Name: genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit
Uploaded: 2019-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

Авторы признательны Сети БИОтехнологии и биологических наук PHYCONET (BBSRC) в области промышленной биотехнологии и биоэнергетики (NIBB) и Центру инноваций в области промышленной биотехнологии (IBioIC) за финансовую поддержку. GARG, AASO и AP признают финансовую поддержку программы BBSRC EASTBIO CASE PhD (грант bb/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) PhD программы, а также программы совместного обучения IBioIC-BBSRC (CTP) Соответственно. Мы благодарим Конрада Маллино (Лондонский университет Королевы Марии) и Поула Эрика Дженсена и Джули Аннемари Зита Зедлер (Копенгагенский университет) за плазмидный вектор и протокольные вклады и советы.

1. Векторная сборка с использованием инструментариев Plant MoClo и CyanoGate
ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем приступить к векторной сборке, настоятельно рекомендуется, чтобы пользователи ознакомились с структурами уровня переносчиков систем завода и CyanoGate MoCloсистем 12,<sup ...

Сборка Золотых ворот имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами векторной сборки, особенно с точки зрения масштабируемости20,21. Тем не менее, настройка системы «Золотые ворота» в лаборатории требует времени для того, чтобы ознакомиться с разли...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0404</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (microbiology tested)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-500g</td>
			<td>Used in 8.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41026</td>
			<td>Used in 6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BpiI (BbsI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI (Eco31I)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0291</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>A1491.0005</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used in 4.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>Used in 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td>DNA extraction kit. Used in 5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega Microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td>Used in 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10021083</td>
			<td>Used in 2.3.1, 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10356553</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11815-024</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filters (0.45 &#956;m)</td>
			<td>MF-Millipore</td>
			<td>HAWP02500</td>
			<td>Used in 3.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) &#181;CLEAR</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td>Used in 4.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1020S</td>
			<td>Used in 1.1.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td>DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro incubator with LEDs</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>-</td>
			<td>Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21108</td>
			<td>Used in 7.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used in 2.3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 chemically competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td>Used in 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>K813</td>
			<td>Used in 4.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>Used in 1.1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load 1 kb DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0468S</td>
			<td>Used in Figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>72.692.210</td>
			<td>Used in 3.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>J61820.06</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>612U96</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill. Used in 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit

Цианобактерии представляют собой разнообразную группу прокариотических фотосинтетических организмов, которые могут быть генетически модифицированы для возобновляемого производства полезных промышленных товаров. Последние достижения в области синтетической биологии привели к разработке нескольких наборов инструментов клонирования, таких как CyanoGate, стандартизированная модульная система клонирования для построения векторов плазмида для последующей трансформации или супружеской передачи в цианобактерии. Здесь мы намечаем детальный метод для сборки самовоспроизводящегося вектора (например, проведение флуоресцентной маркерной экспрессии) и супружеской передачи вектора в цианобактериальные штаммы Synechocystis sp. PCC 6803 или Synechococcus эллонгат UTEX 2973. Кроме того, мы описываем, как охарактеризовать производительность генетической части (например, промоутер) с помощью считывателя пластин или цитометрии потока.

Для демонстрации рабочего процесса сборки Золотых Ворот в векторе приемки 1-го уровня (Forward) (pICH47732) была собрана экспресс-кассета, содержащая следующие части уровня 0: промоутер C-фикоцианина оперона Pcpc560 (pC0.005), последовательность кодирования для eYFP (pC0.008) и дво...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Здесь мы представляем протокол, описывающий, как i) собрать самовоспроизводящий вектор с помощью модульного инструментария клонирования CyanoGate, ii) ввести вектор в цианобактериальный хост путем спряжения, и iii) характеризуют трансгенные штаммы цианобактерий с помощью плита читателя или потока цитометрии.

