Name: genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit
Uploaded: 2019-10-31T15:00:00
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Die Autoren danken dem PHYCONET Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) Network in Industrial Biotechnology and Bioenergy (NIBB) und dem Industrial Biotechnology Innovation Centre (IBioIC) für die finanzielle Unterstützung. GARG, AASO und AP würdigen die finanzielle Unterstützung aus dem BBSRC EASTBIO CASE PhD-Programm (Grant-Nummer BB/M010996/1), dem Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) PhD-Programm und dem IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP) PhD-Programm, in dieser reihenfolge. Wir danken Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London) und Poul Eric Jensen und Julie Annemarie Zita Zedler (Universität Kopenhagen) für Plasmidvektor- und Protokollbeiträge und Beratung.

1. Vektormontage mit den Toolkits Plant MoClo und CyanoGate
HINWEIS: Bevor Sie mit der Vektorbaugruppe fortfahren, wird dringend empfohlen, dass benutzer sich mit den Vektorebenenstrukturen der Plant- und CyanoGate MoClo-Systeme12,15 vertrautmachen.
<ol><li>Konstruktion von Teilen der Stufe 0 HINWEIS: Teile der Ebene 0 können als vollständige Vektoren oder als lineare Sequenzen für die Baugruppe mit Level 0-Akzeptoren (z. B. Bl...

Golden Gate Montage hat mehrere Vorteile im Vergleich zu anderen Vektor-Montage-Methoden, vor allem in Bezug auf Skalierbarkeit20,21. Dennoch erfordert die Einrichtung des Golden Gate-Systems in einem Labor Zeit, um eine Vertrautheit mit den verschiedenen Teilen und Akzeptor-Vektorbibliotheken und gesamten Montageprozessen zu entwickeln. Für komplexere Baugruppen oder bei der parallelen Ausführung einer großen Anzahl komplexer Baugruppen (z. B. beim Erstellen ...

Cyanobakterien sind autotrophe Bakterien, die für die Biosynthese einer Vielzahl von natürlichen und heterologen hochwertigenStoffwechselprodukten1,2,3,4,5, 6. Es müssen noch einige Hürden überwunden werden, um ihre wirtschaftliche Lebensfähigkeit zu erhöhen, vor allem die relativ geringen Erträge im Vergleich zu heterotrophen Bioplattformen (z. B. Escherichia coli und Hefe)7. Die jüngste Erweiterung der verfügbaren gentechnischen Werkzeuge und die Übernahme des synthetischen Biologie-Paradigmas in der zyanobakteriellen Forschung trägt dazu bei, solche Herausforderungen zu überwinden und Cyanobakterien als effiziente Biofabriken weiterzuentwickeln8, 9,10.
Die wichtigsten Ansätze zur Einführung von DNA in Cyanobakterien sind Transformation, Konjugation und Elektroporation. Die DurchTransformation oder Elektroporation auf Cyanobakterien übertragenen Vektoren sind "Selbstmordvektoren" (d. h. integrative Vektoren, die eine homologe Rekombination erleichtern), während sich selbst replizierende Vektoren durch Transformation, Konjugation oder Elektroporation. Für erstere steht ein Protokoll für technische Modellarten zur Verfügung, die für die natürliche Transformation geeignet sind11. In jüngerer Zeit wurde ein modulares Klonen (MoClo) Toolkit für Cyanobakterien namens CyanoGate entwickelt, das ein standardisiertes Golden Gate Vektormontageverfahren für die Konstruktion mit natürlicher Transformation, Elektroporation oder Konjugation12verwendet.
