Name: genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit
Uploaded: 2019-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

Forfatterne er takknemlige for PHYCONET bioteknologi og biologisk vitenskap Research Council (BBSRC) nettverk i Industrial bioteknologi og bioenergi (NIBB) og Industrial bioteknologi Innovation Centre (IBioIC) for økonomisk støtte. GARG, AASO og AP erkjenner finansiering støtte fra BBSRC EASTBIO CASE PhD-programmet (gi nummer BB/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) PhD-programmet, og IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP) PhD-programmet, Henholdsvis. Vi takker Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London), og Poul Eric Jensen og Julie Annemarie Zita Zedler (Universitetet i København) for plasmider vektor og protokoll bidrag og råd.

1. Vector montering ved hjelp av Plant MoClo og CyanoGate verktøysett
Merk: før du fortsetter med vektor montering, anbefales det sterkt at brukerne gjør seg kjent med vektoren nivå strukturer av anlegget og CyanoGate MoClo systemer12,15.
<ol><li>Bygging av nivå 0 deler Merk: nivå 0-deler kan bli syntetisert som komplette vektorer eller som lineære sekvenser for montering med nivå 0-aksept Orer (for eksempel gBlocks, IDT)....

Golden Gate forsamlingen har flere fordeler sammenlignet med andre vektor montering metoder, spesielt i form av skalerbarhet20,21. Likevel, å sette opp Golden Gate-systemet i et laboratorium krever tid til å utvikle en fortrolighet med de ulike delene og Acceptor vektor biblioteker og generelle monteringsprosesser. Nøye planlegging er ofte nødvendig for mer komplekse forsamlinger eller når du utfører et stort antall komplekse forsamlinger parallelt (for eks...

