Name: genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit
Uploaded: 2019-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

Författarna är tacksamma för PHYCONET bioteknik och biologisk vetenskap forskningsrådet (BBSRC) nätverk inom industriell bioteknik och bioenergi (NIBB) och Industrial Biotechnology innovation Centre (IBioIC) för ekonomiskt stöd. GARG, AASO och AP erkänner finansiering stöd från BBSRC EASTBIO fall PhD program (Grant Number BB/M010996/1), den Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) doktorandprogrammet, och IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP) doktorandprogrammet, Respektive. Vi tackar Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London), och Poul Eric Jensen och Julie Anne Marie Zita Zedler (Köpenhamns universitet) för plasmid Vector och protokoll bidrag och råd.

1. Vector montering med hjälp av växten MoClo och CyanoGate verktygslådor
Obs: innan du fortsätter med Vector församling, är det starkt rekommenderat att användarna bekanta sig med vektorn nivå strukturer av växten och cyanogate moclo system12,15.
<ol><li>Konstruktion av nivå 0-delar Anmärkning: nivå 0-delar kan syntetiseras som kompletta vektorer eller som linjära sekvenser för montering med nivå 0-acceptorer (t. e...

Golden Gate Assembly har flera fördelar jämfört med andra vektor monteringsmetoder, särskilt när det gäller skalbarhet20,21. Ändå kräver inrättandet av Golden Gate-systemet i ett labb tid för att utveckla en förtrogenhet med de olika delarna och acceptor vektor bibliotek och övergripande monteringsprocesser. Noggrann planering behövs ofta för mer komplexa sammansättningar eller när man utför ett stort antal komplexa sammansättningar parallellt ...