Golden Gate-Typ Montagetechniken sind in den letzten Jahren immer beliebter geworden, und Montagestandards und Teilebibliotheken sind jetzt für eine Vielzahl von Organismenverfügbar 13,14,15,16 ,17. Golden Gate verwendet Typ IIS-Restriktionsenzyme (z. B. BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI und AarI) und einen Anzug von Akzeptoren und einzigartigen Überhängen, um die richtungsweisende hierarchische Montage mehrerer Sequenzen in einer "One Pot"-Montagereaktion zu erleichtern. Typ-IIS-Restriktionsenzyme erkennen eine eindeutige asymmetrische Sequenz und schneiden einen definierten Abstand von ihren Erkennungsstellen, um einen gestaffelten "klebrigen Ende"-Schnitt (typischerweise ein 4-Nukleotid-Überhang) zu erzeugen, der anschließend genutzt werden kann, um geordnete DNA anzutreiben. Montagereaktionen15,18. Dies hat die Entwicklung großer Bibliotheken modularer Level 0-Teile (z. B. Promoter, offene Leserahmen und Terminatoren) ermöglicht, die durch eine gemeinsame Syntax definiert sind, wie z. B. der PhytoBricks-Standard19. Teile der Ebene 0 können dann leicht zu Expressionkassetten der Ebene 1 zusammengebaut werden, woraufhin komplexere Baugruppen höherer Ordnung (z. B. Multigenexpressionskonstrukte) in einem Akzeptorvektor der Wahl12,15erstellt werden können. Ein wesentlicher Vorteil der Montagetechniken vom Typ Golden Gate ist ihre Automatisierung simperbar in Hochdurchsatzanlagen wie DNA-Gießereien20,21, die das Testen komplexer experimenteller Konstruktionen ermöglichen können, die nicht leicht durch manuelle Arbeit erreicht werden können.
CyanoGate baut auf dem etablierten Plant MoClo System12,15auf. Um ein neues Teil in CyanoGate zu integrieren, muss zunächst die Teilesequenz domestiziert werden, d.h. "illegale" Erkennungsseiten für BsaI und BpiI müssen entfernt werden. Im Falle eines Teils, das für einen offenen Leserahmen kodiert (d. h. eine Codierungssequenz, CDS), können Erkennungsstellen gestört werden, indem synonyme Mutationen in der Sequenz erzeugt werden (d. h. ein Codon in eine Alternative umwandelt, die für denselben Aminosäurerest kodiert). Dies kann durch eine Vielzahl von Ansätzen erreicht werden, von der DNA-Synthese bis zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Amplifikations-basierte Strategien wie Gibson-Montage22. Je nach verwendeter Expression des Hosts sollte darauf geachtet werden, die Einführung seltener Codons zu vermeiden, die die Effizienz der Übersetzung23hemmen könnten. Das Entfernen von Erkennungsstellen in Promoter- und Terminatorsequenzen ist in der Regel ein riskanteres Unterfangen, da Änderungen die Funktion beeinträchtigen können und das Teil möglicherweise nicht wie erwartet funktioniert. Beispielsweise können Änderungen an vermeintlichen Transkriptionsfaktorbindungsstellen oder der Ribosombindungsstelle innerhalb eines Promotors die Stärke und Reaktionsfähigkeit auf Induktion/Repression verändern. Ebenso können Änderungen an wichtigen Terminatorstrukturmerkmalen (z. B. GC-Rich-Stamm, Schleife und Poly-U-Schwanz) die Beendigungseffizienz ändern und die Genexpression24,25effektieren. Obwohl mehrere Online-Ressourcen zur Verfügung stehen, um die Aktivität von Promotor- und Terminatorsequenzen vorherzusagen und zu informieren, ob eine vorgeschlagene Mutation die Leistung26,27beeinflusst, sind diese Tools oft schlechte Prädiktoren für Leistung bei Cyanobakterien28,29,30.. Daher wird weiterhin die In-vivo-Charakterisierung modifizierter Teile empfohlen, um die Aktivität zu bestätigen. Um das Klonen widerspenstiger Sequenzen zu unterstützen, enthält CyanoGate einen Low Copy Cloning Acceptor Vector, der auf dem BioBrick-Vektor pSB4K512,16,31basiert. Darüber hinaus steht über die Edinburgh Genome Foundry ein "Design and Build"-Portal zur Verfügung, um beim Vector Design (dab.genomefoundry.org) zu helfen. Schließlich, und das ist am wichtigsten, CyanoGate enthält zwei Level T Akzeptor-Vektor-Designs (entspricht Level 2-Akzeptor-Vektoren)15 für die Einführung von DNA in Cyanobakterien mit Selbstmordvektoren oder breite Host-Range-Vektoren, die in der Lage sind, sich selbst zu reproduzieren in mehreren cyanobakteriellen Arten32,33,34.