Генетическая модификация цианобактерий путем конъюгации с помощью цианогейтмодульного клонирования Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Цианобактерии являются важными филум фотосинтетических микробов, которые все чаще признаются в качестве полезных платформ для синтетической биологии и возобновляемых биотехнологий приложений. Поэтому важно разработать надежные методы для упрощения проектирования, клонирования и внедрения гетерологических ДНК в различные цианобактериальные виды. Таким образом, этот метод демонстрирует устоявшийся метод, называемый спряжением или трипарентальным спариванием для введения ДНК в цианобактериальные виды, которые естественно не трансформируются.Спряжение было успешно выполнено в широком спектре цианобактериальных штаммов от одной клетки до многоклеточных нитевидных видов. Если вы пытаетесь этот метод в первый раз, пожалуйста, позаботьтесь, чтобы справиться как с вашим cyanobacterial и E.coli штаммов с осторожностью. Например, не центрифуга выше значений, приведенных в протоколе, и не вихрь.Смешивание бактерий и цианобактерий может показаться странным для впервые пользователей. Мы надеемся, что, продемонстрировав процесс спряжения, мы поможем прояснить это. После строительства сборки уровня 1 выберите соответствующий вектор T-приемчика уровня.Выберите соответствующую конец ссылку, чтобы ligate три премьер-конец заключительного уровня 1 сборки на уровне T позвоночника. Чтобы собрать одну или несколько сборок уровня 1 в уровне T, подготовьте смесь реакций с PBI1 и требуемым вектором конечных звеньей. Настройка программы теплового цикла и продолжить в соответствии с рукописью.В первый день, расти цианобактериальной культуры путем создания свежей культуры Synechocystis PCC 6803 или Synechococcus elongatus UTEX 2973. С тепловой стерильной петли, соскребать клетки из топорной пластины BG-11 агар и поместить в 100 миллилитров конической колбы заполнены 50 миллилитров свежих BG-11 средних прививать. Поместите колбу в трясусь инкубатор с освещением, чтобы вырастить Synechocystis PCC 6803 клеточных культур при 30 градусах по Цельсию при 100 об/мин.Для Synechococcus elongatus UTEX 2973 выращиваем клеточные культуры при 40 градусах Цельсия при 100 об/мин. Через один-два дня нарисуйте один миллилитр клеточной культуры и измерьте на спектрофотометре. Поглощение на OD 750 достигает 0,5 до 1,5.На второй день прививите штамм помощнику MC1061 E.coli, содержащий векторы PRK24 и PRL528 в пяти миллилитров среды LB с ампициллином при концентрации 100 микрограмм на миллилитр и хлорамфеникол при концентрации 25 микрограмм на миллилитр. Расти при 37 градусах по Цельсию ночью при 225 об/мин в трясущимся инкубаторе. Затем прививают пять миллилитров среды LB, содержащей соответствующие антибиотики с культурой E.coli, несущей вектор груза уровня Т.Выращиваем культуру при 37 градусах Цельсия на ночь при 225 об/мин в трясущимся инкубаторе. На третий день центрифуга помощник и груз E.coli ночных культур на 3000 г в течение 10 минут при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта, не нарушая клеточные гранулы.Вымойте гранулы, добавив пять миллилитров свежей среды LB без антибиотиков. Resuspend гранулы, мягко трубы вверх и вниз и центрифуги, чтобы удалить супернатант. Повторите этот шаг мытья три раза, чтобы удалить остаточные антибиотики из ночной культуры.После последней стирки, повторное размещение гранулы клетки в два раза объем LB среды первоначального объема культуры. Затем объединить 450 микролитров напряжения помощников с 450 микролитров грузового штамма в двухми миллилитровую трубку и оставить при комнатной температуре. Далее подготовьте цианобактериарной культуры путем центрифугирования одного миллилитра цианобактериальной культуры при температуре 1500 г в течение 10 минут при комнатной температуре.Затем отбросьте супернатант тщательно, не нарушая гранулы клетки. Вымойте гранулы четыре раза, добавив свежие BG-11 среды того же первоначального объема. Добавьте 900 микролитров промытой цианобактериальной культуры в 900 микролитров комбинированных штаммов E.coli в двухмилитровой трубке.Смешайте культуры, мягко трубы вверх и вниз. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 30 минут для Synechocystis PCC 6803 или два часа для Synechococcus elongatus UTEX 2973. Центрифуга смеси при температуре 1500 г в течение 10 минут при комнатной температуре.Удалите 1,6 миллилитров супернатанта и повторно посовелите гранулы в оставшийся супернатант. Поместите один 0,45 микрон мембранный фильтр на Агар пластины LB BG-11 без антибиотиков. Тщательно распределив 200 микролитров смеси E.coli/cyanobacterial culture на мембрану стерильным распространители или стерильным согнутым кончиком.Печать пластины с парафиновой пленкой и поместите пластину в освещенный инкубатор в течение 24 часов. Через 24 часа тщательно перенесите мембрану с помощью стерилизованных огней типсов на свежую агарную пластину BG-11, содержащую соответствующие антибиотики для выбора грузового вектора. Печать пластины с парафиновой пленкой и инкубировать в тех же условиях, как ранее, пока колонии появляются.Колонии обычно появляются через 7-14 дней для Synechocystis PCC 6803 и 3-7 дней для Synechococcus elongatus UTEX 2973. Чтобы выбрать спряженцев, используя тепловой стерильный инокулирующий стержень, выберите по крайней мере две отдельные колонии из мембраны и полосу на новую агарную пластину BG-11, содержащую соответствующие антибиотики. Затем привить полосу цианобактериальной культуры в 15 миллилитровую центрифугу, содержащую пять миллилитров среднего LB и инкубировать при 37 градусах по Цельсию на ночь при 225 об/мин в трясущемся инкубаторе.Ясная культура подтверждает отсутствие заражения E.coli. После достаточного периода роста в семь дней, выбрать отдельные колонии топором для настройки жидких культур для долгосрочного хранения крио или последующих экспериментов. В этом исследовании был продемонстрирован рабочий процесс сборки золотых ворот.После трансформации реакции сборки были выявлены успешные сборки с использованием стандартного синего белого скрининга колоний E.coli. Кассета выражения eYFP в векторе уровня 1 и конце связывают один вектор, затем были собраны в вектор вектора принятия уровня T, чтобы дать вектор cpcBA-eYFP. Собранный вектор cpcBA-eYFP был проверен с помощью пищеварения ограничений.Успешная супружеская передача cpcBA-eYFP или вектора pPM-AK1-T привела к росту до нескольких сотен колоний на мембране для Synechocystis PCC 6803 и Synechococcus elongatus UTEX 2973. Как и ожидалось для сильного промоутера Pcpc560, значения для нормализованной флуоресценции eYFP от считывателя пластин и флуоресценции eYFP на клетку от цитометра потока были высокими по сравнению с отрицательным контролем. Как с считывателем пластин, так и с цитометром потока значения флуоресценции были выше в Synechococcus elongatus UTEX 2973, чем в Synechocystis PCC 6803.Убедитесь, что вы инкубировать в течение минимального времени, в соответствии с которым штамм вы спряжения.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

Анализ для нейронных Индукция в куриных эмбрионах

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Высокое содержание изображений Workflow по изучению Grb2 сигнализации комплексы выражением Клонирование

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Генетическая модификация и рекомбинации слюнных желез органной культуры

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Фекальные глюкокортикоиды Анализ: безоперационная Надпочечная Мониторинг в Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

ДНК Электропорация, Изоляция и изображений из мышечных волокон

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Одновременное измерение митохондриальной кальция и митохондриальной мембраны Потенциал в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Визуализация ДНК уплотнения в цианобактерий, томография высокого напряжения крио электрон

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

Трубопровод с использованием двустороннего в утробе матери электропорации для допроса генетического влияния на поведение грызунов

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Создание и генетическое манипулирование органоидами мышиных гепатоцитов

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...