Name: genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit
Uploaded: 2019-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

저자는 산업 생명 공학 및 생명 에너지 (NIBB)의 PHYCONET 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC) 네트워크와 금융 지원을위한 산업 생명 공학 혁신 센터 (IBioIC)에 감사드립니다. GARG, AASO 및 AP는 BBSRC EASTBIO CASE 박사 프로그램(보조금 번호 BB/M010996/1), 콘세조 나시오날 드 시엔시아 y 테크놀로지아(CONACYT) 박사 프로그램, IBioIC-BBSRC 협력 교육 파트너십(CTP) 박사 프로그램, 각각. 콘래드 멀리노(런던 퀸 메리 대학교) 및 폴 에릭 젠슨과 줄리 안네마리 지타 제들러(코펜하겐 대학교)에게 플라스미드 벡터 및 프로토콜 기여와 조언에 감사드립니다.

1. 플랜트 모클로 및 시아노게이트 툴킷을 사용한 벡터 어셈블리
참고 : 벡터 어셈블리를 진행하기 전에 사용자가 식물 및 CyanoGate MoClo 시스템12,15의벡터 레벨 구조에 익숙해지는 것이 좋습니다.
<ol><li>레벨 0 부품 의 구성 참고: 레벨 0 파트는 전체 벡터또는 레벨 0 수락자(예: gBlocks, IDT)를 사용하여 어셈블리를 위한 선형 시퀀스로...

골든 게이트 어셈블리는 다른 벡터 어셈블리 방법에 비해 몇 가지 장점이 있으며, 특히 확장성20,21의측면에서. 그럼에도 불구하고 랩에서 골든 게이트 시스템을 설정하려면 다양한 부품과 수용자 벡터 라이브러리 및 전체 조립 프로세스에 익숙해지는 데 시간이 필요합니다. 더 복잡한 어셈블리를 위해 또는 많은 수의 복잡한 어셈블리를 병렬로 수행할 ...