Hier konzentrieren wir uns auf die Beschreibung eines Protokolls zur Erzeugung von selbstreplizierenden Vektoren der Stufe T und der genetischen Veränderung von Synechocystis PCC 6803 und Synechococcus elongatus UTEX 2973 (Synechocystis PCC 6803 und S. elongatus UTEX 2973 im Folgenden) durch Konjugation (auch bekannt als dreieltes Paarung). Der konjugale Transfer von DNA zwischen Bakterienzellen ist ein gut beschriebenes Verfahren und wurde zuvor für die Entwicklung von cyanobakteriellen Arten verwendet, insbesondere solche, die nicht natürlich kompetent sind, wie S. elongatus UTEX 297335, 36,37,38,39,40,41. Kurz gesagt, cyanobakterielle Kulturen werden mit einem E. coli-Stamm mit dem zu übertragenden Vektor (dem "Cargo"-Vektor) und Vektoren (entweder im selben E. coli-Stamm oder in zusätzlichen Stämmen) inkubiert, um eine Konjugation zu ermöglichen ("Mobilizer" und "Helfer"-Vektoren). Für die eheliche Übertragung sind vier Schlüsselvoraussetzungen erforderlich: 1) direkter Kontakt zwischen Zellen, die an der DNA-Übertragung beteiligt sind, 2) der Ladungsvektor muss mit dem Konjugationssystem kompatibel sein (d. h. er muss einen geeigneten Ursprung der Übertragung enthalten (oriT), auch bekannt als bom (Basis der Mobilität) Site), 3) ein DNA-Nickelprotein (z. B. durch das Mob-Gen kodiert), das DNA am OriT nickt, um einsträngige Übertragung der DNA in das Cyanobacterium zu initiieren, muss vorhanden und exprimiert sein von der Ladung oder den Helfervektoren, und 4) darf die übertragene DNA nicht im Empfängercyanobacterium zerstört werden (d. h. muss resistent gegen Abbau sein, z. B. durch Einschränkung endonuklease-Aktivität)35,42. Damit der Frachtvektor erhalten bleibt, muss der Ursprung der Replikation mit dem Empfänger-Cyanobacterium kompatibel sein, um die Selbstreplikation und Proliferation in Tochterzellen nach der Teilung zu ermöglichen. Um die Bedingungen 3 und 4 zu unterstützen, stehen mehrere Helfervektoren über Addgene und andere kommerzielle Quellen zur Verfügung, die für Mob kodieren, sowie mehrere Methylasen, um vor nativen Endonukleasen im Wirtcyanobacterium43zu schützen. In diesem Protokoll wurde die Konjugation durch einen MC1061 E. coli-Stamm mit Mobilisatoren und Helfervektoren pRK24 (www.addgeneorg/51950) bzw. pRL528 (www.addgene.org/58495) erleichtert. Bei der Auswahl der Vektoren, die für die eheliche Übertragung verwendet werden sollen, ist Vorsicht geboten. Im CyanoGate-Kit kodiert beispielsweise der selbstreplizierende Frachtvektor pPMQAK1-T für ein Mob-Protein12. PSEVA421-T ist jedoch nicht44, und als solcher muss mob von einem geeigneten Hilfsvektor ausgedrückt werden. Die verwendeten Vektoren sollten auch dem Zielorganismus angemessen sein. Beispielsweise erfordert eine effiziente eheliche Übertragung in Anabaena sp. PCC 7120 einen Hilfsvektor, der den Mobilizervektor vor Derverdauung schützt (z. B. pRL623, das für die drei Methylasen AvaiM, Eco47iiM und Ecot22iM kodiert45, 46.
In diesem Protokoll beschreiben wir weiter, wie die Leistung von Teilen (d. h. Promotoren) mit einem Fluoreszenzmarker mit einem Plattenleser oder einem Durchflusszytometer charakterisiert werden kann. Durchflusszytometer sind in der Lage, die Fluoreszenz auf einer einzelzelligen Basis für eine große Population zu messen. Darüber hinaus ermöglichen Durchflusszytometer es dem Benutzer, die erfassten Daten zu "torieren" und Hintergrundgeräusche zu entfernen (z. B. von Partikeln in der Kultur oder Kontamination). Im Gegensatz dazu erfassen Plattenleser eine aggregierte Fluoreszenzmessung eines bestimmten Kulturvolumens, typischerweise in mehreren Replizikern. Zu den wichtigsten Vorteilen von Plattenlesern gegenüber Zytometern zählen die niedrigeren Kosten, die höhere Verfügbarkeit und in der Regel keine Notwendigkeit für spezialsoftware für nachgelagerte Datenanalysen. Die Hauptnachteile von Plattenlesern sind die relativ geringere Empfindlichkeit im Vergleich zu Zytometern und potenzielle Probleme mit der optischen Dichte der gemessenen Kulturen. Für vergleichende Analysen müssen Plattenleserproben für jeden Brunnen normalisiert werden (z. B. zu einer Messung der Kulturdichte, typischerweise als Absorption bei der optischen Dichte bei 750 nm [OD750]), was zu Ungenauigkeiten bei proben führen kann, die zu groß sind. dicht und/oder nicht gut gemischt (z. B. wenn sie anfällig für Aggregation oder Flockung sind).
