Name: genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit
Uploaded: 2019-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

המחברים אסירי תודה על מועצת המחקר של הביוטכנולוגיה PHYCONET ומדעי הביולוגיה (BBSRC) רשת ביוטכנולוגיה תעשייתית, Bioenergy (NIBB) ומרכז החדשנות ביוטכנולוגיה (IBioIC) לתמיכה כספית. GARG, AASO ו AP הענקת מימון תמיכה מן התוכנית המקצועית של ה-BBSRC מקרה PhD (הענק מספר BB/M010996/1), Consejo הלאומי דה Ciencia y Tecnología (CONSEJO) PhD תוכנית, ואת IBioIC-BBSRC שותפות הדרכה (CTP) התוכנית PhD, בהתאמה. אנו מודים לקונרד מולקו (המלכה מרי אוניברסיטת לונדון) ו פול אריק ג'נסן וג אנמרי זיטה זדלר (אוניברסיטת קופנהגן) לתרומות וקטורים בפרוטוקולים וקטוריים וייעוץ.

1. הרכבה וקטורית באמצעות המפעל וכלי הכלים של הצמח
הערה: לפני שתמשיך בהרכבה וקטורית, מומלץ מאוד למשתמשים להכיר את המבנים ברמה הווקטורית של המפעל ומערכות מוקלו12,15.
<ol><li>בניית חלקים ברמה 0 הערה: חלקים ברמה 0 יכולים להיות מסונתז כווקטורים מלאים א...

להרכבת שער הזהב יש מספר יתרונות בהשוואה לשיטות הרכבה וקטוריות אחרות, במיוחד במונחים של מדרגיות של20,21. עם זאת, הקמת מערכת שער הזהב במעבדה דורשת זמן לפתח היכרות עם החלקים השונים ולקבלה של ספריות וקטוריות ותהליכי הרכבה כוללים. תכנון קפדני נדרש לעתים קרובות עבו...

