Name: genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit
Uploaded: 2019-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

Yazarlar PHYCONET Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) Network Endüstriyel Biyoteknoloji ve Biyoenerji (NIBB) ve Endüstriyel Biyoteknoloji Yenilik Merkezi (IBioIC) mali destek için müteşekkiriz. GARG, AASO ve AP BBSRC EASTBIO CASE Doktora programı (hibe numarası BB/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) Doktora programı ve IBioIC-BBSRC İşbirlikçi Eğitim Ortaklığı (CTP) Doktora programı, Sıra -sıyla. Conrad Mullineaux (Londra Queen Mary Üniversitesi) ve Poul Eric Jensen ve Julie Annemarie Zita Zedler'e (Kopenhag Üniversitesi) plazmid vektörü ve protokol katkıları ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz.

1. Bitki MoClo ve CyanoGate araç kitleri kullanılarak vektör montajı
NOT: Vektör montajı ile devam etmeden önce, kullanıcıların Bitki ve CyanoGate MoClo sistemlerinin vektör seviyesi yapıları12,15ile tanışmaları önemle tavsiye edilir.
<ol><li>Seviye 0 parçalarının yapımı NOT: Düzey 0 parçaları tam vektörler veya Düzey 0 kabul edenlerle (örneğin, gBlocks, IDT) montaj için doğrusal diziler olarak sente...

Golden Gate montaj ölçeklenebilirlik açısından özellikle diğer vektör montaj yöntemleri ile karşılaştırıldığında çeşitli avantajları vardır20,21. Bununla birlikte, Golden Gate sistemini bir laboratuvarda kurmak, çeşitli parçalar ve kabul vektör kitaplıkları ve genel montaj süreçleri ile ilgili bir aşinalık geliştirmek için zaman gerektirir. Daha karmaşık derlemeler için veya çok sayıda karmaşık derlemeyi paralel olarak ger?...

