Name: genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit
Uploaded: 2019-10-31T15:00:00
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Os autores são gratos à Rede de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas da PHYCONET (BBSRC) em Biotecnologia Industrial e Bioenergia (NIBB) e ao Centro de Inovação em Biotecnologia Industrial (IBioIC) pelo apoio financeiro. GARG, AASO e AP reconhecem o apoio ao financiamento do programa BBSRC EASTBIO CASE PhD (número de subvenção BB/M010996/1), do Programa de Doutorado Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) e do programa de doutorado IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP), Respectivamente. Agradecemos conrad Mullineaux (Queen Mary University de Londres), e Poul Eric Jensen e Julie Annemarie Zita Zedler (Universidade de Copenhague) para plasmid vetor e protocolo contribuições e conselhos.

1. Montagem vetorial usando os kits de ferramentas Plant MoClo e CyanoGate
NOTA: Antes de prosseguir com a montagem vetorial, recomenda-se fortemente que os usuários se familiarizem com as estruturas de nível vetorial dos sistemas Plant e CyanoGate MoClo12,15.
<ol><li>Construção de peças de nível 0 NOTA: As peças de nível 0 podem ser sintetizadas como vetores completos ou como sequências lineares para montagem com aceitad...

Golden Gate montagem tem várias vantagens em comparação com outros métodos de montagem vetorial, particularmente em termos de escalabilidade20,21. No entanto, a criação do sistema Golden Gate em um laboratório requer tempo para desenvolver uma familiaridade com as várias partes e bibliotecas vetorial aceitadoras e processos de montagem em geral. O planejamento cuidadoso é muitas vezes necessário para assembléias mais complexas ou ao realizar um grande ...