Als Überblick zeigen wir hier detailliert die Prinzipien der Erzeugung von Level 0-Teilen, gefolgt von der hierarchischen Montage mit dem CyanoGate-Kit und dem Klonen zu einem Vektor, der für die eheliche Übertragung geeignet ist. Anschließend zeigen wir den ehelichen Transferprozess, die Auswahl von axtischen transkonjuganten Stämmen, die einen fluoreszierenden Marker exdrücken, und die anschließende Erfassung von Fluoreszenzdaten mit einem Durchflusszytometer oder einem Plattenleser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0404</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (microbiology tested)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-500g</td>
			<td>Used in 8.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41026</td>
			<td>Used in 6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BpiI (BbsI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI (Eco31I)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0291</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>A1491.0005</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used in 4.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>Used in 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td>DNA extraction kit. Used in 5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega Microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td>Used in 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10021083</td>
			<td>Used in 2.3.1, 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10356553</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11815-024</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filters (0.45 &#956;m)</td>
			<td>MF-Millipore</td>
			<td>HAWP02500</td>
			<td>Used in 3.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) &#181;CLEAR</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td>Used in 4.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1020S</td>
			<td>Used in 1.1.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td>DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro incubator with LEDs</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>-</td>
			<td>Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21108</td>
			<td>Used in 7.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used in 2.3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 chemically competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td>Used in 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>K813</td>
			<td>Used in 4.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>Used in 1.1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load 1 kb DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0468S</td>
			<td>Used in Figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>72.692.210</td>
			<td>Used in 3.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>J61820.06</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>612U96</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill. Used in 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit

Cyanobakterien sind eine vielfältige Gruppe von prokaryotischen photosynthetischen Organismen, die für die nachwachsende Produktion nützlicher Industrieller verwendet werden können. Jüngste Fortschritte in der synthetischen Biologie haben zur Entwicklung mehrerer Klon-Toolkits wie CyanoGate geführt, einem standardisierten modularen Klonsystem zum Aufbau von Plasmidvektoren für die nachfolgende Transformation oder die eheliche Übertragung in Cyanobakterien. Hier skizzieren wir eine detaillierte Methode zur Zusammenstellung eines sich selbst replizierenden Vektors (z.B. mit einer fluoreszierenden Markerexpressionskassette) und der wechselförmigen Übertragung des Vektors in die cyanobakteriellen Stämme Synechocystis sp. PCC 6803 oder Synechococcus Elongatus UTEX 2973. Darüber hinaus beschreiben wir, wie die Leistung eines genetischen Teils (z. B. eines Promotors) mit einem Plattenleser oder einer Durchflusszytometrie charakterisiert werden kann.

Um den Golden Gate-Montage-Workflow zu demonstrieren, wurde eine Ausdruckskassette im Level 1 Position 1 (Forward) Akzeptorvektor (pICH47732) mit den folgenden Level 0-Teilen montiert: dem Promotor des C-Phycocyanin-Operons Pcpc560 (pC0.005), die Codierungssequenz für eYFP (pC0.008) und den Doppelabschlusszeichen TrrnB (pC0.082)12. Nach der Transformation der Montagereaktion wurden erfolgreiche Baugruppen mit dem Standard-Bl...

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Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie i) einen sich selbst replizierenden Vektor mithilfe des modularen Klon-Toolkits CyanoGate zusammenstellen kann, ii) den Vektor durch Konjugation in einen cyanobakteriellen Wirt einführt und iii) transgene Cyanobakterienstämme mit einem Plattenleser oder Durchflusszytometrie.