Siyanobakteriler doğal ve heterolog yüksek değerli metabolikürünleringeniş bir yelpazede biyosenteziçin kullanılabilir ototrofik bakteriler1,2,3,4,5, 6 . Birkaç engeller hala ticari canlılık genişletmek için aşılması gerekir, en önemlisi, heterotrofik biyo-platformlar (örneğin, Escherichia coli ve maya ile karşılaştırıldığında nispeten kötü verimleri)7. Mevcut genetik mühendislik araçlarının son genişleme ve siyanobakteriyel araştırmalarda sentetik biyoloji paradigmaalımı nın alımı bu tür zorlukların üstesinden gelmek ve daha verimli biyofabrikalar8olarak siyanobakteriler geliştirmek için yardımcı oluyor8 , 9,10.
DNA'nın siyanobakterilere dahil edilmesinde temel yaklaşımlar dönüşüm, konjugasyon ve elektroporasyonlardır. Dönüşüm veya elektroporasyon ile siyanobakterilere aktarılan vektörler "intihar" vektörleridir (yani homolog rekombinasyonları kolaylaştıran bütünleştirici vektörlerdir), kendi kendini çoğaltan vektörler ise siyanobakterilere dönüşüm, konjugasyon veya elektroporasyon. Eski için, bir protokol mühendislik modeli türler doğal dönüşüm11münasip için kullanılabilir. Daha yakın zamanda, siyanobakteriler için cyanogate adı verilen modüler bir klonlama (MoClo) araç seti, doğal dönüşüm, elektroporasyon veya konjugasyon kullanılarak mühendislik için standart bir Golden Gate vektör montaj yöntemi kullanan geliştirilmiştir12.
Golden Gate tipi montaj teknikleri son yıllarda giderek daha popüler hale gelmiştir ve montaj standartları ve parça kütüphaneleri artık çeşitli organizmalar için kullanılabilir13,14,15,16 ,17. Golden Gate tip IIS restriksiyon enzimleri (örneğin, BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI ve AarI) ve bir "tek pot" montaj reaksiyonunda birden fazla dizinin yönsel hiyerarşik montajını kolaylaştırmak için kabul eden ve benzersiz çıkıntılar kullanır. Tip IIS restriksiyon enzimleri benzersiz bir asimetrik dizi tanımak ve daha sonra sipariş DNA sürücü için istismar edilebilir bir şaşırtıcı, "yapışkan uç" kesim (genellikle 4 nükleotit [NT] çıkıntı) oluşturmak için tanıma sitelerinden tanımlanmış bir mesafe kesti montaj reaksiyonları15,18. Bu, PhytoBricks standardı19gibi ortak bir sözdizimi tarafından tanımlanan modüler Düzey 0 parçaların (örn. organizatörler, açık okuma çerçeveleri ve sonlandırıcılar) büyük kitaplıklarının geliştirilmesini kolaylaştırmıştır. Düzey 0 parçaları daha sonra kolayca Düzey 1 ifade kasetleri içine monte edilebilir, hangi daha karmaşık yüksek sipariş derlemeleri (örneğin, multigene ifade yapıları) seçim12,15bir kabul vektörü inşa edilebilir aşağıdaki . Golden Gate tipi montaj tekniklerinin önemli bir avantajı, dnadökümhaneleri 20,21gibi yüksek iş hacmi tesislerinde otomasyona olanak sağlamaktır, bu da karmaşık deneysel tasarımların test edilmesine olanak sağlar. kolayca el emeği ile elde edilemez.
CyanoGate kurulan Bitki MoClo sistemi12,15üzerine inşa eder. CyanoGate içine yeni bir parçası dahil etmek için, parça dizisi ilk evcilleştirilmiş olmalıdır, yani, BsaI ve BpiI için "yasadışı" tanıma siteleri kaldırılmalıdır. Açık okuma çerçevesi (yani bir kodlama dizisi, CDS) için kodlama yapan bir parça durumunda, tanıma siteleri dizideki eşanlamlı mutasyonlar oluşturarak bozulabilir (örneğin, bir kodonu aynı amino asit kalıntısını kodlayan bir alternatife değiştirerek). Bu yaklaşımlar çeşitli elde edilebilir, DNA sentezinden polimeraz zincir reaksiyonu arasında değişen (PCR) Gibson montaj22gibi amplifikasyon tabanlı stratejiler . Kullanılan ifade ana bilgisayarbağlı olarak, dikkat çeviri verimliliğini inhibe edebilecek nadir kodon giriş önlemek için alınmalıdır23. Tanıtım ve sonlandırıcı dizilerinde tanıma sitelerinin kaldırılması genellikle daha riskli bir çabadır, çünkü değişiklikler işlevi etkileyebilir ve parça beklendiği gibi performans göstermeyebilir. Örneğin, putatif transkripsiyon faktörü bağlama sitelerinde veya bir organizatör içindeki ribozom bağlama sitesinde yapılan değişiklikler, gücü ve yanıt verme yeteneğini indüksiyon/baskıya değiştirebilir. Aynı şekilde, anahtar terminatör yapısal özellikleri değişiklikler (örneğin, GC zengin kök, döngü ve poli-U