Cianobactérias são bactérias autotróficas que podem ser usadas para a biossíntese de uma grande variedade de produtos metabólicos naturais e heterologous de alto valor1,2,3,4,5, 6. Vários obstáculos ainda precisam ser superados para expandir sua viabilidade comercial, mais notavelmente, os rendimentos relativamente pobres em comparação com as bioplataformas heterotróficas (por exemplo, Escherichia coli e levedura)7. A recente expansão das ferramentas de engenharia genética disponíveis e a adoção do paradigma da biologia sintética na pesquisa cianobacteriana estão ajudando a superar tais desafios e desenvolver ainda mais as cianobactérias como biofábricas eficientes8, 9,10.
As principais abordagens para a introdução do DNA em cianobactérias são transformação, conjugação e eletroporação. Os vetores transferidos para cianobactérias por transformação ou eletroporação são vetores "suicidas" (ou seja, vetores integrativos que facilitam a recombinação homóloga), enquanto vetores auto-replicantes podem ser transferidos para cianobactérias por transformação, conjugação ou eletroporação. Para o primeiro, um protocolo está disponível para a engenharia de espécies modelo passível de transformação natural11. Mais recentemente, um kit de ferramentas modular de clonagem (MoClo) para cianobactérias chamado CyanoGate foi desenvolvido que emprega um método padronizado de montagem de vetores Golden Gate para engenharia usando transformação natural, eletroporação ou conjugação12.
Golden Gate-tipo técnicas de montagem tornaram-se cada vez mais popular nos últimos anos, e os padrões de montagem e bibliotecas parte estão agora disponíveis para uma variedade de organismos13,14,15,16 17depessoas. Golden Gate usa enzimas de restrição iis tipo (por exemplo, BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI e AarI) e um terno de aceitadores e saliências únicas para facilitar a montagem hierárquica direcional de várias seqüências em uma reação de montagem de "um pote". Enzimas de restrição tipo IIS reconhecem uma seqüência assimétrica única e reduzem uma distância definida de seus locais de reconhecimento para gerar um corte escalonado de "extremidade pegajosa" (tipicamente uma saliência de 4 nucleotídeos [NT]), que pode ser posteriormente explorada para dirigir o DNA ordenado reações de montagem15,18. Isso facilitou o desenvolvimento de grandes bibliotecas de peças modulares de nível 0 (por exemplo, promotores, quadros de leitura aberta e exterminadores) definidos por uma sintaxe comum, como o padrão PhytoBricks19. As peças de nível 0 podem então ser prontamente montadas em de expressão de nível 1, seguindo as quais conjuntos de ordem superior mais complexos (por exemplo, construções de expressão multigênica) podem ser construídos em um vetor de aceitação de escolha12,15. Uma vantagem fundamental das técnicas de montagem do tipo Golden Gate é a sua comodidade à automação em instalações de alta produção, como fundições de DNA20,21,que podem permitir o teste de projetos experimentais complexos que não pode ser facilmente alcançado por trabalho manual.
CyanoGate baseia-se no sistema moclo planta estabelecido12,15. Para incorporar uma nova parte no CyanoGate, a sequência de parte deve primeiro ser domesticada, ou seja, sites de reconhecimento "ilegais" para BsaI e BpiI devem ser removidos. No caso de uma codificação de parte para um quadro de leitura aberta (ou seja, uma sequência de codificação, CDS), os sites de reconhecimento podem ser interrompidos gerando mutações sinônimos na sequência (ou seja, alterando um códon para uma alternativa que codifica para o mesmo resíduo de aminoácidos). Isso pode ser alcançado por uma variedade de abordagens, que vão desde a síntese de DNA até estratégias baseadas em amplificação de amplificação de polimerase (PCR), como a montagemGibson 22. Dependendo da expressão do hospedeiro que está sendo usada, o cuidado deve ser tomado para evitar a introdução de códons raros que poderiam inibir a eficiência da tradução23. Remover sites de reconhecimento em sequências de promotores e exterminadores é tipicamente um esforço mais arriscado, pois as modificações podem afetar a função e a parte pode não funcionar como esperado. Por exemplo, as alterações aos locais de ligação ao fator de transcrição putativa ou ao site de ligação ribossoma dentro de um promotor podem alterar a força e a capacidade de resposta à indução/repressão. Da mesma forma, as modificações nas principais características estruturais do exterminador do futuro (por exemplo, o caule rico gc, loop e cauda poli-U) podem alterar a eficiência da terminação e afetar a expressão gênica24,25. Embora vários recursos on-line estejam disponíveis para prever a atividade das sequências de promotores e exterminadores, e informem se uma mutação proposta afetará o desempenho26,27,essas ferramentas são muitas vezes preditores pobres de desempenho em cianobactérias28,29,30.. . Como tal, a caracterização in vivo de peças modificadas ainda é recomendada para confirmar a atividade. Para ajudar com a clonagem de seqüências recalcitrantes, CyanoGate inclui uma cópia baixa de clonagem vetor convidado com base no vetor BioBrick pSB4K512,16,31. Além disso, um portal "Design and Build" está disponível através da Fundição do Genoma de Edimburgo para ajudar com o design vetorial (dab.genomefoundry.org). Por último, e mais importante, CyanoGate inclui dois projetos de vetor de aceitação nível T (equivalente a vetores de aceitadores de nível 2)15 para a introdução de DNA em cianobactérias usando vetores de suicídio, ou vetores de alcance de hospedeiro amplo capaz de auto-replicação em várias espécies cianobacterianas32,33,34.