Cyanobakterier er autotrofe bakterier som kan brukes for biosyntesen av et bredt utvalg av naturlige og heterologous høy verdi metabolske produkter1,2,3,4,5, 6i den. Flere hekk må fortsatt overvinnes for å utvide sin kommersielle levedyktighet, spesielt, den relativt dårlige rentene sammenlignet med heterotrofe bio-plattformer (f. eks, Escherichia coli og gjær)7. Den nylige utvidelse av tilgjengelige genetisk engineering verktøy og opptak av syntetisk biologi paradigmet i cyanobacterial forskning bidrar til å overvinne slike utfordringer og videreutvikle cyanobakterier som effektiv biofactories8, 9,10.
De viktigste tilnærmingene for å innføre DNA i cyanobakterier er transformasjon, bøyning og electroporation. Vektorer overføres til cyanobakterier ved transformasjon eller electroporation er "selvmord" vektorer (dvs. integrerende vektorer som letter homologe rekombinasjon), mens selv replikere vektorer kan overføres til cyanobakterier av transformasjon, Bøyning eller electroporation. For det første er en protokoll tilgjengelig for Engineering modell arter mottagelig for naturlig transformasjon11. Flere i den seneste tid, en Modular Klon (MoClo) verktøyet for cyanobakterier alarmert CyanoGate er blitt bebygget det ansette en standardisert gylden gate vektor montering metoden for ingeniørvitenskap benytter naturlig transformasjon, electroporation eller Bøyning12.
Golden Gate-type montering teknikker har blitt stadig mer populært de siste årene, og montering standarder og del bibliotekene er nå tilgjengelig for en rekke organismer13,14,15,16 ,17. Golden Gate bruker type IIS begrensning enzymer (f. eks BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI og AarI) og en drakt av aksept Orer og unike overheng å lette retningsbestemt hierarkisk montering av flere sekvenser i en "One pot" montering reaksjon. Type IIS restriksjon enzymer gjenkjenne en unik asymmetrisk sekvens og kutte en definert avstand fra deres anerkjennelse nettsteder for å generere en forskjøvet, "klebrig ende" cut (vanligvis en 4 nukleotid [NT] overheng), som senere kan utnyttes til å kjøre bestilte DNA monterings reaksjoner15,18. Dette har muliggjort utviklingen av store biblioteker av modulære nivå 0 deler (for eksempel arrangører, åpne lese RAM mer og terminatorer) definert av en felles syntaks, for eksempel PhytoBricks standard19. Nivå 0 deler kan deretter lett monteres i nivå 1 uttrykks kassetter, som følger mer komplekse høyere rekkefølge samlinger (f. eks multigene uttrykk konstruksjoner) kan bygges i en Acceptor vektor av valget12,15. En viktig fordel med Golden Gate-type montering teknikker er deres amenability til automatisering ved høy gjennomstrømming fasiliteter, slik som DNA støperier20,21, som kan tillate for testing av komplekse eksperimentelle design som kan ikke lett oppnås ved manuell arbeidskraft.
CyanoGate bygger på det etablerte anlegget MoClo system12,15. Å innlemme en ny del i CyanoGate, delen sekvensen må først være tamme, dvs., "ulovlig" anerkjennelse nettsteder for BsaI og BpiI må fjernes. I tilfelle av en del koding for en åpen lesning ramme (dvs. en koding sekvens, CDS), kan anerkjennelse nettsteder bli forstyrret ved å generere synonymt mutasjoner i sekvensen (dvs. endre en Codon til et alternativ som koder for samme aminosyre rester). Dette kan oppnås ved en rekke tilnærminger, alt fra DNA-syntese til polymerase kjedere reaksjon (PCR) forsterkning-baserte strategier som Gibson forsamlingen22. Avhengig av uttrykket vert som brukes, bør det utvises forsiktighet for å unngå innføringen av sjeldne kodon som kan hemme effektiviteten av oversettelsen23. Fjerne anerkjennelse nettsteder i promoter og Terminator sekvenser er vanligvis en risikofylt forsøke, som modifikasjoner kan påvirke funksjon og delen kan ikke utføre som forventet. For eksempel kan endringer i antatte transkripsjon faktor bindende nettsteder eller ribosom bindende nettsted innen en promoter endre styrke og respons til induksjon/undertrykkelse. Likeledes modifikasjoner til viktige Terminator strukturelle funksjoner (f. eks GC rike stammen, loop og Poly-U Tail) kan endre oppsigelse effektivitet og virkning gen Expression24,25. Selv om flere elektroniske ressurser er tilgjengelige for å forutsi aktiviteten til promoter og Terminator sekvenser, og informere om en foreslått mutasjon vil påvirke ytelsen26,27, disse verktøyene er ofte dårlig prediktorer av ytelse i cyanobakterier28,29,30.. Som sådan, in vivo karakterisering av modifiserte deler er fortsatt anbefalt å bekrefte aktivitet. Å bistå med kloning av gjenstridige sekvenser, CyanoGate inneholder en lav kopi kloning Acceptor vektor basert på BioBrick vektor pSB4K512,16,31. Videre, en "design og bygge" Portal er tilgjengelig gjennom Edinburgh Genova Foundry å hjelpe til med vektor design (dab.genomefoundry.org). Til slutt, og viktigst, inkluderer CyanoGate to Level T Acceptor vektor design (tilsvarende Level 2 Acceptor vektorer)15 for innføring av DNA i cyanobakterier bruker selvmords vektorer, eller bred Host-Range vektorer i stand til selv-replikering i flere cyanobacterial arter32,33,34.
Her vil vi fokusere på å beskrive en protokoll for å generere Level T selv replikering vektorer og genetisk modifisering av Synechocystis PCC 6803 og Synechococcus elongatus UTEX 2973 (Synechocystis PCC 6803 og S. elongatus UTEX 2973 heretter) av Bøyning (også kjent som Tri-Parental paring). Ekteskapelige overføring av DNA mellom bakterielle celler er en godt beskrevet prosess og har vært tidligere brukt for Engineering cyanobacterial arter, spesielt de som ikke er naturlig kompetente, slik som S. elongatus UTEX 297335, 36,37,38,39,40,41. I korte trekk, cyanobacterial kulturer er inkubert med en E. coli stamme bærer vektoren skal overføres (den "lasten" vektor) og vektorer (enten i samme E. coli belastning eller i flere stammer) for å aktivere Bøyning ("mobiliserer" og "Helper" vektorer). Det er nødvendig med fire nøkkel vilkår for ekteskapelige overføring: 1) direkte kontakt mellom cellene som er involvert i