Genetische Modifikation von Cyanobakterien durch Konjugation mit dem CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Cyanobakterien sind ein wichtiges Phylum von photosynthetischen Mikroben, die zunehmend als nützliche Plattformen für synthetische Biologie und erneuerbare Biotechnologie-Anwendungen anerkannt werden. Daher ist es wichtig, robuste Techniken zu entwickeln, um das Design, das Klonen und die Einführung heterologer DNA in verschiedene cyanobakterielle Arten zu vereinfachen. Diese Technik zeigt also eine etablierte Methode namens Konjugation oder triparentale Paarung zur Einführung von DNA in cyanobakterielle Arten, die nicht natürlich transformierbar sind.Die Konjugation wurde erfolgreich in einer Vielzahl von cyanobakteriellen Stämmen von Einzelzell- bis zu mehrzelligen fadenförmigen Arten durchgeführt. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal versuchen, achten Sie bitte darauf, sowohl Ihre Cyanobakterien als auch Ihre E.coli-Stämme mit Vorsicht zu behandeln. Zentrifugieren Sie z. B. nicht über den im Protokoll angegebenen Werten und wirbeln Sie nicht.Mischen von Bakterien und Cyanobakterien kann seltsam für Erstanwender erscheinen. Wir hoffen, dass wir durch die Demonstration des Konjugationsprozesses dazu beitragen werden, dies zu klären. Wählen Sie nach dem Bau der Baugruppen der Ebene 1 einen geeigneten Pegel-T-Akzeptorvektor aus.Wählen Sie einen geeigneten Endlink aus, um das drei Primende der endgültigen Ebene 1-Baugruppe auf das Level-T-Backbone zu ligte. Um eine oder mehrere Baugruppen der Ebene 1 in Ebene T zusammenzustellen, bereiten Sie einen Reaktionsmix mit PBI1 und dem erforderlichen Endlinkvektor vor. Richten Sie das Thermocycler-Programm ein und fahren Sie entsprechend dem Manuskript fort.Wachsen Sie am ersten Tag die cyanobakterielle Kultur, indem Sie eine neue Kultur von Synechocystis PCC 6803 oder Synechococcus elongatus UTEX 2973 aufbauen. Mit einer hitzesterilen Schleife die Zellen von der axtischen BG-11 Agarplatte kratzen und in einen 100 Milliliter Konuskolben geben, gefüllt mit 50 Millilitern frischem BG-11-Medium bis zur Unheil. Legen Sie den Kolben in einen schüttelnden Inkubator mit Beleuchtung, um die Synechocystis PCC 6803 Zellkulturen bei 30 Grad Celsius bei 100 U/min zu züchten.Für Synechococcus elongatus UTEX 2973, wachsen die Zellkulturen bei 40 Grad Celsius bei 100 RPM. Zeichnen Sie nach ein bis zwei Tagen einen Milliliter der Zellkultur und messen Sie auf einem Spektralphotometer. Die Absorption bei OD 750 erreicht 0,5 bis 1,5.Am zweiten Tag impfen Sie einen MC1061 E.coli-Helferstamm, der die Vektoren PRK24 und PRL528 in fünf Millilitern LB-Medium mit Ampicillin in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter und Chloramphenicol in einer Konzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter enthält. Wachsen Sie bei 37 Grad Celsius über Nacht bei 225 RPM in einem Schüttel-Inkubator. Dann impfen Sie fünf Milliliter LB-Medium mit geeigneten Antibiotika mit der E.coli-Kultur, die den Frachtvektor der Ebene T trägt.Wachsen Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius über Nacht bei 225 RPM in einem zitternden Brutkasten. Zentrifugieren Sie am dritten Tag den Helfer und die Ladung E.coli über Nacht bei 3.000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.Waschen Sie die Pellets, indem Sie fünf Milliliter frisches LB-Medium ohne Antibiotika hinzufügen. Setzen Sie das Pellet wieder auf, indem Sie sanft nach oben und unten und Zentrifugen pfeifen, um den Überstand zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal, um Restantibiotika aus der Nachtkultur zu entfernen.Nach der letzten Wäsche das Zellpellet in der Hälfte des Volumens des LB-Mediums des ursprünglichen Kulturvolumens wieder aufhängen. Dann 450 Mikroliter der Helfersorte