Aqui vamos nos concentrar em descrever um protocolo para a geração de níveis T auto-replicantes vetores e a modificação genética de Synechocystis PCC 6803 e Synechococcus elongatus utex 2973 (Synechocystis PCC 6803 e S. elongatus UTEX 2973 depois disso) por conjugação (também conhecido como acasalamento triparental). A transferência conjugal de DNA entre células bacterianas é um processo bem descrito e tem sido usado anteriormente para a engenharia de espécies cianobacterianas, em particular aquelas que não são naturalmente competentes, como s. alongatus UTEX 297335, 36,37,38,39,40,41. Em resumo, as culturas cianobacterianas são incubadas com uma cepa De. coli carregando o vetor a ser transferido (o vetor de "carga") e vetores (seja na mesma cepa de E. coli ou em cepas adicionais) para permitir a conjugação ("mobilizador" e vetores de "ajudantes"). Quatro condições-chave são necessárias para a transferência conjugal ocorrer: 1) o contato direto entre as células envolvidas na transferência de DNA, 2) o vetor de carga deve ser compatível com o sistema de conjugação (ou seja, deve conter uma origem adequada de transferência (oriT), também conhecido como um bom (base de mobilidade) site), 3) uma proteína de corte de DNA (por exemplo, codificada pelo gene da máfia) que corta DNA no oriT para iniciar a transferência de dna para o cianobacterium deve estar presente e expressa de ambos os vetores de carga ou ajudante, e 4) o DNA transferido não deve ser destruído no receptor cyanobacterium (ou seja, deve ser resistente à degradação por, por exemplo, restrição atividade endosnuclease)35,42. Para que o vetor de carga persista, a origem da replicação deve ser compatível com a ciaanobacterium receptora para permitir a auto-replicação e proliferação em células filhas pós divisão. Para ajudar com as condições 3 e 4, vários vetores auxiliares estão disponíveis através de Addgene e outras fontes comerciais que codificam para a máfia, bem como várias metilases para proteger de endonucleases nativas no host cyanobacterium43. Neste protocolo, a conjugação foi facilitada por uma cepa MC1061 E. coli carregando mobilizadores e vetores auxiliares pRK24 (www.addgeneorg/51950) e pRL528 (www.addgene.org/58495), respectivamente. Deve ser tomado cuidado ao escolher os vetores para serem usados para transferência conjugal. Por exemplo, no kit CyanoGate o vetor de carga auto-replicante pPMQAK1-T codifica uma proteína Mob12. No entanto, pSEVA421-T não44,e, como tal, mob deve ser expressa a partir de um vetor ajudante adequado. Os vetores utilizados também devem ser apropriados para o organismo alvo. Por exemplo, a transferência conjugal eficiente em Anabaena sp. PCC 7120 requer um vetor auxiliar que proteja o vetor de mobilização contra a digestão (por exemplo, pRL623, que codifica as três metilases AvaiM, Eco47iiM e Ecot22iM)45, 46.
Neste protocolo, descrevemos ainda mais como caracterizar o desempenho das peças (ou seja, promotores) com um marcador fluorescente usando um leitor de placa ou um citometro de fluxo. Os citometros de fluxo são capazes de medir a fluorescência em uma única base celular para uma grande população. Além disso, os citometros de fluxo permitem aos usuários "portar" os dados adquiridos e remover o ruído de fundo (por exemplo, de material particulado na cultura ou contaminação). Em contraste, os leitores de placas adquirem uma medida agregada de fluorescência de um determinado volume de cultura, normalmente em vários poços de replicar. As principais vantagens dos leitores de placas sobre os citometros incluem o menor custo, maior disponibilidade e, normalmente, nenhum requisito para software especializado para análises de dados a jusante. As principais desvantagens dos leitores de placas são a sensibilidade relativamente menor em comparação com citometros e problemas potenciais com a densidade óptica de culturas medidas. Para análises comparativas, as amostras do leitor de placas devem ser normalizadas para cada poço (por exemplo, para uma medição da densidade cultural, normalmente tomada como a absorção na densidade óptica em 750 nm [OD750]),o que pode levar a imprecisões para amostras que são também denso e/ou não bem misturado (por exemplo, quando propenso à agregação ou flocculação).
Como uma visão geral, aqui demonstramos em detalhes os princípios de geração de peças de nível 0, seguido s uma montagem hierárquica usando o kit CyanoGate e clonagem em um vetor adequado para transferência conjugal. Em seguida, demonstramos o processo de transferência conjugal, a seleção de cepas transconjugantes axenic expressando um marcador fluorescente e a subsequente aquisição de dados de fluorescência usando um citometro de fluxo ou um leitor de placa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0404</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (microbiology tested)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-500g</td>
			<td>Used in 8.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41026</td>
			<td>Used in 6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BpiI (BbsI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI (Eco31I)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0291</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>A1491.0005</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used in 4.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>Used in 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td>DNA extraction kit. Used in 5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega Microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td>Used in 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10021083</td>
			<td>Used in 2.3.1, 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10356553</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11815-024</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filters (0.45 &#956;m)</td>
			<td>MF-Millipore</td>
			<td>HAWP02500</td>
			<td>Used in 3.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) &#181;CLEAR</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td>Used in 4.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1020S</td>
			<td>Used in 1.1.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td>DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro incubator with LEDs</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>-</td>
			<td>Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21108</td>
			<td>Used in 7.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used in 2.3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 chemically competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td>Used in 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>K813</td>
			<td>Used in 4.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>Used in 1.1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load 1 kb DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0468S</td>
			<td>Used in Figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>72.692.210</td>
			<td>Used in 3.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>J61820.06</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>612U96</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill. Used in 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit

Cianobactérias são um grupo diversificado de organismos fotosintéticos procarióticos que podem ser geneticamente modificados para a produção renovável de commodities industriais úteis. Os avanços recentes na biologia sintética conduziram ao desenvolvimento de diversos toolkits da clonagem tais como CyanoGate, um sistema modular estandardizado da clonagem para construir vectors plasmid para a transformação subseqüente ou transferência conjugal em cianobacteria. Aqui descrevemos um método detalhado para a montagem de um vetor auto-replicante (por exemplo, carregando uma fita de expressão marcador fluorescente) e transferência conjugal do vetor para as cepas cianobacterianas Synechocystis sp. PCC 6803 ou Synechococcus Elongatus UTEX 2973. Além disso, descrevemos como caracterizar o desempenho de uma parte genética (por exemplo, um promotor) usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.

Para demonstrar o fluxo de trabalho de montagem golden gate, uma fita de expressão foi montada no vetor de aceitação de nível 1 (Forward) (pICH47732) contendo as seguintes partes de nível 0: o promotor do operon C-phycocianina P cpc560 (pC0.005), contendo as seguintes partes de nível 0: o promotor do operon C-phycocianina P cpc560 (pC0.005), contendo as seguintes partes de nível 0: o promotor do operon C-phycocianina P cpc560 (pC0.005), contendo as seguintes partes de nível 0: o p...

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Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo como i) montar um vetor auto-replicante usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate, ii) introduzir o vetor em um hospedeiro cianobacteriano por conjugação, e iii) caracterizar cepas transgênicas de cianobactérias usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.

Modificação genética de cianobactérias por conjugação usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