kuyruk) sonlandırma verimliliği ve etkisi gen ekspresyonu 24 ,25değiştirebilirsiniz. Organizatör ve sonlandırıcı dizilerin etkinliğini tahmin etmek ve önerilen mutasyonunperformansıetkileyip etkilemeyeceğini bildirmek için çeşitli çevrimiçi kaynaklar mevcut olsada,bu araçlar genellikle kötü tahminbazlardır. siyanobakterilerde performans28,29,30. . Bu nedenle, değiştirilmiş parçaların in vivo karakterizasyonu yine de etkinliği onaylamak için önerilir. Rekalsitrant dizilerinin klonlanmasına yardımcı olmak için, CyanoGate BiyoTuğla vektör pSB4K512,16,31dayalı düşük kopya klonlama kabul vektörü içerir. Ayrıca, bir "Tasarım ve Yapı" portalı Edinburgh Genom Döküm aracılığıyla vektör tasarımı (dab.genomefoundry.org) ile yardımcı olmak için kullanılabilir. Son olarak, ve en önemlisi, CyanoGate intihar vektörleri kullanarak siyanobakteriler içine DNA tanıtmak için iki Seviye T alıcı vektör tasarımları (Düzey 2 alıcı vektörler eşdeğer)15 içerir, ya da kendini çoğaltma yeteneğine sahip geniş konak aralığı vektörler birkaç siyanobakteriyel türlerde 32,33,34.
Burada Seviye T kendi kendini çoğaltan vektörler ve Synechocystis PCC 6803 ve Synechococcus uzada UTEX 2973(Synechocystis PCC 6803 ve S. uzamı genetik modifikasyonu oluşturmak için bir protokol açıklayan üzerinde durulacak UTEX 2973 bundan sonra) konjugasyon (ayrıca üç ebeveynli miating olarak da bilinir). Bakteri hücreleri arasında DNA'nın konjugal transferi iyi tanımlanmış bir süreçtir ve daha önce mühendislik siyanobakteriyel türler için kullanılmıştır, özellikle doğal olarak yetkili olmayanlar, S. uzamış UTEX 297335gibi, 36,37,38,39,40,41. Kısacası, siyanobakteri kültürleri konjugasyon ("harekete geçirici" sağlamak için transfer edilecek vektörü ("kargo" vektörü) ve vektörleri (aynı E. coli suşlarında veya ek suşlarda) taşıyan bir E. coli suşu ile kuluçkaya yatırılır. ve "yardımcı" vektörler). Konjugal transferin gerçekleşmesi için dört temel koşul gereklidir: 1) DNA transferiile ilgili hücreler arasında doğrudan temas, 2) kargo vektörü konjugasyon sistemiyle uyumlu olmalıdır (yani, uygun bir aktarım menşei içermelidir(oriT), ayrıca bir bom (hareketlilik temeli) sitesi olarak da bilinir), 3) dna nicking protein (örneğin, mafya geni tarafından kodlanmış) bu cyanobacterium içine DNA tek iplikli transferi başlatmak için oriT dna nicks mevcut olmalı ve ifade ya kargo veya yardımcı vektörler, ve 4) transfer DNA alıcı siyanobacterium tahrip edilmemelidir (yani, örneğin, kısıtlama endokleaz aktivite)35,42. Kargo vektörünün devam edebilmesi için, çoğaltmanın kaynağının, kendi kendini çoğaltmave kız hücrelerine çoğalmasına izin vermek için alıcı siyanobakteri ile uyumlu olması gerekir. Koşullar 3 ve 4 ile yardımcı olmak için, çeşitli yardımcı vektörler Addgene ve mafya için kodlar diğer ticari kaynaklar aracılığıyla yanı sıra ev sahibi cyanobacterium43yerli enonukleazlar korumak için çeşitli metilazlar mevcuttur. Bu protokolde konjugasyon, sırasıyla pRK24 (www.addgeneorg/51950) ve pRL528 (www.addgene.org/58495) ile harekete geçirici ve yardımcı vektörleri taşıyan bir MC1061 E. coli süzme ile kolaylaştırılmıştır. Evlilik transferi için kullanılacak vektörleri seçerken dikkatli olunmalıdır. Örneğin, CyanoGate kitinde kendi kendini çoğaltıran kargo vektörü pPMQAK1-T bir Mobproteini 12için kodlar. Ancak, pSEVA421-T44değildir ve bu nedenle, mob uygun bir yardımcı vektör ifade edilmelidir. Kullanılan vektörler de hedef organizmaya uygun olmalıdır. Örneğin, Anabaena sp. PCC 7120'de verimli konjugal aktarım, harekete geçirici vektörünü sindirime karşı koruyan bir yardımcı vektör gerektirir (örneğin, pRL623, üç metilas AvaiM, Eco47iiM ve Ecot22iM)45, 46. yıl.