כחוליות הautotrophic בקטריה שיכולה לשמש לביוסינתזה של מגוון רחב של מוצרים מטבוליים בעלי ערך גבוה והטרוולוגי,1,2,3,4,5, . שישה מטרים מכשולים מספר עדיין צריך להיות להתגבר כדי להרחיב את הכדאיות המסחרית שלהם, בעיקר, את התשואות העניים יחסית לעומת heterotrophic bio-פלטפורמות (למשל, Esהכלאיים קולי ושמרים)7. ההרחבה האחרונה של כלים הנדסה גנטית זמין וספיגת הפרדיגמה של ביולוגיה סינתטי במחקר cyanobacterial הוא עוזר להתגבר על אתגרים כאלה ועוד לפתח cyanחיידקים יעילים ביוקוסיטיות יעילות8, 9,10.
הגישות העיקריות להצגת ה-DNA לתוך הקיאובקטריה הם טרנספורמציה, היווצרות ואלקטרופורציה. הווקטורים שהועברו לציטואובקטריה על ידי טרנספורמציה או אלקטרופורציה הם "התאבדות" וקטורים (כלומר, וקטורים אינטגרטיבית המקלים על שילוב הומולוגי), בעוד שניתן להעביר וקטורים שמשכפלת את עצמם לציאנקטריה על ידי שינוי צורה, קוניוגציה או אלקטרופורציה. עבור הראשון, פרוטוקול זמין עבור מינים הנדסה מודל מאפשר שינוי טבעי11. לאחרונה, שיבוט מודולרי (MoClo) ערכת כלים עבור כחוליות הנקרא ציאנוגייט פותחה כי מעסיקה שיטת הרכבה סטנדרטית של שער הזהב להנדסה באמצעות שינוי טבעי, אלקטרופורציה או הקוניוגציה12.
שיטות הרכבה מסוג שער הזהב הפכו לפופולריות יותר ויותר בשנים האחרונות, ותקני הרכבה וספריות חלק זמינים כעת עבור מגוון של אורגניזמים13,14,15,16 ,בן 17 שער הזהב משתמש באנזימים של הגבלת IIS (לדוגמה, BsaI, Bsai, Bsb, BtgZI ו-AarI) וסידרה של קבלה והיתקעות ייחודיות כדי להקל על הרכבה הירארכית כיוונית של רצפים מרובים בתגובת הרכבה מסוג "סיר אחד". הקלד אנזימי הגבלת IIS מזהים רצף אסימטרי ייחודי וחותכים מרחק מוגדר מאתרי הזיהוי שלהם כדי ליצור התנדנד, גזור "בסוף דביק" (בדרך כלל 4 נוקלאוטיד [NT] overhang), אשר ניתן לנצל לאחר מכן הכונן DNA הזמנת תגובותהאסיפה 15,18. פעולה זו הפכה את ההתפתחות של ספריות גדולות של חלקים מודולריים ברמה 0 (למשל, היזמים, לפתוח מסגרות קריאה ומחסלים) המוגדרים על ידי תחביר משותף, כמו התקן פיטולבנים19. לאחר מכן, חלקים ברמה 0 יכולים להיות מורכבים בקלות לתוך קלטות ביטוי רמה 1, בעקבות הרכבות יותר מורכבות בסדר גבוה (g., ביטויים multigene בנייה) ניתן לבנות וקטור קבלה של בחירה12,15. יתרון מרכזי של טכניקות הרכבה מסוג שער הזהב הוא היכולת שלהם לאוטומציה במתקני תפוקה גבוהה, כגון שירותי דנ א20,21, אשר יכול לאפשר בדיקה של עיצובים ניסיוניים מורכבים ש לא ניתן להשיג בקלות על ידי עבודה ידנית.
כלציאנו-גייט בונה על מערכת. המפעל הוקמה12,15 כדי לשלב חלק חדש לתוך ציאנוגייט, על רצף החלקים להיות ממושמע, כלומר, אתרי זיהוי "לא חוקיים עבור BsaI ו-Bsai חייבים להיות מוסרים. במקרה של קידוד חלק עבור מסגרת קריאה פתוחה (כלומר, רצף קידוד, תקליטורים), אתרי הכרה יכולים להיות מופרת על ידי יצירת מוטציות נרדף ברצף (כלומר, שינוי העין לחלופה המקודד עבור אותו שאריות חומצות אמינו). זה יכול להיות מושגת על ידי מגוון רחב של גישות, החל סינתזה של DNA לתגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוססי הגברה אסטרטגיות כגון מכלול גיבסון22. בהתאם למארח הביטוי המשמש, יש לנקוט כדי למנוע את המבוא של משתמשים נדירים שיכולים לעכב את היעילות של תרגום23. הסרת אתרי זיהוי ברצפים של יזם ושליחות קטלנית היא בדרך כלל מאמץ לגולש, מאחר ששינויים עלולים להשפיע על הפונקציה וייתכן שהחלק לא יפעל כמצופה. לדוגמה, שינויים באתרי האיגוד של גורמי הכריכה או באתר המחייב הריבוחלק בתוך מקדם יכולים לשנות כוח ותגובתיות לאינדוקציה/דיכוי. כמו כן, שינויים בתכונות מבניים שליחות קטלנית (g., הגזע העשיר GC, לולאה ו פולי-U הזנב) עשוי לשנות את יעילות הפסקת וביטוי גן ההשפעה24,25. למרות מספר משאבים מקוונים זמינים כדי לנבא את הפעילות של היזם ואת רצפי שליחות קטלנית, ולהודיע אם מוטציה המוצע