DNA-overføring, 2) laste vektoren må være kompatibelt med Bøyning (dvs. den må inneholde en passende opprinnelse for overføring (oriT), også kjent som en bom (grunnlaget for mobilitet) nettsted), 3) et DNA skår protein (f. eks, kodet av Mob GENET) som Nicks DNA ved oriT å INITIERE enkelt-strandet overføring av DNA i cyanobacterium må være til stede og uttrykt fra enten lasten eller Helper vektorer, og 4) den overførte DNA må ikke ødelegges i mottaker cyanobacterium (dvs. må være motstandsdyktig mot degradering av for eksempel restriksjon endonuclease aktivitet)35,42. For lasten vektoren å vedvare, opprinnelsen til replikering må være kompatibel med mottakeren cyanobacterium å tillate for selv-replikering og spredning i datter celler innlegg divisjon. Å hjelpe med vilkårene 3 og 4, adskillige hjalp vektorer er anvendelig igjennom Addgene og annet reklamen kilder det omsette til kode for Mob likeledes idet adskillige methylases å beskytte fra innfødt endonucleases inne det vert cyanobacterium43. I denne protokollen, ble Bøyning tilrettelagt av en MC1061 E. coli stamme bærer mobiliserer og hjelper vektorer pRK24 (www. addgeneorg/51950) og pRL528 (www.addgene.org/58495), henholdsvis. Forsiktighet må utvises ved valg av vektorer som skal brukes til ekteskapelige overføring. For eksempel, i CyanoGate Kit den selv-replikere lasten vektor pPMQAK1-T koder for en Mob protein12. Men pSEVA421-T ikke44, og som sådan, må Mob uttrykkes fra en passende hjelper vektor. De vektorer som brukes bør også være hensiktsmessig å målet organisme. For eksempel, effektiv ekteskapelige overføring i Anabaena Sp. PCC 7120 krever en hjelper vektor som beskytter mobiliserer vektor mot fordøyelsen (f. eks pRL623, som koder for de tre methylases AvaiM, Eco47iiM og Ecot22iM)45, i 46.
I denne protokollen vi ytterligere skissere hvordan å karakterisere utførelsen av deler (dvs. arrangører) med et fluorescerende markør ved hjelp av en plate leser eller en flyt flowcytometer. Flow cytometers er i stand til å måle fluorescens på en enkelt celle basis for en stor befolkning. Videre Flow cytometers tillate brukere å "gate" de ervervet data og fjerne bakgrunnsstøy (f. eks, fra partikler i kultur eller forurensning). I kontrast, plate lesere erverve en samlet fluorescens måling av et gitt volum av kultur, vanligvis i flere replikere brønner. Viktige fordeler av plate lesere over cytometers inkluderer lavere kostnader, høyere tilgjengelighet og vanligvis ingen krav til spesialist programvare for nedstrøms dataanalyser. De viktigste ulempene med plate lesere er relativt lavere følsomhet i forhold til cytometers og potensielle problemer med den optiske tettheten av målte kulturer. For sammenlignende analyser, plate leser prøver må være normalisert for hver brønn (for eksempel til en måling av kultur tetthet, vanligvis tatt som absorbansen ved optisk tetthet ved 750 NM [OD750]), som kan føre til unøyaktigheter for prøver som er for tett og/eller ikke godt blandet (f. eks, når utsatt for aggregering eller flokk ule Rings).
Som en oversikt, her viser vi i detalj prinsippene for å generere nivå 0 deler, etterfulgt av hierarkisk montering ved hjelp av CyanoGate Kit og kloning til en vektor egnet for ekteskapelige overføring. Vi viser deretter ekteskapelige overføringsprosessen, utvalg av axenic transconjugant stammer uttrykker en fluorescerende markør, og påfølgende oppkjøp av fluorescens data ved hjelp av en flyt flowcytometer eller en plate leser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0404</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (microbiology tested)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-500g</td>
			<td>Used in 8.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41026</td>
			<td>Used in 6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BpiI (BbsI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI (Eco31I)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0291</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>A1491.0005</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used in 4.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>Used in 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td>DNA extraction kit. Used in 5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega Microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td>Used in 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10021083</td>
			<td>Used in 2.3.1, 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10356553</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11815-024</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filters (0.45 &#956;m)</td>
			<td>MF-Millipore</td>
			<td>HAWP02500</td>
			<td>Used in 3.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) &#181;CLEAR</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td>Used in 4.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1020S</td>
			<td>Used in 1.1.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td>DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro incubator with LEDs</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>-</td>
			<td>Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21108</td>
			<td>Used in 7.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used in 2.3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 chemically competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td>Used in 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>K813</td>
			<td>Used in 4.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>Used in 1.1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load 1 kb DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0468S</td>
			<td>Used in Figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>72.692.210</td>
			<td>Used in 3.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>J61820.06</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>612U96</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill. Used in 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit

Cyanobakterier er en mangfoldig gruppe av prokaryote fotosyntetiske organismer som kan være genetisk modifisert for fornybar produksjon av nyttige industrielle varer. Nylige fremskritt i syntetisk biologi har ført til utvikling av flere kloning verktøysett som CyanoGate, et standardisert modulært kloning system for å bygge plasmider vektorer for påfølgende transformasjon eller ekteskapelige overføring til cyanobakterier. Her skisserer vi en detaljert metode for montering av en selv-replikere vektor (f. eks, bærer en fluorescerende markør uttrykk kassett) og ekteskapelige overføring av vektoren inn i cyanobacterial stammer Synechocystis Sp. PCC 6803 eller Synechococcus elongatus UTEX 2973. I tillegg skisserer vi hvordan å karakterisere ytelsen til en genetisk del (for eksempel en promoter) ved hjelp av en plate leser eller flow flowcytometri.

For å demonstrere Golden Gate montering arbeidsflyt, en uttrykks kassett ble montert i nivå 1 posisjon 1 (Forward) Acceptor vektor (pICH47732) som inneholder følgende nivå 0 deler: arrangøren av C-phycocyanin operon Pcpc560 (PC 0.005), kodingen sekvensen for eYFP (pC 0.008) og den doble Terminator TrrnB (PC 0.082)12. Etter transformasjon av monterings reaksjonen ble vellykkede forsamlinger identifisert ved bruk av standa...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Her presenterer vi en protokoll som beskriver hvordan jeg) monterer en selv-replikere vektor bruker CyanoGate modulære kloning Toolkit, II) innføre vektoren i en cyanobacterial vert ved Bøyning, og III) karakterisere transgene cyanobakterier stammer ved hjelp av en plate leser eller strømnings flowcytometri.