Bu protokolde, bir plaka okuyucu veya akış sitometresi kullanarak bir floresan marker ile parçaların (yani, organizatörler) performansını karakterize etmek için nasıl daha fazla anahat. Akış sitometreleri büyük bir popülasyon için floresanları tek bir hücre bazında ölçebilir. Ayrıca, akış sitometreleri kullanıcıların elde edilen verileri "kapı" ve arka plan gürültüsünü (örneğin, kültürdeki partikül maddeden veya kontaminasyondan) kaldırmalarına olanak sağlar. Buna karşılık, plaka okuyucular genellikle birkaç çoğaltma kuyularında, belirli bir kültür hacminin toplam floresan ölçümü elde. Plaka okuyucuların sitometrelere göre en önemli avantajları arasında daha düşük maliyet, daha yüksek kullanılabilirlik ve genellikle akış aşağı veri analizleri için uzman yazılımlara gerek yoktur. Plaka okuyucuların ana sakıncaları sitometrelere göre nispeten daha düşük hassasiyet ve ölçülen kültürlerin optik yoğunluğu ile potansiyel sorunlardır. Karşılaştırmalı analizler için, plaka okuyucu örnekleri her kuyu için normalleştirilmelidir (örn. kültür yoğunluğuölçümü için, genellikle 750 nm [OD750]'de optik yoğunlukta absorbans olarak alınan, bu da çok fazla örnek için yanlışlıklara yol açabilir. yoğun ve/veya iyi karışmaz (örn. toplama veya flokülasyona eğilimli olduğunda).
Genel bir bakış olarak, burada Seviye 0 parçaları oluşturma ilkelerini ayrıntılı olarak gösteriyoruz, ardından CyanoGate kitini kullanarak hiyerarşik montaj ve eş transferi için uygun bir vektöre klonlama. Daha sonra konjuge aktarım sürecini, floresan belirteç ifade eden axenic transkonjugant suşlarının seçimini ve bir akış sitometresi veya plaka okuyucu kullanarak floresan verilerin indensonra elde edinimi gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0404</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (microbiology tested)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-500g</td>
			<td>Used in 8.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41026</td>
			<td>Used in 6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BpiI (BbsI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI (Eco31I)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0291</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>A1491.0005</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used in 4.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>Used in 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td>DNA extraction kit. Used in 5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega Microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>-</td>
			<td>Used in 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td>Used in 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10021083</td>
			<td>Used in 2.3.1, 3.6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10356553</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11815-024</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filters (0.45 &#956;m)</td>
			<td>MF-Millipore</td>
			<td>HAWP02500</td>
			<td>Used in 3.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) &#181;CLEAR</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td>Used in 4.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1020S</td>
			<td>Used in 1.1.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td>DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro incubator with LEDs</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>-</td>
			<td>Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21108</td>
			<td>Used in 7.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used in 2.3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 chemically competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td>Used in 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>K813</td>
			<td>Used in 4.3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>Used in 1.1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load 1 kb DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0468S</td>
			<td>Used in Figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>72.692.210</td>
			<td>Used in 3.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>J61820.06</td>
			<td>Used in 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>612U96</td>
			<td>Used in 4.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Used in Table 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill. Used in 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic modification of cyanobacteria by conjugation using the cyanogate modular cloning toolkit