mit 450 Mikrolitern der Ladungsdehnung in einem Zwei-Milliliter-Rohr kombinieren und bei Raumtemperatur verlassen. Als nächstes bereiten Sie die cyanobakterielle Kultur vor, indem Sie einen Milliliter cyanobakterielle Kultur bei 1, 500 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrieren.Dann entsorgen Sie den Überstand sorgfältig, ohne das Zellpellet zu stören. Waschen Sie das Pellet viermal, indem Sie frisches BG-11 Medium des gleichen Anfangsvolumens hinzufügen. Fügen Sie 900 Mikroliter der gewaschenen cyanobakteriellen Kultur zu 900 Mikroliterdern der kombinierten E.coli-Stämme in einer Zwei-Milliliter-Röhre hinzu.Mischen Sie die Kulturen, indem Sie sanft nach oben und unten pfeifen. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten für Synechocystis PCC 6803 oder zwei Stunden für Synechococcus elongatus UTEX 2973. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 1, 500 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.1,6 Milliliter des Überstandes entfernen und das Pellet im restlichen Überstand wieder aufhängen. Legen Sie einen 0,45 Mikron Membranfilter ohne Antibiotika auf eine LB BG-11 Agarplatte. 200 Mikroliter der E.coli/Cyanobakterienkultur auf der Membran vorsichtig mit einem sterilen Streuer oder einer sterilen gebogenen Spitze verteilen.Versiegeln Sie die Platte mit Paraffinfolie und legen Sie die Platte 24 Stunden lang in einen beleuchteten Inkubator. Übertragen Sie die Membran nach 24 Stunden sorgfältig mit Flammensterilisationszangen auf eine frische BG-11-Agarplatte, die geeignete Antibiotika enthält, um sie für den Ladungsvektor auszuwählen. Versiegeln Sie die Platte mit Paraffinfolie und brüten Sie unter den gleichen Bedingungen wie bisher, bis Kolonien auftreten.Kolonien erscheinen in der Regel nach 7-14 Tagen für Synechocystis PCC 6803 und 3-7 Tage für Synechococcus elongatus UTEX 2973. Um Konjuganten auszuwählen, wählen Sie mit einem hitzesterilen Impfstab mindestens zwei einzelne Kolonien aus der Membran aus und streifen auf eine neue BG-11-Agarplatte mit geeigneten Antibiotika. Dann impfen Sie einen Streifen cyanobakterieller Kultur in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr mit fünf Millilitern LB-Medium und brüten bei 37 Grad Celsius über Nacht bei 225 U/min in einem Schüttelinkubator.Die klare Kultur bestätigt das Fehlen einer E.coli-Kontamination. Wählen Sie nach einer ausreichenden Wachstumsphase von sieben Tagen einzelne axtische Kolonien aus, um flüssige Kulturen für die langfristige Kryolagerung oder nachfolgende Experimente einzurichten. In dieser Studie wurde der Workflow für die Golden Gate-Montage demonstriert.Nach der Transformation der Montagereaktion wurden erfolgreiche Baugruppen mit dem Standard-Blauweiß-Screening von E.coli-Kolonien identifiziert. Die eYFP-Expressionskassette im Vektor der Ebene 1 und der Endlink-Eins-Vektor wurden dann zu einem Akzeptorvektor der Ebene T zusammengesetzt, um dem Vektor cpcBA-eYFP zu geben. Der montierte cpcBA-eYFP-Vektor wurde durch Restriktionsverdauung verifiziert.Die erfolgreiche eheliche Übertragung von cpcBA-eYFP oder dem pPMQAK1-T-Vektor führte zu einem Wachstum von bis zu mehreren hundert Kolonien auf der Membran für Synechocystis PCC 6803 und Synechococcus elongatus UTEX 2973. Wie für den starken Pcpc560-Promotor erwartet, waren die Werte für normalisierte eYFP-Fluoreszenz vom Plattenleser und die eYFP-Fluoreszenz pro Zelle aus dem Durchflusszytometer im Vergleich zur Negativkontrolle hoch. Sowohl beim Plattenleser als auch beim Durchflusszytometer waren die Fluoreszenzwerte in Synechococcus elongatus UTEX 2973 höher als bei Synechocystis PCC 6803.Stellen Sie sicher, dass Sie für die minimale Zeit inkubieren, je nachdem, welche Sorte Sie konjugieren.

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