Cyanobakterier är autotrofiska bakterier som kan användas för biosyntesen av en mängd olika naturliga och heterologösa, metaboliska produkter med högt värde1,2,3,4,5, 6. Flera hinder måste fortfarande övervinnas för att utvidga sin kommersiella lönsamhet, framför allt de relativt dåliga avkastningen jämfört med heterotrofiska bioplattformar (t. ex., Escherichia coli och jäst)7. Den senaste utvidgningen av tillgängliga gentekniska verktyg och upptaget av det syntetiska biologiska paradigmet inom cyanobakteriell forskning bidrar till att övervinna sådana utmaningar och vidareutveckla cyanobakterier som effektiva biogödsel8, 9,10.
De viktigaste metoderna för att införa DNA i cyanobakterier är omvandling, konjugering och elektroporation. De vektorer som överförs till cyanobakterier genom omvandling eller elektroporation är "självmord" vektorer (dvs. integrativa vektorer som underlättar homolog rekombination), medan självreplikerande vektorer kan överföras till cyanobakterier genom omvandling, konjugering eller elektroporation. För de förstnämnda finns ett protokoll för tekniska modell arter som kan vara mottagliga för naturlig omvandling11. På senare tid, en modulär kloning (MoClo) Toolkit för cyanobakterier kallas Cyanogat har utvecklats som sysselsätter en standardiserad Golden Gate Vector monteringsmetod för teknik med hjälp av naturliga omvandling, elektroporation eller konjugation12.
Golden Gate-typ monteringstekniker har blivit alltmer populära under de senaste åren, och montering standarder och del bibliotek finns nu tillgängliga för en mängd olika organismer13,14,15,16 ,17. Golden Gate använder typ IIS restriktioner enzymer (t. ex., BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI och AarI) och en kostym av acceptorer och unika överhäng för att underlätta riktad hierarkisk montering av flera sekvenser i en "One Pot" församling reaktion. Typ IIS begränsning enzymer erkänna en unik asymmetrisk sekvens och skär ett definierat avstånd från deras erkännande platser för att generera en vacklade, "klibbiga slutet" klippa (typiskt en 4 nukleotid [NT] överhäng), som senare kan utnyttjas för att köra beställt DNA Monterings reaktioner15,18. Detta har underlättat utvecklingen av stora bibliotek av modulära nivå 0-delar (t. ex. projektansvariga, öppna Läs ramar och Terminatorer) som definieras av en gemensam syntax, såsom PhytoBricks standard19. Nivå 0 delar kan sedan lätt monteras i nivå 1 uttrycks kassetter, varefter mer komplexa högre ordning församlingar (t. ex., multigene uttryck konstruktioner) kan byggas i en acceptor vektor val12,15. En viktig fördel med Golden Gate-typ monteringstekniker är deras mottaglighet för automatisering vid hög genomströmning anläggningar, såsom DNA gjuterier20,21, som kan möjliggöra testning av komplexa experimentella konstruktioner som lätt kan uppnås genom manuellt arbete.
Cyanogat bygger på den etablerade anläggningen moclo system12,15. För att införliva en ny del i Cyanogat måste dels sekvensen först tämjas, d.v.s. "olagliga" igenkännings platser för BsaI och BpiI måste avlägsnas. I fråga om en del kodning för en öppen läsbild (dvs en kodning sekvens, CD-skivor), erkännande platser kan störas genom att generera synonyma mutationer i sekvensen (dvs., ändra en kodon till ett alternativ som kodar för samma aminosyra rester). Detta kan uppnås genom en mängd olika metoder, allt från DNA-syntes till polymeras kedjereaktion (PCR) amplifiering-baserade strategier såsom Gibson Assembly22. Beroende på uttrycket värd som används, försiktighet bör iakttas för att undvika införandet av sällsynta kodons som kan hämma effektiviteten av översättningen23. Ta bort erkännande platser i promotorn och Terminator sekvenser är typiskt en mer riskfyllda strävan, som ändringar kan påverka funktionen och delen kanske inte fungerar som förväntat. Till exempel kan ändringar av bindnings platser för förmodade transkriptionsfaktorer eller den ribosom bindnings platsen inom en promotor förändra styrka och reaktionsförmåga till induktion/förtryck. Likaså ändringar av viktiga Terminator strukturella egenskaper (t. ex. GC Rich Stem, loop och Poly-U svans) kan ändra terminering effektivitet och effekt genuttryck24,25. Även om flera online-resurser är tillgängliga för att förutsäga aktiviteten av promotorn och Terminator sekvenser, och informera om en föreslagen mutation kommer att påverka prestanda26,27, dessa verktyg är ofta dåliga prediktorer för prestanda i cyanobakterier28,29,30.. Som sådan, in vivo karakterisering av modifierade delar rekommenderas fortfarande att bekräfta aktivitet. För att hjälpa till med kloning av motsträvare sekvenser, cyanogate innehåller en låg kopia kloning acceptor vektor baserad på biobrick Vector pSB4K512,16,31. Dessutom är en "design och bygga" portal tillgänglig via Edinburgh Genome Foundry för att hjälpa till med Vector design (dab.genomefoundry.org). Slutligen, och viktigast av allt, inkluderar Cyanogat två nivå T acceptor vektor konstruktioner (motsvarande nivå 2 acceptor vektorer)15 för att införa DNA i cyanobakterier med hjälp av självmords vektorer, eller breda vektorer för värd-Range som kan själv replikering i flera cyanobakteriella arter32,33,34.