시아노박테리아는 다양한 자연및 이종성 고부가가치 대사산물의 생합성에 사용될 수 있는 자가영양균으로1,2,3,4,5, 6. 몇몇 장애물은 여전히 그들의 상업적 생존가능성을 확장하기 위하여 극복될 필요가 있고, 특히, 이종 영양바이오 플랫폼(예를 들어, 대장균 및 효모)에 비해 상대적으로 가난한 수율은7. 최근 사용 가능한 유전 공학 도구의 확장과 시아노박테리아 연구에서 합성 생물학 패러다임의 섭취는 이러한 과제를 극복하고 효율적인 바이오 팩토리로서 시아노박테리아를 더욱 발전시키는 데 도움이 되고 있다8, 9,10.
시아노박테리아에 DNA를 도입하기 위한 주요 접근법은 형화, 이형 및 전기 천공입니다. 변형 또는 전기 천공에 의해 시아노박테리아로 전달된 벡터는 "자살" 벡터(즉, 상동 재조합을 용이하게 하는 통합 벡터)이며, 자가 복제 벡터는 시아노박테리아로 전달될 수 있습니다. 변환, 컨쥬게이션 또는 전기 천공. 전자의 경우, 프로토콜은 자연변환(11)에대한 엔지니어링 모델 종에 사용할 수 있다. 최근에는 시아노게이트(CyanoGate)라고 불리는 시아노박테리아용 모듈식 클론(MoClo) 툴킷이 자연변환, 전기화 또는컨쥬게이션(12)을이용한 엔지니어링을 위한 표준화된 골든 게이트 벡터 어셈블리 방법을 채택하는 것이 개발되었다.
골든 게이트 형 조립 기술은 최근 몇 년 동안 점점 더 인기를 끌고있다, 조립 표준 및 부품 라이브러리는 유기체의 다양한 사용할 수 있습니다13,14,15,16 ,17. 골든 게이트는 유형 IIS 제한 효소 (예를 들어, BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI 및 AarI)와 수용자 및 독특한 오버행을 사용하여 "하나의 냄비"어셈블리 반응에서 여러 서열의 방향 계층 적 조립을 용이하게합니다. 유형 IIS 제한 효소는 독특한 비대칭 서열을 인식하고 인식 부위로부터 정의된 거리를 절단하여 지그재그, "끈적끈적한 끝" 컷(전형적으로 4개의 뉴클레오티드 [NT] 오버행)을 생성하며, 이는 이후에 주문된 DNA를 구동하기 위해 악용될 수 있다. 어셈블리 반응15,18. 이는 PhytoBricks 표준19와같은 일반적인 구문으로 정의된 모듈식 레벨 0 부품(예: 프로모터, 오픈 판독 프레임 및 종기)의 대규모 라이브러리의 개발을 용이하게 하였다. 레벨 0 부품은 레벨 1 식 카세트로 쉽게 조립될 수 있으며, 이어서 보다 복잡한 고차 어셈블리(예를 들어, 다중 유전자 발현 구문)는 선택12,15의수락기 벡터로 구축될 수 있다. 골든 게이트 형 조립 기술의 주요 장점은 DNA 파운드리20,21과같은 고처리량 시설에서 자동화할 수 있는 편의성으로 복잡한 실험 설계를 테스트할 수 있다는 점입니다. 수동 노동으로 쉽게 달성 할 수 없습니다.
CyanoGate는 확립 된 식물 MoClo 시스템12,15에구축합니다. CyanoGate에 새로운 부품을 통합하려면 부품 시퀀스를 먼저 길들여야 합니다( 즉, BsaI 및 BpiI에 대한 "불법" 인식 사이트)를 제거해야 합니다. 개방 된 판독 프레임 (즉, 코딩 시퀀스, CDS)에 대한 부품 코딩의 경우, 인식 사이트는 서열에서 동의어 돌연변이를 생성함으로써 중단 될 수 있습니다 (즉, 동일한 아미노산 잔류물을 코딩하는 대안으로 코돈 변경). 이는 GIBSON어셈블리(22)와같은 DNA 합성에서 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭 기반 전략에 이르는 다양한 접근법에 의해 달성될 수 있다. 사용되는 발현 숙주에 따라,번역(23)의효율성을 저해할 수 있는 희귀 코돈의 도입을 피하기 위해 주의를 기울여야 한다. 프로모터 및 터미네이터 서열에서 인식 사이트를 제거하는 것은 일반적으로 수정이 기능에 영향을 줄 수 있고 부품이 예상대로 작동하지 않을 수 있기 때문에 더 위험한 노력입니다. 예를 들어, 프로모터 내의 가용 전사 인자 결합 부위 또는 리보솜 결합 부위에 대한 변화는 유도/억압에 대한 강도 및 반응성을 변화시킬 수 있다. 마찬가지로, 주요 터미네이터 구조적 특징(예를 들어, GC 리치 스템, 루프 및 폴리-U 테일)에 대한 변형은 종결 효율 및 효과 유전자발현(24,25)을변경할 수 있다. 여러 온라인 리소스가 프로모터 및 터미네이터 서열의 활성을 예측하고 제안된 돌연변이가 성능26,27에영향을 미치는지 여부를 알려주는 데 사용할 수 있지만, 이러한 도구는 종종 예측하기가 좋지 않습니다. 시아노 박테리아28,29,30. 따라서 변형된 부품의 생체 내 특성화는 여전히 활성을 확인하는 것이 좋습니다. 리칼시트 서열의 복제를 돕기 위해, CyanoGate는 BioBrick 벡터 pSB4K512,16,31에기초한 낮은 카피 클로닝 클로닝 수용자 벡터를 포함한다. 또한 에든버러 게놈 주조를 통해 벡터 디자인(dab.genomefoundry.org)을 통해 "설계 및 빌드" 포털을 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 가장 중요한 것은, CyanoGate는 자살 벡터를 사용하여 시아노박테리아에 DNA를 도입하기 위한 2개의 레벨 T 수용자 벡터 설계(레벨 2 수용자 벡터에해당)(15) 또는 자가 복제가 가능한 광범위한 숙주 범위 벡터를 포함한다는 것입니다. 여러 시아노 박테리아 종32,33,34.