Siyanobakteriler, yararlı endüstriyel malların yenilenebilir üretimi için genetik olarak modifiye edilebilen çeşitli prokaryotik fotosentetik organizmalar grubudur. Sentetik biyolojideki son gelişmeler, sonraki dönüşüm veya konjuga transferiçin plazmid vektörleri oluşturmak için standart laştırılmış modüler klonlama sistemi olan CyanoGate gibi çeşitli klonlama araç kitlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Burada kendi kendini çoğaltan bir vektör (örneğin, floresan marker ekspresyon kaseti taşıyan) ve cyanobakteriyel suşları Synechocystis sp içine vektör konjugal transferi montajı için ayrıntılı bir yöntem anahat. uzun UTEX 2973. Buna ek olarak, bir plaka okuyucu veya akış sitometri kullanarak genetik bir parçanın (örneğin, bir organizatör) performansını karakterize etmek için nasıl anahat.

Golden Gate montaj iş akışını göstermek için, aşağıdaki Seviye 0 parçalarını içeren Düzey 1 pozisyonu 1 (İleri) alıcı vektöründe (pICH47732) bir ifade kaseti monte edildi: C-phycocyanin operon Pcpc560'ın organizatörü (pC0.005), eYFP (pC0.008) ve çift terminatör TrrnB (pC0.082)12için kodlama sırası. Montaj reaksiyonunun dönüşümünden sonra, E. coli kolonilerinin standart mavi-beyaz tara...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit at JoVE.com

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Burada, i) CyanoGate modüler klonlama araç kiti kullanarak kendi kendini çoğaltan bir vektör monte etmek açıklayan bir protokol sokulması, ii) konjugasyon ile bir siyanobakteriyel konak içine vektör tanıtmak ve iii) transgenik siyanobakteri suşları karakterize bir plaka okuyucu veya akış sitometri.

