte herkomst van de overbrenging bevatten; ook bekend als een bom (basis van mobiliteit) site), 3) een DNA-nikkel-eiwit (bijv. gecodeerd door het Mob -gen) dat het DNA van de orit om één streng overdracht van het DNA in het cyanobacterium te initiëren moet aanwezig zijn en uitgedrukt van de lading of de hulp vectoren, en 4) het overgedragen DNA mag niet worden vernietigd in de ontvangende cyanobacterium (d.w.z. moet resistent zijn tegen afbraak door bijvoorbeeld een restrictie-activiteit van de endonuclease)35,42. Om de lading vector te behouden, moet de oorsprong van de replicatie verenigbaar zijn met de ontvanger cyanobacterium om zelfreplicatie en proliferatie in dochtercellen na de splitsing mogelijk te maken. Om te helpen met de voorwaarden 3 en 4, zijn verschillende hulp vectoren beschikbaar via addgene en andere commerciële bronnen die coderen voor Mob en verschillende methylases om te beschermen tegen inheemse enzym in de gastheer cyanobacterium43. In dit protocol werd conjugatie vergemakkelijkt door een MC1061 E. coli stam met mobilizer en helper vectoren pRK24 (www. addgeneorg/51950) en pRL528 (www.addgene.org/58495), respectievelijk. Zorg moet worden genomen bij het kiezen van de vectoren te gebruiken voor echtelijke overdracht. Bijvoorbeeld, in de CyanoGate Kit de zelf-replicerende Cargo vector pPMQAK1-T codeert voor een Mob proteïne12. Echter, pSEVA421-T niet44, en als zodanig, Mob moet worden uitgedrukt uit een geschikte helper vector. De gebruikte vectoren moeten ook geschikt zijn voor het doelorganisme. Efficiënte echtelijke overdracht in Anabaena SP. PCC 7120 vereist bijvoorbeeld een hulp vector die de mobilizer vector beschermt tegen de spijsvertering (bijv. pRL623, die codeert voor de drie methylases avaim, Eco47iiM en Ecot22iM)45, 46.
In dit protocol beschrijven we verder hoe de prestaties van onderdelen (d.w.z. promotors) karakteriseren met een fluorescerende marker met behulp van een plaat lezer of een flow-cytometer. Flow-Cytometers kunnen fluorescentie op één celbasis meten voor een grote populatie. Bovendien stellen Flow Cytometers gebruikers in staat om de verkregen gegevens te "hek" en achtergrondruis te verwijderen (bijvoorbeeld van deeltjes in de cultuur of verontreiniging). Plaat lezers krijgen daarentegen een geaggregeerde fluorescentie meting van een bepaald volume cultuur, meestal in verschillende replicaatputten. De belangrijkste voordelen van plaat lezers boven Cytometers zijn de lagere kosten, hogere beschikbaarheid en meestal geen vereiste voor specialistische software voor downstream data-analyses. De belangrijkste nadelen van plaat lezers zijn de relatief lagere gevoeligheid in vergelijking met Cytometers en mogelijke problemen met de optische dichtheid van gemeten culturen. Voor vergelijkende analyses moeten plaat lezers monsters voor elke put worden genormaliseerd (bijvoorbeeld voor een meting van de cultuur dichtheid, gewoonlijk genomen als de extinctie bij de optische dichtheid bij 750 nm [OD750]), wat kan leiden tot onnauwkeurigheden voor monsters die te dicht en/of niet goed gemengd (bijv. Wanneer het gevoelig is voor aggregatie of flocculatie).
Als een overzicht tonen we hier in detail de principes van het genereren van niveau 0-onderdelen, gevolgd door hiërarchische assemblage met behulp van de cyanogate-Kit en klonen in een vector die geschikt is voor echtelijke overdracht. Vervolgens demonstreren we het echtelijke overdrachtsproces, selectie van Axenische-transconjugerende stammen die een fluorescerende marker uitdrukken, en daaropvolgende overname van fluorescentie gegevens met behulp van een flow-cytometer of een plaat lezer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0404</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (microbiology tested)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-500g</td>
			<td>Used in 8.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41026</td>
			<td>Used in 6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BpiI (BbsI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI (Eco31I)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0291</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>A1491.0005</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used in 4.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>Used in 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td>DNA extraction kit. Used in 5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega Microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td>Used in 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10021083</td>
			<td>Used in 2.3.1, 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10356553</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11815-024</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filters (0.45 &#956;m)</td>
			<td>MF-Millipore</td>
			<td>HAWP02500</td>
			<td>Used in 3.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) &#181;CLEAR</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td>Used in 4.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1020S</td>
			<td>Used in 1.1.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td>DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro incubator with LEDs</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>-</td>
			<td>Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21108</td>
			<td>Used in 7.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used in 2.3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 chemically competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td>Used in 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>K813</td>
			<td>Used in 4.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>Used in 1.1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load 1 kb DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0468S</td>
			<td>Used in Figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>72.692.210</td>
			<td>Used in 3.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>J61820.06</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>612U96</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill. Used in 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit

Cyanobacteria zijn een gevarieerde groep prokaryotische fotosynthetische organismen die genetisch gemodificeerd kunnen worden voor de hernieuwbare productie van nuttige industriële grondstoffen. Recente ontwikkelingen in de synthetische biologie hebben geleid tot de ontwikkeling van diverse kloon toolkits zoals cyanogate, een gestandaardiseerd modulair kloon systeem voor het bouwen van plasmide vectoren voor latere transformatie of echtelijke overdracht in cyanobacteriën. Hier schetsen we een gedetailleerde methode voor het assembleren van een zelf-replicerende vector (bijv. met een fluorescerende marker Expression cassette) en echtelijke overdracht van de vector in de cyanobacteriële stammen synechocystis SP. PCC 6803 of synechococcus elongatus utex 2973. Daarnaast beschrijven we hoe u de prestaties van een genetisch deel (bijv. een promotor) karakteriseren met behulp van een plaat lezer of Flowcytometrie.

Om de Golden Gate assembly workflow te demonstreren, werd een Expression cassette geassembleerd in de niveau 1 positie 1 (voorwaartse) acceptor vector (pICH47732) met de volgende niveau 0 onderdelen: de promotor van de C-phycocyanin operon Pcpc560 (PC 0,005), de programmeer volgorde voor eYFP (pC 0.008) en de dubbele Terminator TRrnb (PC 0.082)12. Na de transformatie van de assemblage reactie werden succesvolle assemblages ge...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van hoe ik) een zelfreplicerende vector met behulp van de cyanogate modulaire kloon Toolkit, II), introduceren de vector in een cyanobacterial gastheer door conjugatie, en III) karakteriseren transgene cyanobacteriën stammen met behulp van een plaat lezer of flow cytometrie.