여기서 우리는 레벨 T 자가 복제 벡터를 생성하기 위한 프로토콜을 설명하고 Synechocystis PCC 6803 및 Synechococcus 길쭉한 UTEX 2973(Synechocystis PCC 6803 및 S. elongatus의 유전자 변형) UTEX 2973 이하)에 의한 컨쥬게이션(삼자 짝짓기이라고도 함). 세균 세포 간의 DNA의 결합 전달은 잘 설명된 과정이며 이전에 는 S. longatus UTEX 297335와같이 자연적으로 유능하지 않은 종, 특히 시아노박테리아 종공학에 사용되어왔다. 36,37,38,39,40,41. 간단히 말해서, 시아노박테리아 배양체는 이식할 벡터("화물" 벡터) 및 벡터(동일한 대장균 균주 또는 추가 균주)를 운반하는 대장균 균주와 함께 배양되어 컨쥬게이션("mobilizer")을 가능하게 합니다. 및 "도우미" 벡터)를 제공합니다. 부부 전달이 발생하기 위해서는 4가지 주요 조건이 요구됩니다: 1) DNA 전달에 관여하는 세포 들 간의 직접 접촉, 2) 화물 벡터는 컨쥬게이션 시스템과 호환되어야 합니다(즉, 적절한전달(oriT)을포함해야 합니다. 또한 bom (이동성의 기초) 사이트로 알려져, 3) DNA 닉킹 단백질 (예를 들어, 마피아 유전자에 의해 코딩) 그 cyanobacterium으로 DNA의 단일 가닥 전송을 시작 하기 위해 oriT에서 DNA를 닉 존재 하 고 표현 해야 합니다. 화물 또는 도우미 벡터 들 중 하나로부터, 및 4) 이송된 DNA는 수용자 시아노박테리움에서 파괴되어서는 안 된다(즉, 제한 엔도누클리스 활성에 의한 열화에 저항해야 함)35,42. 화물 벡터가 지속되려면, 복제의 기원은 자식 복제 및 사후 분열로의 증식을 허용하기 위해 수신자 시아노박테리움과 호환되어야 한다. 조건 3 및 4를 돕기 위해, 몇몇 도우미 벡터는 호스트 시아노박테리움(43)에서 네이티브 엔도놀리스로부터 보호하기 위해 마피아뿐만 아니라 몇몇메틸라제에 인코딩하는 Addgene 및 기타 상용 소스를 통해 이용가능하다. 이 프로토콜에서, 컨쥬게이션은 각각 MC1061 대장균 균주 운반 동원기 및 도우미 벡터 pRK24(www.addgeneorg/51950) 및 pRL528(www.addgene.org/58495)에 의해 촉진되었다. 부부 전달에 사용할 벡터를 선택할 때주의를 기울여야합니다. 예를 들어, CyanoGate 키트에서 자가 복제 화물 벡터 pPMQAK1-T는 Mob단백질(12)에대해 인코딩한다. 그러나, pSEVA421-T는44가아니며, 따라서, 폭도는 적절한 도우미 벡터로부터 표현되어야 한다. 사용되는 벡터는 또한 표적 유기체에 적합해야 한다. 예를 들어, 아나바에나 sp. PCC 7120의 효율적인 부부 전달은 소화로부터 동원자 벡터를 보호하는 도우미 벡터를 필요로 합니다(예를 들어, 3개의 메틸라제 AvaiM, Eco47iiM 및 Ecot22iM)에 대해 인코딩하는 pRL623)45, 46.
이 프로토콜에서 우리는 플레이트 리더 또는 유동 세포계를 사용하여 형광 마커로 부품 (즉, 프로모터)의 성능을 특성화하는 방법을 추가로 설명합니다. 유세포계는 큰 집단을 위한 단 하나 세포 기초에 형광을 측정할 수 있습니다. 또한 유동 세포계를 사용하면 수집된 데이터를 "게이트"하고 배경 소음(예: 배양 또는 오염의 미립자 물질)을 제거할 수 있습니다. 대조적으로, 플레이트 판독기는 일반적으로 여러 복제 우물에서 주어진 배양부량의 골재 형광 측정을 획득합니다. 세포계에 비해 플레이트 판독기의 주요 장점으로는 낮은 비용, 높은 가용성 및 일반적으로 다운스트림 데이터 분석을 위한 전문 소프트웨어에 대한 요구 사항이 없습니다. 플레이트 판독기의 주요 단점은 세포계에 비해 상대적으로 낮은 감도 및 측정된 배양물의 광학 밀도에 대한 잠재적 인 문제입니다. 비교 분석의 경우, 플레이트 리더 샘플은 각 웰에 대해 정규화되어야 합니다(예: 일반적으로 750 nm [OD750]에서광학 밀도에서 흡광도로 촬영되는 배양 밀도 측정에 따르면) 너무 많은 시료의 부정확성을 초래할 수 있습니다. 조밀하거나 잘 혼합되지 않습니다 (예 : 응집 또는 응고가 발생하기 쉬운 경우).
개요로, 여기에서는 레벨 0 부품을 생성하는 원리를 자세히 설명한 다음 CyanoGate 키트를 사용하여 계층적 어셈블리를 사용하고 부부 전달에 적합한 벡터로 복제합니다. 그런 다음 부부 전이 과정, 형광 마커를 발현하는 축색 트랜스컨주간트 균주의 선택, 유세포계 또는 플레이트 리더를 사용하여 형광 데이터의 후속 획득을 입증합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0404</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (microbiology tested)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-500g</td>
			<td>Used in 8.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41026</td>
			<td>Used in 6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BpiI (BbsI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI (Eco31I)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0291</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>A1491.0005</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used in 4.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>Used in 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td>DNA extraction kit. Used in 5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega Microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td>Used in 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10021083</td>
			<td>Used in 2.3.1, 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10356553</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11815-024</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filters (0.45 &#956;m)</td>
			<td>MF-Millipore</td>
			<td>HAWP02500</td>
			<td>Used in 3.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) &#181;CLEAR</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td>Used in 4.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1020S</td>
			<td>Used in 1.1.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td>DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro incubator with LEDs</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>-</td>
			<td>Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21108</td>
			<td>Used in 7.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used in 2.3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 chemically competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td>Used in 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>K813</td>
			<td>Used in 4.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>Used in 1.1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load 1 kb DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0468S</td>
			<td>Used in Figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>72.692.210</td>
			<td>Used in 3.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>J61820.06</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>612U96</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill. Used in 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit

시아노박테리아는 유용한 산업 상품의 재생 가능한 생산을 위해 유전자 변형될 수 있는 원핵광합성 생물의 다양한 그룹입니다. 합성 생물학의 최근 발전은 CyanoGate와 같은 여러 복제 도구 키트의 개발로 이어졌다, 시아노 박테리아로 후속 변환 또는 부부 전달을위한 플라스 미드 벡터를 구축하기위한 표준화 모듈 형 복제 시스템. 여기서 우리는 자가 복제 벡터(예를 들어, 형광 마커 발현 카세트를 운반)를 조립하기 위한 상세한 방법과 시아노박테리아 균주 시네코시스티스 sp. PCC 6803 또는 Synechococcus로 벡터의 부부 전달을 설명한다. elongatus UTEX 2973. 또한, 플레이트 리더 또는 유세포측정법을 사용하여 유전적 부분(예를 들어, 프로모터)의 성능을 특성화하는 방법을 간략하게 설명한다.

골든 게이트 조립 워크플로우를 입증하기 위해, 식 카세트는 다음 레벨 0 부품을 포함하는 레벨 1 위치 1(Forward) 수용자 벡터(pICH47732)로 조립되었다: C-피코시아닌 오페론 P cpc560(pC0.005)의 프로모터, eYFP(pC0.008) 및 이중 종결자 T rrnB(pC0.082)에 대한 코딩 시퀀스(pC0.082)(12). 조립 반응의 변형 후, 성공적인 어셈블리는 대장균 ?...

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Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

여기서, 우리는 i) CyanoGate 모듈식 클로닝 툴킷을 사용하여 자가 복제 벡터를 조립하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시하고, ii) 컨쥬게이션에 의해 시아노박테리아 숙주에 벡터를 도입하고, iii) 형질전환 시아노박테리아 균주를 특성화한다. 플레이트 리더 또는 유세포 분석.