ישפיע על ביצועים26,27, כלים אלה הם לעתים קרובות מנבא עניים של ביצועים בקיאנקטריה28,29,30... ככזה, באפיון vivo של חלקים שהשתנו עדיין מומלץ לאשר פעילות. כדי לסייע עם שיבוט של רצפים הסרבן, כוללות כולל העתק נמוך שיבוט קבלת וקטור מבוסס על הווקטור biobrick pSB4K512,16,31. יתר על כן, "עיצוב ובנייה" הפורטל זמין דרך בית היציקה של אדינבורו הגנום כדי לעזור עם עיצוב וקטורי (dab.genomefoundry.org). לבסוף, והכי חשוב, ציאנוגייט כוללת שני עיצובים וקטוריים ברמה 2 (שווה ערך לקבלת וקטורים ברמה 3)15 עבור החדרת דנ א לתוך כחוליות באמצעות וקטורים התאבדות, או וקטורים רחבים של טווח המארח המסוגל לשכפול עצמי בכמה מינים של cyanobacterial32,33,34.
כאן נתמקד בתיאור פרוטוקול ליצירת וקטורים ברמה שכפול עצמי והשינוי הגנטי של Syelongatus לוצילף pcc 6803 ו Synechocystis Utex 2973 (sy לוצילף pcc 6803 ו -S. elongatus Utex 2973 להלן) על ידי הקוניוגציה (המכונה גם ההזדווגות tri-הורים). העברת הזוגיות של דנ א בין התאים החיידקיים הוא תהליך מתואר היטב, כבר בשימוש בעבר עבור מינים הנדסה cyanobacterial, בפרט אלה שאינם מוכשרים באופן טבעי, כגון S. elongatus utex 297335, 36,37,38,39,40,41. בקצרה, תרבויות cyanobacterial הם מודבטים עם הזן E. coli נושאת את וקטור להיות הועבר ("מטענים" וקטור) ו וקטורים (או באותו מאמץ E. coli או בזנים נוספים) כדי לאפשר בניינים ("מגייס" ו "עוזר" וקטורים). ארבעה תנאים מרכזיים נדרשים עבור העברת הזוגיות להתרחש: 1) קשר ישיר בין התאים המעורבים בהעברת ה-DNA, 2) וקטור המטען חייב להיות תואם עם מערכת הקוניוגציה (כלומר, היא חייבת להכיל מקור העברה מתאים (אורית), ידוע גם בשם bom (בסיס של ניידות) האתר), 3) בדיקת דנ א בחלבון (g., מקודד על ידי הגן המאפיה ) כי הניקס ב אורית ליזום העברה אחת תקוע של ה-dna לתוך cyanקוביום חייב להיות נוכח ומבוטא מן המטען או מסייע וקטורים, ו -4) ה-DNA המועבר לא צריך להיהרס ב cyanobacterium הנמען (כלומר, חייב להיות עמיד בפני השפלה על ידי, למשל, הגבלה endonuclease פעילות)35,42. עבור וקטור המטען להמשיך, מקור השכפול חייב להיות תואם עם cyanקוביום הנמען כדי לאפשר שכפול עצמי והתפשטות לתוך מחלקת תאים ביתי הדואר. כדי לסייע עם תנאים 3 ו-4, מספר וקטורים מסייעים זמינים דרך Addgene ומקורות מסחריים אחרים המקודדים עבור המאפיה , כמו גם מתילסים מספר להגן מפני העין המקורית של cyanobacterium מארח43. בפרוטוקול זה הונחה הקוניוגציה על ידי זן MC1061 E. coli הנושא וקטורים מpRK24 (www. addgeneorg/51950) וpRL528 (www.addgene.org/58495), בהתאמה. הטיפול חייב להילקח בעת בחירת וקטורים לשמש להעברת הזוגיות. לדוגמה, בערכת ציאנושער שכפול המטען העצמי וקטור pPMQAK1-T מקודד עבור חלבון המאפיה12. עם זאת, pSEVA421-T אינו44, וככזה, האספסוף חייב להתבטא מתוך וקטור עוזר מתאים. הווקטורים המשמשים צריכים להיות גם מתאימים לאורגניזם היעד. לדוגמה, העברת הזוגיות יעילה ב- אננינה SP. pcc 7120 דורש וקטור עוזר המגן על וקטור מגייס נגד העיכול (למשל, pRL623, אשר מקודד עבור שלושה מתילסים Avaim, Eco47iiM ו Ecot22iM)45, 46.
בפרוטוקול זה אנו עוד לתאר כיצד לאפיין את הביצועים של חלקים (כלומר, היזמים) עם סמן פלורסנט באמצעות קורא צלחת או cytometer זרימה. הציטומטרים זורמים מסוגלים למדוד את הקרינה הפלואורסצנטית על בסיס תא בודד עבור אוכלוסיה גדולה. יתר על כן, cytomטומטריים זרימה לאפשר למשתמשים "שער" את הנתונים הנרכשים ולהסיר רעשי רקע (למשל, מחומר חלקיקי בתרבות או זיהום). לעומת זאת, קוראי צלחות רוכשים מדידה בלתי מצטברת של כמות תרבותית מסוימת, בדרך כלל במספר בארות שכפול. יתרונות מרכזיים של קוראי צלחות על cytomטומטריים כוללים את העלות הנמוכה יותר, זמינות גבוהה יותר ובדרך כלל אין דרישה עבור תוכנות מומחה עבור ניתוח נתונים במורד. החסרונות העיקריים של קוראי צלחות הם רגישות נמוכה יחסית לעומת cytomטומטריים ובעיות פוטנציאליות עם צפיפות אופטית של תרבויות מדודות. עבור ניתוחים השוואתיים, יש לכלול בדוגמאות של קורא הצלחות באופן שטוח עבור כל באר (לדוגמה, למדידה של צפיפות התרבות, הנלקחת בדרך כלל כספיגת החומר בצפיפות האופטית ב-750 ננומטר [OD750]), שעלולה להוביל לאי אי-דיוקים עבור דגימות שאינן צפוף ו/או לא מעורבב היטב (למשל, כאשר מועדים לצבירה או לחיסון).