Här kommer vi att fokusera på att beskriva ett protokoll för att generera nivå T självreplikerande vektorer och genetisk modifiering av Synechocystis pcc 6803 och Synechococcus elongatus Utex 2973 (synechocystis PCC 6803 och S. elongatus Utex 2973 hädanefter) genom konjugering (även känd som Tri-Parental parning). Conjugal överföring av DNA mellan bakterieceller är en väl beskriven process och har tidigare använts för tekniska cyanobakteriella arter, särskilt de som inte är naturligt kompetenta, såsom S. elongatus utex 297335, 36,37,38,39,40,41. I korthet, cyanobakterial kulturer inkuberas med en E. coli stam transporterar vektorn som skall överföras ("Last" vektor) och vektorer (antingen i samma E. coli stam eller i ytterligare stammar) för att möjliggöra konjugering ("mobilizer" och "hjälpare" vektorer). Fyra viktiga villkor krävs för att den äktenskapliga överföringen ska ske: 1) direkt kontakt mellan celler som är involverade i DNA-överföring, 2) Last vektorn måste vara förenlig med konjugeringssystemet (dvs. det måste innehålla ett lämpligt ursprung för överföring (Orit). även känd som en BOM (grund för rörlighet) plats), 3) ett DNA Hack protein (t. ex. kodas av Mob genen) att Nicks DNA vid Orit att initiera enkelsträngad överföring av DNA i Cyanobakterium måste vara närvarande och uttryckt från antingen lasten eller hjälp vektorer, och 4) den överförda DNA får inte förstöras i mottagaren Cyanobakterium (dvs måste vara resistenta mot nedbrytning av, till exempel, begränsning Endonuklease aktivitet)35,42. För att Last vektorn ska bestå måste replikens ursprung vara kompatibelt med mottagaren Cyanobakterium för att möjliggöra själv replikering och spridning till dotter cells post division. Till stöd med villkor 3 och 4, flera Helper vektorer är tillgängliga via Addgene och andra kommersiella källor som kodar för Mob samt flera metylaser för att skydda från infödda endonukleaser i värd Cyanobakterium43. I detta protokoll, konjugation underlättades av en MC1061 E. coli stam bärande person och Helper vektorer pRK24 (www. addgeneorg/51950) och pRL528 (www.addgene.org/58495), respectively. Försiktighet måste iakttas vid val av vektorer som skall användas föräktenskapliga överföring. Till exempel, i CyanoGate kit självreplikerande Cargo Vector pPMQAK1-T kodar för en Mob protein12. Men pSEVA421-T inte44, och som sådan, Mob måste uttryckas från en lämplig hjälpare vektor. De vektorer som används bör också vara lämpliga för målorganismen. Till exempel kräver effektiv konjugal överföring i Anabaena SP. PCC 7120 en hjälp vektor som skyddar person vektorn mot matsmältningen (t. ex. pRL623, som kodar för de tre metylaser avaim, Eco47iiM och Ecot22iM)45, 46.
I detta protokoll beskriver vi vidare hur man karakteriserar utförandet av delar (dvs. projektansvariga) med en fluorescerande markör med hjälp av en Plattläsare eller en flödescytometer. Flödescytometrar kan mäta fluorescens på en enda cellbasis för en stor population. Dessutom tillåter flödescytometrar användare att "utfärda utegångsförbud för" de förvärvade uppgifterna och ta bort bakgrundsbrus (t. ex. från partiklar i kulturen eller föroreningen). Däremot får plattläsarna en sammanlagd fluorescensmätning av en given volym kultur, vanligtvis i flera replikbrunnar. De viktigaste fördelarna med Plattläsare över cytometrar är lägre kostnad, högre tillgänglighet och vanligtvis inga krav på specialist programvara för nedströms dataanalyser. De huvudsakliga nackdelarna med Plattläsare är den relativt lägre känsligheten jämfört med cytometrar och potentiella problem med den optiska densiteten hos uppmätta kulturer. För jämförande analyser måste prov på Plattläsare normaliseras för varje brunn (t. ex. till en mätning av Odlingstätheten, som normalt tas som absorbans vid den optiska densiteten vid 750 nm [OD750]), vilket kan leda till felaktigheter för prover som är för täta och/eller inte väl blandade (t. ex. när de är benägna att aggregering eller flocympning).
Som en översikt, här visar vi i detalj principerna för att generera nivå 0 delar, följt av hierarkisk församling med hjälp av CyanoGate kit och kloning i en vektor som lämpar sig föräktenskapliga överföring. Vi visar sedan den äktenskapliga transfer processen, val av axenic transkonjugant stammar som uttrycker en fluorescerande markör, och efterföljande förvärv av fluorescensdata med hjälp av en flödescytometer eller en Plattläsare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0404</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (microbiology tested)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-500g</td>
			<td>Used in 8.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41026</td>
			<td>Used in 6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BpiI (BbsI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI (Eco31I)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0291</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>A1491.0005</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used in 4.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>Used in 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td>DNA extraction kit. Used in 5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega Microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td>Used in 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10021083</td>
			<td>Used in 2.3.1, 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10356553</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11815-024</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filters (0.45 &#956;m)</td>
			<td>MF-Millipore</td>
			<td>HAWP02500</td>
			<td>Used in 3.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) &#181;CLEAR</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td>Used in 4.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1020S</td>
			<td>Used in 1.1.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td>DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro incubator with LEDs</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>-</td>
			<td>Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21108</td>
			<td>Used in 7.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used in 2.3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 chemically competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td>Used in 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>K813</td>
			<td>Used in 4.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>Used in 1.1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load 1 kb DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0468S</td>
			<td>Used in Figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>72.692.210</td>
			<td>Used in 3.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>J61820.06</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>612U96</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill. Used in 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit

Cyanobakterier är en mångskiftande grupp av prokaryotiska fotosyntetiska organismer som kan modifieras genetiskt för förnybar produktion av nyttiga industriråvaror. De senaste framstegen inom syntetisk biologi har lett till utveckling av flera klonings verktyg som CyanoGate, ett standardiserat modulärt klonings system för att bygga plasmid-vektorer för efterföljande omvandling eller konjugal överföring till cyanobakterier. Här beskriver vi en detaljerad metod för att montera en självreplikerande vektor (t. ex. med en fluorescerande markör uttrycks kassett) och äktenskapliga överföring av vektorn i cyanobakterial stammar synechocystis SP. PCC 6803 eller synechococcus elongatus utex 2973. Dessutom skisserar vi hur man karakteriserar utförandet av en genetisk del (t. ex. en promotor) med hjälp av en Plattläsare eller flödescytometri.

För att demonstrera monterings arbetsflödet för Golden Gate, samlades en uttrycks kassett i nivå 1 position 1 (forward) acceptor Vector (pICH47732) som innehåller följande nivå 0-delar: promotorn för C-phycocyanin operon Pcpc560 (PC 0,005), kodningen sekvens för eYFP (pC 0.008) och dubbla Terminator TrrnB (PC 0.082)12. Efter omvandlingen av församlingen reaktionen identifierades framgångsrika sammansättningar med ...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Här presenterar vi ett protokoll som beskriver hur man i) monterar en självreplikerande vektor med hjälp av CyanoGate Modular kloning Toolkit, II) introducera vektorn i en cyanobakterial värd genom konjugering, och III) karakterisera transgena cyanobakterier-stammar med hjälp av en Plattläsare eller flödescytometri.

Genetisk modifiering av cyanobakterier genom konjugering med hjälp av den modulbaserade klonings verktygslådan Cyanogat