시안게이트 모듈형 복제 툴킷을 사용하여 컨쥬게이션에 의한 시아노박테리아의 유전자 변형

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

시아노박테리아는 합성 생물학 및 재생 가능한 생명 공학 응용 분야에 유용한 플랫폼으로 점점 더 인식되는 광합성 미생물의 중요한 필럼입니다. 따라서 다른 시아노균 종에 이종 DNA의 설계, 복제 및 도입을 단순화하는 강력한 기술을 개발하는 것이 중요합니다. 따라서 이 기술은 자연적으로 변형할 수 없는 시아노균 종에 DNA를 도입하기 위한 균주 또는 삼각조라는 잘 확립된 방법을 보여줍니다.컨쥬게이션은 단일 세포에서 다세포 필라멘트 종에 이르는 다양한 시아노균 균주에서 성공적으로 수행되었습니다. 이 기술을 처음 시도하는 경우, 시아노균과 대장균 균주를 모두 조심스럽게 처리하십시오. 예를 들어 프로토콜에 제공된 값 위에 원심 분리하지 말고 소용돌이하지 마십시오.박테리아와 시아노박테리아를 혼합하는 것은 처음 사용자에게 이상하게 보일 수 있습니다. 우리는 컨쥬게이션 과정을 시연함으로써 이를 명확히 하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 레벨 1 어셈블리를 생성한 후 적절한 레벨 T 수락자 벡터를 선택합니다.최종 레벨 1 어셈블리의 세 가지 최종 끝을 T 백본 레벨로 리게이트하는 적절한 끝 링크를 선택합니다. 하나 이상의 레벨 하나의 어셈블리를 레벨 T로 조립하려면 PBI1 및 필요한 종단 링크 벡터로 반응 믹스를 준비합니다. 열 사이클러 프로그램을 설정하고 원고에 따라 진행합니다.첫날, 시에코시스테스 PCC 6803 또는 Synechococcus longatus UTEX 2973의 신선한 문화를 설정하여 시아노균 배양을 성장. 열 멸균 루프를 사용하여 축 BG-11 마고 플레이트에서 세포를 긁어 내고 신선한 BG-11 배지의 50 밀리리터로 채워진 100 밀리리터 원추형 플라스크에 넣습니다. 100 RPM에서 30섭씨에서 시코시스티스 PCC 6803 세포 배양을 성장시키기 위해 플라스크를 조명과 함께 흔들리는 인큐베이터에 넣습니다.Synechocous longatus UTEX 2973의 경우, 100 RPM에서 섭씨 40도에서 세포 배양을 성장시합니다. 1~2일 후에는 세포 배양의 1밀리리터를 그리고 분광계에 측정합니다. OD 750의 흡광도는 0.5에서 1.5에 도달합니다.둘째 날, 밀리리터당 100 마이크로그램의 농도로 밀리리터와 클로람페니콜의 농도로 암피실린을 함유한 벡터 PRK24 및 PRL528을 포함하는 MC1061 E.coli 도우미 균주를 밀리리터당 25 마이크로그램의 농도로 접종한다. 흔들리는 인큐베이터에서 225 RPM에서 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 자랍니다. 그런 다음 레벨 T 화물 벡터를 운반하는 대장균 배양과 적절한 항생제를 함유하는 LB 배지의 5밀리리터를 접종한다.흔들리는 인큐베이터에서 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 문화를 성장시다. 셋째 날에는 실온에서 10분 동안 도우미와 화물 E.coli 하룻밤 문화를 3, 000g에서 원심분리합니다. 셀 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.항생제없이 신선한 LB 배지의 5 밀리리터를 추가하여 펠릿을 씻어. 상류체를 제거하기 위해 위아래로 부드럽게 파이프를 하고 원심분리기를 사용하여 펠릿을 다시 놓습니다. 이 세척 단계를 세 번 반복하여 하룻밤 문화에서 잔류 항생제를 제거하십시오.마지막 세척 후, 초기 배양 부피의 LB 배지의 절반 부피로 세포 펠릿을 다시 놓는다. 그런 다음 도우미 균주의 450 마이크로리터를 2 밀리리터 튜브에 450 마이크로리터의 마이크로리터를 결합하고 실온에서 둡니다. 다음으로, 실온에서 10분 동안 1밀리리터의 시아노균 배양1밀리리터를 원심분리하여 시아노균 배양을 준비한다.그런 다음 셀 펠릿을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 버리십시오. 동일한 초기 볼륨의 신선한 BG-11 배지를 추가하여 펠릿을 4번 세척합니다. 세척된 시아노균 배양900마이크로리터를 2밀리리터 튜브에 결합된 대장균 균주 900마이크로리터에 추가합니다.위아래로 부드럽게 배관하여 문화를 섞는다. 시에코시스티스 PCC 6803에 대해 30분 또는 시에코코커스 길쭉성 UTEX 2973의 경우 2시간 동안 실온에서 혼합물을 배양한다. 상온에서 10분 동안 혼합물을 1, 500g에서 원심분리합니다.상류체의 1.6 밀리리터를 제거하고 나머지 상체에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 항생제없이 LB BG-11 한천 플레이트에 0.45 미크론 막 필터 를 놓습니다. E.coli/cyano균 배양 믹스의 200마이크로리터를 멸균 스프레더 또는 멸균 배드 팁으로 멤브레인에 조심스럽게 퍼집니다.파라핀 필름으로 접시를 밀봉하고 24 시간 동안 조명 인큐베이터에 접시를 배치합니다. 24시간 후, 화염 살균 된 집게를 사용하여 막을 적절한 항생제를 포함하는 신선한 BG-11 한고 판으로 조심스럽게 이송하여 화물 벡터를 선택한다. 파라핀 필름으로 접시를 밀봉하고 식민지가 나타날 때까지 이전과 동일한 조건에서 배양하십시오.식민지는 일반적으로 Synechocystis PCC 6803 및 Synechococcus longatus UTEX 2973에 대 한 3-7 일 동안 7-14 일 후에 나타납니다. 물자를 선택하려면, 열 멸균 접종 막대를 사용하여, 멤브레인에서 적어도 두 개의 개별 식민지를 선택하고 적절한 항생제를 포함하는 새로운 BG-11 천판에 줄무늬. 그런 다음 치아 노 균 배양의 줄무늬를 LB 배지의 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 접종하고 흔들리는 인큐베이터에서 225 RPM에서 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양합니다.명확한 배양은 대장균 오염의 부재를 확인합니다. 7 일의 충분한 성장 기간에 따라, 장기 저온 저장 또는 후속 실험을위한 액체 문화를 설정하는 개별 축축식민지를 선택합니다. 이 연구에서는 황금 게이트 어셈블리 워크플로우가 입증되었습니다.조립 반응의 변환에 따라, 성공적인 어셈블리는 E.coli 식민지의 표준 파란색 흰색 검사를 사용하여 확인되었다. 레벨 1 벡터 및 끝 링크에서 eYFP 식 카세트는 벡터 cpcBA-eYFP를 주기 위해 레벨 T 수용자 벡터로 조립하였다. 조립된 cpcBA-eYFP 벡터는 제한 소화에 의해 검증되었다.cpcBA-eYFP 또는 pPMQAK1-T 벡터의 성공적인 부부 전달은 시에코시티스 PCC 6803 및 Synechocous elongatus UTEX 2973에 대한 멤브레인에 최대 수백 개의 식민지의 성장을 초래했다. 강력한 Pcpc560 프로모터에 대해 예상대로, 유동 세포계로부터의 플레이트 판독기 및 eYFP 형광으로부터의 정규화된 eYFP 형광에 대한 값은 음의 대조에 비해 높았다. 플레이트 판독기와 유동 세포계 모두, 형광 값은 Synechococcus longatus UTEX 2973에서 Synechocystis PCC 6803에서 보다는 더 높았습니다.어떤 균주에 따라 최소 시간 동안 배양해야 합니다.

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Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

표현 복제가 Grb2 신호 복합 단지를 공부하기 위해 높은 콘텐츠 이미징 워크 플로우

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높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

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As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...

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