כסקירה, כאן אנו להדגים בפירוט את העקרונות של יצירת רמה 0 חלקים, ואחריו הרכבה הירארכית באמצעות ערכת ציאנוגייט ושיבוט לתוך וקטור מתאים להעברת הזוגיות. לאחר מכן אנו להדגים את תהליך העברת הזוגיות, מבחר של הזנים הטרנסמעית של היקום הבטא סמן פלורסנט, ובעקבות הרכישה של נתונים פלואורסצנטית באמצעות cytometer זרם או קורא צלחת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0404</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (microbiology tested)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-500g</td>
			<td>Used in 8.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41026</td>
			<td>Used in 6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BpiI (BbsI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI (Eco31I)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0291</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>A1491.0005</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used in 4.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>Used in 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td>DNA extraction kit. Used in 5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega Microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td>Used in 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10021083</td>
			<td>Used in 2.3.1, 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10356553</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11815-024</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filters (0.45 &#956;m)</td>
			<td>MF-Millipore</td>
			<td>HAWP02500</td>
			<td>Used in 3.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) &#181;CLEAR</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td>Used in 4.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1020S</td>
			<td>Used in 1.1.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td>DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro incubator with LEDs</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>-</td>
			<td>Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21108</td>
			<td>Used in 7.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used in 2.3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 chemically competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td>Used in 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>K813</td>
			<td>Used in 4.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>Used in 1.1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load 1 kb DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0468S</td>
			<td>Used in Figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>72.692.210</td>
			<td>Used in 3.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>J61820.06</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>612U96</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill. Used in 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit

כחוליות הן קבוצה מגוונת של אורגניזמים פוטוסינתטיים prokaryotic שניתן לשנות גנטית עבור ייצור מתחדשת של סחורות תעשייתיות שימושי. ההתפתחויות האחרונות בביולוגיה סינתטית הובילו לפיתוח של כמה ערכות כלים שיבוט כגון ציאנוגייט, מערכת סטנדרטית שיבוט מודולרי לבניית וקטורים פלביניים עבור שינוי או העברה הזוגיות לתוך כחוליות. כאן אנו מתווה שיטה מפורטת להרכבת וקטור שכפול עצמי (למשל, נשיאת מחסנית ביטוי של סמן פלורסנט) והעברה בת הזוג של הווקטור לתוך זנים cyanobacterial של sy, pcc 6803 או Synechocystis elongatus utex 2973. בנוסף, אנו לתאר כיצד לאפיין את הביצועים של חלק גנטי (למשל, מיזם) באמצעות קורא צלחת או זרימת cy, לנסות.

כדי להדגים את זרימת העבודה של ההרכבה של שער הזהב, קלטת ביטוי הורכבה במיקום רמה 1 (קדימה) וקטור (pICH47732) המכיל את החלקים הבאים ברמה 0: המקדם של C-phycocyanin אופרון Pcpc560 (pc 0.005), רצף קידוד עבור eYFP (pC 0.008) ו שליחות קטלנית TRrnb (pc 0.082)12. בעקבות טרנספורמציה של ?...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד אני) להרכיב וקטור שכפול עצמי באמצעות ערכת השכפול שיבוט מודולרי ציאנוגייט, ii) להציג את הווקטור לתוך מארח cyanobacterial על ידי הקונקטורים, ו iii) לאפיין את הזנים של הציטוחיידקים הטרנסגניים באמצעות קורא צלחת או לזרום cy, לנסות.