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Cyanobakterier är en viktig phylum av fotosyntetiska mikrober som alltmer erkänns som användbara plattformar för syntetisk biologi och förnybar bioteknik applikationer. Så att utveckla robusta tekniker för att förenkla design, kloning och införande av heterologt DNA i olika cyanobakteriella arter är viktigt. Så denna teknik visar en väletablerad metod som kallas konjugation eller triparental parning för att införa DNA i cyanobakteriella arter som inte är naturligt omvandlas.Konjugation har framgångsrikt utförts i ett brett spektrum av cyanobakteriella stammar från enda cell till flercelliga filamentous arter. Om du försöker denna teknik för första gången, var noga med att hantera både din cyanobakteriella och din E.coli stammar med omsorg. Till exempel, centrifug över de värden som anges i protokollet och inte vortex.Blanda bakterier och Cyanobakterier kan tyckas konstigt att första gången användare. Vi hoppas att vi genom att demonstrera konjugationsprocessen kommer att bidra till att klargöra detta. Efter konstruktion av nivå ett församlingar, välj en lämplig nivå T acceptor vektor.Välj en lämplig slutlänk till ligate de tre främsta slutet av den slutliga nivån en församling till nivå T stamnätet. För att montera en eller flera nivå ett-sammansättningar i nivå T, förbereda en reaktionsmix med PBI1 och den erforderliga slutlänksvektorn. Sätt upp termiska cycler programmet och fortsätt enligt manuskriptet.På dag ett, växa cyanobakteriell kultur genom att inrätta en ny kultur av Synechocystis PCC 6803 eller Synechococcus elongatus UTEX 2973. Med en värmesteril slinga, skrapa cellerna från den axenic BG-11 agar plattan och placera i en 100 milliliter konisk kolv fylld med 50 milliliter färska BG-11 medium för att inokulera. Placera kolven i en skakande inkubator med belysning för att odla synechocystis PCC 6803 cellkulturer på 30 grader Celsius vid 100 RPM.För Synechococcus elongatus UTEX 2973, odla cellkulturerna vid 40 grader Celsius vid 100 RPM. Efter en till två dagar, rita en milliliter av cellkulturen och mät på en spektrofotometer. Absorbansen vid OD 750 når 0,5 till 1,5.Dag två, inokulera en MC1061 E.coli helper sil som innehåller vektorer PRK24 och PRL528 i fem milliliter lb medium med ampicillin vid en koncentration av 100 mikrogram per milliliter och kloramfenikol vid en koncentration av 25 mikrogram per milliliter. Väx vid 37 grader Celsius över natten vid 225 RPM i en skakande inkubator. Sedan inokulera fem milliliter lb medium som innehåller lämpliga antibiotika med E.coli kultur som transporterar nivå T last vektor.Odla kulturen vid 37 grader Celsius över natten vid 225 RPM i en skakande inkubator. På dag tre, centrifug hjälparen och lasten E.coli natten kulturer på 3, 000 g i 10 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten utan att störa cellpelletsen.Tvätta pellets genom att lägga till fem milliliter färskt LB medium utan antibiotika. Resuspend pelleten genom att försiktigt pipettera upp och ner och centrifug för att avlägsna supernatanten. Upprepa denna tvätt steg tre gånger för att ta bort kvarvarande antibiotika från natten kultur.Efter den sista tvätten, resuspend cell pelleten i halva volymen av LB-medium av den ursprungliga odlingsvolymen. Kombinera sedan 450 mikroliter av hjälpsilen med 450 mikroliter av laststammen i ett två milliliterrör och låt bli rumstemperatur. Därefter förbereda cyanobakteriella kulturen genom centrifugering en milliliter av cyanobakteriell kultur vid 1, 500 g i 10 minuter vid rumstemperatur.Kassera sedan supernatanten försiktigt utan att störa cellpelletsen. Tvätta pelleten fyra gånger genom att tillsätta färskt BG-11-medium av samma initiala volym. Tillsätt 900 mikroliter av den tvättade cyanobakteriella kulturen till 900 mikroliter av de kombinerade E.coli-stammarna i ett två milliliterrör.Blanda kulturerna genom att försiktigt pipettera upp och ner. Inkubera blandningen i rumstemperatur i 30 minuter för Synechocystis PCC 6803 eller två timmar för Synechococcus elongatus UTEX 2973. Centrifugera blandningen vid 1, 500 g i 10 minuter vid rumstemperatur.Ta bort 1,6 milliliter av supernatanten och resuspend pelleten i resterande supernatant. Placera ett 0,45 mikronmembranfilter på en LB BG-11 agarplatta utan antibiotika. Sprid försiktigt 200 mikroliter av E.coli/cyanobakteriell odlingsblandning på membranet med en steril spridare eller en steril böjd spets.Täta plattan med paraffinfilm och placera plattan i en belyst inkubator i 24 timmar. Efter 24 timmar, försiktigt överföra membranet med hjälp av flamsteriliserade trikås till en färsk BG-11 agar platta som innehåller lämpliga antibiotika att välja för lasten vektor. Försegla plattan med paraffinfilm och inkubera under samma förhållanden som tidigare tills kolonier dyker upp.Kolonier uppträder typiskt efter 7-14 dagar för Synechocystis PCC 6803 och 3-7 dagar för Synechococcus elongatus UTEX 2973. För att välja konjuganter, med hjälp av en värmesteril inokulat stav, välj minst två enskilda kolonier från membranet och strimma på en ny BG-11 agar platta som innehåller lämpliga antibiotika. Sedan inokulera en strimma av cyanobakteriell kultur i en 15 milliliter centrifug rör som innehåller fem milliliter LB medium och inkubera vid 37 grader Celsius över natten vid 225 RPM i en skakande inkubator.Den tydliga kulturen bekräftar frånvaron av E.coli-kontaminering. Efter en tillräcklig tillväxtperiod på sju dagar, plocka enskilda axenska kolonier för att ställa in flytande kulturer för långsiktig kryolagring eller efterföljande experiment. I denna studie demonstrerades arbetsflödet för montering av Golden Gate.Efter omvandling av församlingen reaktion identifierades framgångsrika församlingar med hjälp av standard blå vit screening av E.coli kolonier. EYFP uttryck kassetten i nivå en vektor och slutet länken en vektor var sedan ihop till en nivå T acceptor vektor för att ge vektorn cpcBA-eYFP. Den monterade cpcBA-eYFP-vektorn verifierades genom begränsningss digestion.Framgångsrik äktenskaplig överföring av cpcBA-eYFP eller pPMQAK1-T-vektorn resulterade i tillväxten av upp till flera hundra kolonier på membranet för Synechocystis PCC 6803 och Synechococcus elongatus UTEX 2973. Som förväntat för den starka Pcpc560 promotorn var värdena för normaliserade eYFP fluorescens från plattan läsaren och eYFP fluorescens per cell från flödet cytometer hög jämfört med den negativa kontrollen. Med både plattläsaren och flödescytometern var fluorescensvärdena högre i Synechococcus elongatus UTEX 2973 än i Synechocystis PCC 6803.Se till att du inkuberar under den minsta tid enligt vilken stam du konjugerar.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Dubbel Hela Montera in situ hybridisering för tidig kycklingembryon

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

Assay för Neural induktion i Chick Embryo

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

En hög halt Imaging arbetsflöde för att studera Grb2 signalering komplex genom expressionskloning

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genetisk modifiering och rekombination av saliv kulturer Gland Organ

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fekal Glukokortikoid Analys: Icke-invasiv Adrenal Övervakning av equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporation, isolering och avbildning av Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig mätning av mitokondrie kalcium och mitokondriell membranpotential i levande celler genom fluorescensmikroskopi

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering av DNA packning i cyanobakterier av högspännings-Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

En pipeline som använder bilateral in utero-elektroporering för att förhöra genetisk påverkan på gnagares beteende

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...