CyanoGate Modüler Klonlama Araç Kiti Kullanılarak Konjugasyon ile Siyanobakterilerin Genetik Modifikasyonu

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Siyanobakteriler giderek sentetik biyoloji ve yenilenebilir biyoteknoloji uygulamaları için yararlı platformlar olarak kabul edilmektedir fotosentetik mikropların önemli bir phylum vardır. Bu nedenle, heterolog DNA'nın farklı siyanobakteriyel türlere dönüştürülmesi, klonlama ve tanıtılması için sağlam teknikler geliştirmek önemlidir. Yani bu teknik, dna'yı doğal olarak dönüştürülebilen siyanobakteriyel türlere sokmak için konjugasyon veya üçlü eşleme adı verilen köklü bir yöntemi göstermektedir.Konjugasyon, tek hücreden çok hücreli filamentöz türlere kadar çok çeşitli siyanobakteriyel suşlarda başarıyla gerçekleştirilmiştir. Bu tekniği ilk kez deniyorsanız, hem siyanobakteriyel hem de E.coli suşlarınızı özenle ele almaya özen gösteriyorsunuz. Örneğin, protokolde verilen değerlerin üzerinde santrifüj yapmayın ve girdap yapmayın.Bakterileri ve Siyanobakterileri karıştırmak ilk kez kullananlar için garip görünebilir. Evlilik sürecini göstererek bunu açıklığa kavuşturmaya yardımcı olacağımızı umuyoruz. Birinci seviye montajların yapımından sonra, uygun düzeyde bir T acceptor vektörü seçin.Son düzey bir derlemenin üç asal ucunu T düzeyi omurgasına bağlamak için uygun bir bitiş bağlantısı seçin. T düzeyinde bir veya daha fazla seviye bir derlemeleri monte etmek için, PBI1 ve gerekli bitiş bağlantı vektörü ile bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Termal döngü programı ayarlayın ve el yazmasına göre devam edin.İlk gün, Synechocystis PCC 6803 veya Synechococcus uzatır UTEX 2973 taze bir kültür kurarak siyanobakteriyel kültür büyümek. Bir ısı steril döngü ile, axenic BG-11 agar plaka hücreleri kazıyın ve 100 mililitre konik şişe içine taze BG-11 orta 50 mililitre ile dolu içine yerleştirin aşılamak için. Synechocystis PCC 6803 hücre kültürlerini 100 RPM'de 30 santigrat derecede büyütmek için şişeyi aydınlatmalı sallayarak bir kuluçka makinesine yerleştirin.Synechococcus uzaması ulongatus UTEX 2973 için hücre kültürlerini 100 RPM'de 40 santigrat derecede büyütün. 1-2 gün sonra, hücre kültürünün bir mililitresini çizin ve spektrofotometreye ölçün. OD 750'deki absorbans 0,5 ila 1,5'e ulaşır.İkinci gün, mililitre başına 100 mikrogram ve mililitre de kloramfenikol konsantrasyonu ile lb orta beş mililitre lb orta vektörleri içeren bir MC1061 E.coli yardımcı suşu aşılamak mililitre başına 25 mikrogram. Bir sallayarak kuvöz de 225 RPM gecede 37 derece santigrat büyümek. Daha sonra seviye T kargo vektörü taşıyan E.coli kültürü ile uygun antibiyotikler içeren LB orta beş mililitre aşılayın.Bir sallayarak kuluçka 225 RPM gecede 37 derece santigrat kültür büyümek. Üçüncü gün, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3, 000 g de yardımcı ve kargo E.coli gece kültürleri santrifüj. Hücre peletini bozmadan süpernatant'ı atın.Antibiyotikler olmadan taze LB orta beş mililitre ekleyerek pelet yıkayın. Peleti yavaşça yukarı ve aşağı borulama ve supernatant kaldırmak için santrifüj ile askıya alın. Bu yıkama adımını bir gecede kültürden kalan antibiyotikleri çıkarmak için üç kez tekrarlayın.Son yıkamadan sonra, hücre peletini ilk kültür hacminin LB orta hacminin yarısı kadar yeniden askıya alın. Daha sonra yardımcı zorlanma 450 mikrolitre iki mililitretüp kargo zorlanma 450 mikrolitre birleştirmek ve oda sıcaklığında bırakın. Daha sonra, 1, 500 g oda sıcaklığında 10 dakika siyanobakteriyel kültürün bir mililitre santrifüj ederek siyanobakteriyel kültürü hazırlamak.Sonra hücre pelet rahatsız etmeden dikkatle supernatant atın. Aynı ilk hacimde taze BG-11 orta ekleyerek pelet dört kez yıkayın. Yıkanmış siyanobakteriyel kültürün 900 mikrolitresini iki mililitrelik bir tüpteki birleşik E.coli suşlarının 900 mikrolitresine ekleyin.Kültürleri yavaşça yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. Synechokisis PCC 6803 veya Synechococcus elongatus UTEX 2973 için iki saat oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya yatırın. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika 1, 500 g'da santrifüj edin.Supernatant 1.6 mililitre çıkarın ve kalan supernatant pelet resuspend. Antibiyotik olmadan bir LB BG-11 agar plaka üzerine bir 0.45 mikron membran filtre yerleştirin. Dikkatle steril bir yayıcı veya steril uçlu ile membran üzerinde E.coli / siyanobakteriyel kültür karışımı 200 mikrolitre yayılır.Plakayı parafin filmle kapatın ve plakayı 24 saat boyunca ışıklı bir kuluçka makinesine yerleştirin. 24 saat sonra, dikkatle taze bir BG-11 agar plaka kargo vektörü için seçmek için uygun antibiyotikler içeren alev steril forseps kullanarak membran aktarın. Plakayı parafin filmile kapatın ve koloniler ortaya çıkana kadar daha önce olduğu gibi aynı koşullarda kuluçkaya yatın.Koloniler genellikle Synechocystis PCC 6803 için 7-14 gün ve Synechococcus elongatus UTEX 2973 için 3-7 gün sonra görünür. Konjugatları seçmek için, bir ısı steril aşı çubuğu kullanarak, membran en az iki ayrı koloniler seçin ve uygun antibiyotik içeren yeni bir BG-11 agar plaka üzerine çizgi. Sonra bir cyanobakteriyel kültür bir çizgi bir 15 mililitre centrifuge tüp lb orta beş mililitre içeren ve 37 santigrat derece bir gecede 225 RPM bir sallayarak kuvöz de inkübatör bir çizgi aşılamak.Temiz kültür E.coli kontaminasyonunun yokluğunu doğruluyor. Yedi günlük yeterli büyüme süresini takiben, uzun süreli kriyo depolama veya sonraki deneyler için sıvı kültürleri kurmak için tek tek axenik koloniler seçin. Bu çalışmada Golden Gate montaj iş akışı gösterilmiştir.Montaj reaksiyonunun dönüşümünden sonra, E.coli kolonilerinin standart mavi beyaz taraması kullanılarak başarılı derlemeler tespit edildi. Düzey bir vektör ve bitiş bağlantısı bir vektör eYFP ifade kaseti daha sonra bir seviye T acceptor vektör içine vektör cpcBA-eYFP vermek için monte edildi. Monte cpcBA-eYFP vektör kısıtlama sindirim tarafından doğrulandı.CPCBA-eYFP veya pPMQAK1-T vektörünün başarılı konjugal transferi Synechocystis PCC 6803 ve Synechococcus uzada UTEX 2973 için membran üzerinde birkaç yüz kolonilerin büyümesi ile sonuçlandı. Güçlü Pcpc560 organizatörü için beklendiği gibi, plaka okuyucu ve akış sitometre den hücre başına EYFP floresannormalleştirilmiş eYFP floresan için değerler negatif kontrol ile karşılaştırıldığında yüksekti. Hem plaka okuyucu hem de akış sitometresi ile floresan değerleri Synechococcus uzamış UTEX 2973'te Synechocystis PCC 6803'e göre daha yüksekti.Hangi suşa göre minimum süre kuluçkaya yattığınızdan emin olun.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

Civciv Embriyo Sinir İndüksiyon için Testi

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Tükürük Bezi Organ Kültürleri Genetik Modifikasyon ve Rekombinasyon

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

Kemirgen Davranışı Üzerindeki Genetik Etkileri Sorgulamak için İkili İn Utero Elektroporasyonunu Kullanan Bir Boru Hattı

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...