Genetisk modifisering av cyanobakterier av Bøyning bruke CyanoGate Modular kloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Cyanobakterier er en viktig phylum av fotosyntetiske mikrober som i økende grad blir anerkjent som nyttige plattformer for syntetisk biologi og fornybar bioteknologi applikasjoner. Så utvikle robuste teknikker for å forenkle design, kloning, og innføring av heterolog dna i ulike cyanobakterielle arter er viktig. Så denne teknikken demonstrerer en veletablert metode som kalles bøyning eller triparental parring for å introdusere DNA i cyanobakterielle arter som ikke er naturlig transformerbare.Bøyning har blitt utført i et bredt spekter av cyanobakterielle stammer fra enkeltcelle til flercellede filamentøse arter. Hvis du prøver denne teknikken for første gang, må du være forsiktig med å håndtere både cyanobakterielle og E.coli-stammer med forsiktighet. For eksempel, ikke sentrifugere over verdiene som er gitt i protokollen, og ikke vortex.Blanding av bakterier og Cyanobakterier kan virke rart for førstegangsbrukere. Vi håper at ved å demonstrere bøyningsprosessen, vil vi bidra til å avklare dette. Etter bygging av nivå en samlinger, velg et passende nivå T acceptor vektor.Velg en passende sluttkobling for å ligate de tre viktigste enden av den siste nivå en montering til nivå T ryggraden. For å montere én eller flere nivå én-samlinger i nivå T, klargjør du en reaksjonsblanding med PBI1 og den nødvendige sluttkoblingsvektoren. Sett opp det termiske cyclerprogrammet og fortsett i henhold til manuskriptet.På dag én, vokse cyanobakteriell kultur ved å sette opp en frisk kultur av Synechocystis PCC 6803 eller Synechococcus elongatus UTEX 2973. Med en varmesteril løkke, skrap cellene fra den aksiske BG-11 agarplaten og legg i en 100 milliliter konisk kolbe fylt med 50 milliliter frisk BG-11 medium for å inokulere. Plasser kolben i en risting inkubator med belysning for å vokse Synechocystis PCC 6803 cellekulturer ved 30 grader Celsius ved 100 RPM.For Synechococcus elongatus UTEX 2973, vokse cellekulturene på 40 grader Celsius ved 100 RPM. Etter en til to dager tegner du en milliliter cellekultur og måler på et spektrofotometer. Absorbansen ved OD 750 når 0,5 til 1,5.På dag to inokulerer du en MC1061 E.coli-hjelpestamme som inneholder vektorer PRK24 og PRL528 i fem milliliter LB-medium med ampicillin i en konsentrasjon på 100 mikrogram per milliliter og kloramfenikol med en konsentrasjon på 25 mikrogram per milliliter. Vokse på 37 grader Celsius over natten ved 225 RPM i en risting inkubator. Inokuler deretter fem milliliter LB-medium som inneholder passende antibiotika med E.coli-kulturen som bærer nivået T-lastvektoren.Vokse kulturen på 37 grader Celsius over natten på 225 RPM i en risting inkubator. På dag tre sentrifugerer hjelperen og lasten E.coli over natten kulturer på 3,000 g i 10 minutter ved romtemperatur. Kast det overnaturlige uten å forstyrre cellepellet.Vask pellets ved å legge til fem milliliter frisk LB medium uten antibiotika. Resuspend pellet ved å forsiktig pipettering opp og ned og sentrifuge for å fjerne supernatant. Gjenta dette vasketrinnet tre ganger for å fjerne gjenværende antibiotika fra nattkulturen.Etter den siste vasken, resuspend cellen pellet i halvparten av volumet av LB medium av den opprinnelige kulturvolum. Kombiner deretter 450 mikroliter av hjelperbelastningen med 450 mikroliter av lastbelastningen i et to milliliter rør og la det stå ved romtemperatur. Deretter forbereder du cyanobakteriell kultur ved å sentrifugere en milliliter cyanobakteriell kultur ved 1, 500 g i 10 minutter ved romtemperatur.Kast deretter supernatanten forsiktig uten å forstyrre cellepelleten. Vask pelleten fire ganger ved å tilsette frisk BG-11 medium av samme startvolum. Tilsett 900 mikroliter av den vasket cyanobakterielle kulturen til 900 mikroliter av de kombinerte E.coli-stammene i et to milliliter rør.Bland kulturene ved å forsiktig pipettering opp og ned. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 30 minutter for Synechocystis PCC 6803 eller to timer for Synechococcus elongatus UTEX 2973. Sentrifuger blandingen ved 1, 500 g i 10 minutter ved romtemperatur.Fjern 1,6 milliliter av supernatant og resuspend pellet i gjenværende supernatant. Plasser ett 0,45 mikron membranfilter på en LB BG-11 agarplate uten antibiotika. Spre forsiktig 200 mikroliter av E.coli/cyanobakteriell kulturblanding på membranen med en steril spreder eller en steril bøyd spiss.Forsegle platen med parafinfilm og legg platen i en opplyst inkubator i 24 timer. Etter 24 timer, nøye overføre membranen ved hjelp av flamme steriliserte tang til en frisk BG-11 agar plate som inneholder passende antibiotika å velge for last vektor. Forsegle platen med parafinfilm og inkuber under de samme forholdene som tidligere til kolonier vises.Kolonier vises vanligvis etter 7-14 dager for Synechocystis PCC 6803 og 3-7 dager for Synechococcus elongatus UTEX 2973. For å velge konjugants, ved hjelp av en varmesteril inoculating stang, velg minst to individuelle kolonier fra membranen og strek på en ny BG-11 agar plate som inneholder passende antibiotika. Deretter inokulerer en strek av cyanobakteriell kultur i en 15 milliliter sentrifuge rør som inneholder fem milliliter LB medium og inkubere ved 37 grader Celsius over natten ved 225 RPM i en ristende inkubator.Den klare kulturen bekrefter fraværet av E.coli-forurensning. Etter en tilstrekkelig vekstperiode på syv dager, plukke individuelle asikonske kolonier for å sette opp flytende kulturer for langsiktig kryo lagring eller påfølgende eksperimentering. I denne studien ble golden gate montering arbeidsflyt demonstrert.Etter transformasjon av monteringsreaksjonen ble vellykkede forsamlinger identifisert ved hjelp av standard blå hvit screening av E.coli kolonier. EYFP-uttrykkskassetten i nivå én-vektoren og sluttkoblingen en vektor ble deretter satt sammen til en nivå T-akseptorvektor for å gi vektoren CPCBA-eYFP. Den monterte cpcBA-eYFP-vektoren ble verifisert av begrensningsfordøyelsen.Vellykket konjugal overføring av cpcBA-eYFP eller pPMQAK1-T vektor resulterte i vekst av opptil flere hundre kolonier på membranen for Synechocystis PCC 6803 og Synechococcus elongatus UTEX 2973. Som forventet for den sterke Pcpc560-promotoren var verdiene for normalisert eYFP-fluorescens fra plateleseren og eYFP-fluorescensen per celle fra strømningscytometeret høye sammenlignet med den negative kontrollen. Med både plateleseren og strømningscytometeret var fluorescensverdiene høyere i Synechococcus elongatus UTEX 2973 enn i Synechocystis PCC 6803.Sørg for at du inkuberer for minimumstiden i henhold til hvilken belastning du konjugerer.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

En High-innhold Imaging arbeidsflyt for å studere Grb2 signalveier Komplekser av Expression kloning

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genmodifisering og Rekombinasjon av spyttkjertel Organ kulturer

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecal Glukokortikoid analyse: Ikke-invasiv Adrenal Monitoring i Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation, Isolering og Imaging av Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig Måling av mitokondrie Kalsium og Mitokondriell membranpotensialet i levende celler med fluorescerende mikros

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering av DNA komprimering i Cyanobakterie av høyspent Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

En rørledning ved hjelp av bilateral in utero elektroporasjon for å avhøre genetiske påvirkninger på gnageratferd

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...