השינוי הגנטי של הקיאובקטריה באמצעות הקוניוגציה באמצעות ערכת השכפול המודולרי של ציאנוגייט

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Cyanobacteria הם פילום חשוב של מיקרואורגניזמים פוטוסינתטיים המוכרים יותר ויותר כפלטפורמות שימושיות עבור ביולוגיה סינתטית ויישומי ביוטכנולוגיה מתחדשת. לכן חשוב לפתח טכניקות חזקות כדי לפשט את התכנון, השיבוט וההכנסת דנ"א ההטרולוגי למינים ציאנובקטריאליים שונים. אז טכניקה זו מדגימה שיטה מבוססת הנקראת הזדווגות או הזדווגות טריפרנטל להחדרת DNA למינים ציאנובקטריאליים שאינם ניתנים לשינוי באופן טבעי.ההתאגדויות בוצעו בהצלחה במגוון רחב של זנים ציאנובקטריאליים מתא יחיד למינים רב-תאיים. אם אתם מנסים טכניקה זו בפעם הראשונה, אנא הקפיטו לטפל הן בציאנובקטריאלי והן בזני ה- E.coli שלכם בזהירות. לדוגמה, אל תנהל צנטריפוגה מעל הערכים שניתנו בפרוטוקול ואל תבער.ערבוב חיידקים וציאנובקטריה עשוי להיראות מוזר למשתמשים בפעם הראשונה. אנו מקווים כי על ידי הפגנת תהליך ההתייחדות, נעזור להבהיר זאת. לאחר בניית הרכבות ברמה אחת, בחר וקטור קבלה ברמה T מתאים.בחר קישור סיום מתאים כדי לייגד את הקצה השלישי של ההרכבה ברמה הסופית 1 לעצם השדרה של רמה T. כדי להרכיב הרכבה אחת או יותר ברמה T, הכינו תערובת תגובה עם PBI1 וקטור קישור הקצה הנדרש. הגדר את תוכנית האופניים התרמיים והמשך בהתאם לכתב היד.ביום הראשון, לגדול תרבות ציאנובקטריאלי על ידי הקמת תרבות טרייה של Synechocystis PCC 6803 או Synechococcus elongatus UTEX 2973. עם לולאה סטרילית חום, לגרד את התאים מן צלחת אגר BG-11 ציר ולהניח לתוך בקבוק חרוט 100 מיליליטר מלא 50 מיליליטר של טרי BG-11 בינוני לחסן. מניחים את הבקבוק לתוך אינקובטור רועד עם תאורה כדי לגדל את Synechocystis PCC 6803 תרבויות תא ב 30 מעלות צלזיוס ב 100 סל"ד.עבור Synechococcus elongatus UTEX 2973, לגדל את תרבות התא ב 40 מעלות צלזיוס ב 100 סל"ד. לאחר יום עד יומיים, צייר מיליליטר אחד מתרבות התאים ולמדוד על ספקטרופוטומטר. הספיגה ב OD 750 מגיע 0.5 כדי 1.5.ביום השני, לחסן זן עוזר MC1061 E.coli המכיל וקטורים PRK24 ו PRL528 בחמישה מיליליטר של מדיום LB עם אמפיצילין בריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר וכלוראמפניקול בריכוז של 25 מיקרוגרם למיליליטר. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס לילה ב 225 סל"ד באינקובטור רועד. ואז לחסן חמישה מיליליטר של מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה עם תרבות E.coli נושאת את וקטור מטען T ברמה.לגדל את התרבות ב 37 מעלות צלזיוס לילה ב 225 סל"ד באינקובטור רועד. ביום השלישי, צנטריפוגה המסייע ואת המטען E.coli תרבויות לילה ב 3, 000 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השלך את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור התא.לשטוף את כדורי על ידי הוספת חמישה מיליליטר של מדיום LB טרי ללא אנטיביוטיקה. תן מחדש את גלולה על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה צנטריפוגה כדי להסיר את supernatant. חזור על שלב כביסה זה שלוש פעמים כדי להסיר שאריות אנטיביוטיקה מתרבות הלילה.לאחר הכביסה האחרונה, לחץ מחדש על גלולת התא במחצית הנפח של LB בינוני של נפח התרבות הראשונית. לאחר מכן לשלב 450 microliters של זן עוזר עם 450 microliters של זן המטען בצינור שני מיליליטר ולהשאיר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להכין את התרבות cyanobacterial על ידי צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרבות ציאנובקטריאלי ב 1, 500 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.ואז להשליך את supernatant בזהירות מבלי להפריע גלולת התא. לשטוף את גלולה ארבע פעמים על ידי הוספת טרי BG-11 בינוני של אותו נפח ראשוני. הוסיפו 900 מיקרוליטרים של התרבות הציאנובקטריאלית השטופה ל-900 מיקרוליטרים של זני ה-E.coli המשולבים בצינור של שני מיליליטר.מערבבים את התרבויות על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה. הדגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות עבור Synechocystis PCC 6803 או שעתיים עבור Synechococcus elongatus UTEX 2973. צנטריפוגה את התערובת ב 1, 500 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.הסר 1.6 מיליליטר של supernatant ולתלות מחדש את גלולה על-טבעי הנותרים. מניחים מסנן קרום 0.45 מיקרון אחד על צלחת אגר LB BG-11 ללא אנטיביוטיקה. יש להפיץ בזהירות 200 מיקרוליטרים של תערובת התרבות E.coli/cyanobacterial על הממברנה עם מפזר סטרילי או קצה מעופף סטרילי.לאטום את הצלחת עם סרט פרפין ולה מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור מואר במשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, מעבירים בזהירות את הממברנה באמצעות מדפים מעוקרים להבה לצלחת אגר BG-11 טרייה המכילה אנטיביוטיקה מתאימה לבחירה עבור וקטור המטען. לאטום את הצלחת עם סרט פרפין דגירה באותם תנאים כמו קודם לכן עד מושבות להופיע.מושבות מופיעות בדרך כלל לאחר 7-14 ימים עבור Synechocystis PCC 6803 ו 3-7 ימים עבור Synechococcus elongatus UTEX 2973. כדי לבחור באוב, באמצעות מוט חיטוי סטרילי חום, בחר לפחות שתי מושבות בודדות מן הממברנה פס על צלחת חדשה BG-11 אגר המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. ואז לחסן פס של תרבות ציאנובקטריאלי לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של LB בינוני דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה ב 225 סל"ד באינקובטור רועד.התרבות הברורה מאשרת את היעדר זיהום אי-קולי. לאחר תקופת צמיחה מספקת של שבעה ימים, בחר מושבות גרזן בודדות כדי להקים תרבויות נוזליות לאחסון קריו לטווח ארוך או לניסויים הבאים. במחקר זה, זרימת עבודה הרכבה שער הזהב הוכח.בעקבות שינוי תגובת ההרכבה זוהו הרכבות מוצלחות באמצעות סינון כחול לבן סטנדרטי של מושבות אי-קולי. קלטת הביטוי eYFP בווקטור ברמה אחת וקישור הקצה וקטור אחד הורכבו לאחר מכן לווקטור קבלה ברמה T כדי לתת את וקטור cpcBA-eYFP. וקטור cpcBA-eYFP שנאסף אומת על ידי עיכול הגבלה.העברה התייחדות מוצלחת של cpcBA-eYFP או וקטור pPMQAK1-T הביא לצמיחה של עד כמה מאות מושבות על הממברנה עבור Synechocystis PCC 6803 ו Synechococcus elongatus UTEX 2973. כצפוי עבור מקדם Pcpc560 חזק, הערכים עבור פלואורסצנטיות eYFP מנורמל מקורא הלוחות ו- eYFP פלואורסצנטיות לכל תא מן הציטומטר זרימה היו גבוהים בהשוואה לשליטה השלילית. עם קורא הלוחות וציטומטר הזרימה, ערכי הפלואורסצנטיות היו גבוהים יותר בסינקוקוקוס אילונגטוס UTEX 2973 מאשר ב- Synechocystis PCC 6803.ודא שאתה דגירה לזמן המינימלי על פי איזה זן אתה מעלה.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ&#39;יק

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

שינוי ורקומבינציה גנטי של תרבויות איברי בלוטות רוק

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

ויזואליזציה של דחיסת DNA ב כחוליות על ידי מתח גבוה הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

צינור באמצעות אלקטרופורציה דו-צדדית ברחם כדי לחקור השפעות גנטיות על התנהגות מכרסמים

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...