Genetische modificatie van cyanobacteriën door conjugatie met behulp van de CyanoGate modulaire kloon Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Cyanobacteriën zijn een belangrijk phylum van fotosynthetische microben die steeds meer worden erkend als nuttige platforms voor synthetische biologie en toepassingen van hernieuwbare biotechnologie. Het is dus belangrijk om robuuste technieken te ontwikkelen om het ontwerp, klonen en introductie van heterologe DNA in verschillende cyanobacteriële soorten te vereenvoudigen. Deze techniek toont een gevestigde methode aan, vervoeging of triparental paring genoemd voor het introduceren van DNA in cyanobacteriële soorten die niet van nature getransformeerd zijn.Vervoeging is met succes uitgevoerd in een breed scala van cyanobacteriële stammen van eencellige tot meercellige filamenteuze soorten. Als u probeert deze techniek voor de eerste keer, zorg ervoor dat zowel uw cyanobacteriële en uw E.coli stammen met zorg te behandelen. Bijvoorbeeld, niet centrifugeren boven de waarden in het protocol en niet vortex.Het mengen van bacteriën en Cyanobacteriën lijkt misschien vreemd voor de eerste keer gebruikers. Wij hopen dat wij door het vervoegingsproces te demonstreren, zullen helpen dit te verduidelijken. Na de bouw van niveau een assemblages, kies een geschikt niveau T acceptor vector.Kies een geschikte eindkoppeling om het drietal van het uiteindelijke level één-assemblage te verbinden met de niveau T-backbone. Als u een of meer niveau één samenstellingen in niveau T wilt assembleren, bereidt u een reactiemix voor met PBI1 en de vereiste eindkoppelingsvector. Stel het thermische cycler programma in en ga verder volgens het manuscript.Kweek op dag één de cyanobacteriële cultuur door een frisse cultuur van Synechocystis PCC 6803 of Synechococcus elongatus UTEX 2973 op te zetten. Schraap met een warmtesteriele lus de cellen van de axenic BG-11 agarplaat en plaats in een 100 milliliter conische kolf gevuld met 50 milliliter verse BG-11 medium om in te enten. Plaats de kolf in een schuddende couveuse met verlichting om de Synechocystis PCC 6803 celculturen te laten groeien bij 30 graden Celsius bij 100 RPM.Voor Synechococcus elongatus UTEX 2973, groeien de celculturen op 40 graden Celsius bij 100 RPM. Teken na één tot twee dagen een milliliter van de celcultuur en meet op een spectrofotometer. De absorptie bij OD 750 bereikt 0,5 tot 1,5.Op dag twee inenteert u een MC1061 E.coli helperstam met vectoren PRK24 en PRL528 in vijf milliliter LB-medium met ampicilline bij een concentratie van 100 microgram per milliliter en chloorramphenicol bij een concentratie van 25 microgram per milliliter. Groeien op 37 graden Celsius 's nachts op 225 RPM in een schudden incubator. Dan inenting vijf milliliter van LB medium met geschikte antibiotica met de E.coli cultuur die het niveau T lading vector.Kweek de cultuur op 37 graden Celsius 's nachts op 225 RPM in een schudden incubator. Op dag drie, centrifuge de helper en de lading E.coli 's nachts culturen op 3,000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant weg zonder de celpellet te verstoren.Was de pellets door het toevoegen van vijf milliliter verse LB medium zonder antibiotica. Resuspend de pellet door zachtjes pipetten op en neer en centrifuge om de supernatant te verwijderen. Herhaal deze wasstap drie keer om resterende antibiotica uit de nachtcultuur te verwijderen.Na de laatste wasbeurt, resuspend de cel pellet in de helft van het volume van LB medium van de initiële cultuur volume. Combineer vervolgens 450 microliter van de helperstam met 450 microliters van de ladingssoort in een twee milliliter buis en laat op kamertemperatuur. Bereid vervolgens de cyanobacteriële cultuur voor door een milliliter cyanobacteriële cultuur op 1, 500 g gedurende 10 minuten op kamertemperatuur te centrifugeren.Gooi vervolgens de supernatant voorzichtig weg zonder de celpellet te verstoren. Was de pellet vier keer door het toevoegen van verse BG-11 medium van hetzelfde initiële volume. Voeg 900 microliter van de gewassen cyanobacteriële cultuur toe aan 900 microliter van de gecombineerde E.coli-stammen in een twee milliliterbuis.Meng de culturen door zachtjes pipetten op en neer. Incubeer het mengsel op kamertemperatuur gedurende 30 minuten voor Synechocystis PCC 6803 of twee uur voor Synechococcus elongatus UTEX 2973. Centrifugeren het mengsel op 1, 500 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder 1,6 milliliter van de supernatant en resuspend de pellet in de resterende supernatant. Plaats een 0,45 micron membraanfilter op een LB BG-11 agar plaat zonder antibiotica. Zorgvuldig verspreid 200 microliters van de E.coli/cyanobacteriële cultuur mix op het membraan met een steriele spreader of een steriele gebogen tip.Verzegel de plaat met paraffinefolie en plaats de plaat 24 uur in een verlichte couveuse. Breng het membraan na 24 uur voorzichtig over met vlamgesteriliseerde tangen naar een verse BG-11 agarplaat met geschikte antibiotica om te selecteren voor de ladingsvector. Verzegel de plaat met paraffinefilm en incubbate onder dezelfde omstandigheden als voorheen totdat er kolonies verschijnen.Kolonies verschijnen meestal na 7-14 dagen voor Synechocystis PCC 6803 en 3-7 dagen voor Synechococcus elongatus UTEX 2973. Om vervoeging te selecteren, selecteert u met behulp van een warmtesteriele inenterende staaf ten minste twee afzonderlijke kolonies uit het membraan en streept u op een nieuwe BG-11 agarplaat met geschikte antibiotica. Dan inenting een streep van cyanobacteriële cultuur in een 15 milliliter centrifuge buis met vijf milliliter LB medium en incubaat bij 37 graden Celsius 's nachts bij 225 RPM in een schudden incubator.De duidelijke cultuur bevestigt de afwezigheid van E.coli besmetting. Na een voldoende groeiperiode van zeven dagen, kies individuele axenic kolonies op te zetten vloeibare culturen voor de lange termijn cryo opslag of latere experimenten. In deze studie werd de golden gate assembly workflow gedemonstreerd.Na de transformatie van de assemblagereactie werden succesvolle assemblages geïdentificeerd met behulp van standaard blauwwitte screening van E.coli kolonies. De eYFP-expressiecassette in de vector van niveau één en de eindkoppeling één vector werden vervolgens geassembleerd in een niveau T acceptor vector om de vector cpcBA-eYFP te geven. De geassembleerde cpcBA-eYFP vector werd geverifieerd door beperking spijsvertering.Succesvolle echtelijke overdracht van cpcBA-eYFP of de pPMQAK1-T vector resulteerde in de groei van maximaal enkele honderden kolonies op het membraan voor Synechocystis PCC 6803 en Synechococcus elongatus UTEX 2973. Zoals verwacht voor de sterke Pcpc560 promotor, de waarden voor genormaliseerde eYFP fluorescentie van de plaatlezer en eYFP fluorescentie per cel van de stroom cytometer waren hoog in vergelijking met de negatieve controle. Met zowel de plaatlezer als de stroomcytometer waren de fluorescentiewaarden hoger in Synechococcus elongatus UTEX 2973 dan in Synechocystis PCC 6803.Zorg ervoor dat u incubeer voor de minimale tijd volgens welke stam u vervoeging.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Dubbele Hele Mount in situ hybridisatie van het vroege embryo&#39;s Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

Test voor Neurale Inductie in het kippenembryo

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Een High-inhoud Imaging Workflow om Grb2 signaalcomplexen Studie door Expression Klonen

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genetische Modificatie en recombinatie van speekselklier Orgel culturen

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecale Glucocorticoïd Analyse: Niet-invasieve bijnier Toezicht op Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporatie, Isolatie en beeldvorming van myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisatie van DNA verdichting in cyanobacteriën door hoogspannings-Cryo-Elektronentomografie

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

Een pijpleiding die bilaterale in Utero-elektroporatie gebruikt om genetische invloeden op knaagdiergedrag te ondervragen

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...