As cianobactérias são um importante filo de micróbios fotossintéticos que são cada vez mais reconhecidos como plataformas úteis para biologia sintética e aplicações de biotecnologia renovável. Assim, desenvolver técnicas robustas para simplificar o design, clonagem e introdução de DNA heterólogo em diferentes espécies cianobacterianas é importante. Assim, esta técnica demonstra um método bem estabelecido chamado conjugação ou acasalamento triparental para introduzir DNA em espécies cianobacterianas que não são naturalmente transformáveis.A conjugação tem sido realizada com sucesso em uma ampla gama de cepas cianobacterianas de células únicas a espécies filamentous multicelulares. Se você está tentando esta técnica pela primeira vez, por favor, tome cuidado para lidar tanto com suas cepas cianobacterianas quanto suas cepas de E.coli com cuidado. Por exemplo, não centrifugar acima dos valores dados no protocolo e não vórtice.Misturar bactérias e cianobactérias pode parecer estranho para usuários iniciantes. Esperamos que, demonstrando o processo de conjugação, ajudemos a esclarecer isso. Após a construção de montagens de nível um, escolha um vetor de aceitação de nível T apropriado.Escolha um link final apropriado para ligar a extremidade três prime do conjunto de nível um final para a espinha dorsal nível T. Para montar um ou mais conjuntos de nível um no nível T, prepare uma mistura de reação com PBI1 e o vetor de link final necessário. Configure o programa de cicloviário térmico e prossiga de acordo com o manuscrito.No primeiro dia, cresça a cultura cianobacteriana criando uma nova cultura de Synechocystis PCC 6803 ou Synechococcus elongatus UTEX 2973. Com um laço estéril térmico, raspe as células da placa de ágar BG-11 axenic e coloque em um frasco cônico de 100 mililitros cheio de 50 mililitros de médio BG-11 fresco para inoculado. Coloque o frasco em uma incubadora agitada com iluminação para cultivar as culturas celulares Synechocystis PCC 6803 a 30 graus Celsius a 100 RPM.Para Synechococcus elongatus UTEX 2973, cresça as culturas celulares a 40 graus Celsius a 100 RPM. Após um a dois dias, desenhe um milímetro da cultura celular e meça em um espectrômetro. A absorvância em OD 750 atinge 0,5 a 1,5.No segundo dia, inocular uma cepa de ajudante MC1061 E.coli contendo vetores PRK24 e PRL528 em cinco mililitros de meio LB com ampicillina a uma concentração de 100 microgramas por mililiter e clorograma a uma concentração de 25 microgramas por mililitro. Cresça a 37 graus Celsius durante a noite a 225 RPM em uma incubadora de agitação. Em seguida, inocular cinco mililitros de meio LB contendo antibióticos apropriados com a cultura E.coli carregando o vetor de carga nível T.Cresça a cultura a 37 graus Celsius durante a noite a 225 RPM em uma incubadora agitada. No terceiro dia, centrifugar o ajudante e a carga E.coli durante a noite culturas a 3.000 g por 10 minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota celular.Lave as pelotas adicionando cinco mililitros de meio LB fresco sem antibióticos. Resuspenque a pelota tubondo suavemente para cima e para baixo e centrífuga para remover o supernatante. Repita esta etapa de lavagem três vezes para remover antibióticos residuais da cultura da noite para o dia.Após a última lavagem, resuspenja a pelota celular pela metade do volume do meio LB do volume de cultura inicial. Em seguida, combine 450 microliters da cepa auxiliar com 450 microliters da cepa de carga em um tubo de dois mililitros e deixe em temperatura ambiente. Em seguida, prepare a cultura cianobacteriana centrifugando um mililitro da cultura cianobacteriana a 1.500 g por 10 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, descarte o supernatante cuidadosamente sem perturbar a pelota celular. Lave a pelota quatro vezes adicionando um novo meio BG-11 do mesmo volume inicial. Adicione 900 microliters da cultura cianobacteriana lavada a 900 microliters das cepas combinadas de E.coli em um tubo de dois mililitros.Misture as culturas gentilmente se esforçando para cima e para baixo. Incubar a mistura em temperatura ambiente por 30 minutos para Synechocystis PCC 6803 ou duas horas para Synechococcus elongatus UTEX 2973. Centrifugar a mistura a 1.500 g durante 10 minutos em temperatura ambiente.Remova 1,6 mililitros do supernasce e resuspense a pelota no restante do supernatante. Coloque um filtro de membrana de 0,45 mícria em uma placa de ágar LB BG-11 sem antibióticos. Espalhe cuidadosamente 200 microlitadores da mistura de cultura E.coli/cianobacteriana na membrana com um espalhador estéril ou uma ponta dobrada estéril.Sele a placa com filme de parafina e coloque a placa em uma incubadora iluminada por 24 horas. Após 24 horas, transfira cuidadosamente a membrana usando fórceps esterilizados por chama para uma placa de ágar BG-11 fresca contendo antibióticos apropriados para selecionar para o vetor de carga. Sele a placa com filme de parafina e incubar sob as mesmas condições anteriormente até que as colônias apareçam.Colônias normalmente aparecem após 7-14 dias para Synechocystis PCC 6803 e 3-7 dias para Synechococcus elongatus UTEX 2973. Para selecionar conjugantes, usando uma haste inoculante estéril de calor, selecione pelo menos duas colônias individuais da membrana e listrada em uma nova placa de ágar BG-11 contendo antibióticos apropriados. Em seguida, inocular uma raia de cultura cianobacteriana em um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo cinco mililitros de meio LB e incubar a 37 graus Celsius durante a noite a 225 RPM em uma incubadora de agitação.A cultura clara confirma a ausência de contaminação por E.coli. Após um período de crescimento suficiente de sete dias, escolha colônias axenic individuais para criar culturas líquidas para armazenamento criogeno de longo prazo ou experimentação subsequente. Neste estudo, foi demonstrado o fluxo de trabalho de montagem do Golden Gate.Após a transformação da reação da assembleia, foram identificadas assembleias bem sucedidas utilizando-se de triagem branca azul padrão das colônias E.coli. O de expressão eYFP no vetor nível um e no vetor de link final um vetor foram então montados em um vetor de aceitação nível T para dar ao vetor cpcBA-eYFP. O vetor cpcBA-eYFP montado foi verificado por restrição de digestão.A transferência conjugal bem sucedida do cpcBA-eYFP ou do vetor pPMQAK1-T resultou no crescimento de até várias centenas de colônias na membrana para synechocystis PCC 6803 e Synechococcus elongatus UTEX 2973. Como esperado para o forte promotor Pcpc560, os valores para fluorescência eYFP normalizada do leitor de placas e fluorescência eYFP por célula do citômetro de fluxo foram elevados em comparação com o controle negativo. Tanto com o leitor de placas quanto com o citómetro de fluxo, os valores de fluorescência foram mais elevados em Synechococcus elongatus UTEX 2973 do que em Synechocystis PCC 6803.Certifique-se de incubar pelo tempo mínimo de acordo com qual cepa você está conjugando.

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