Name: studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

[اريك] [اوبيل] كان مولت, جزئيا, بالامريكيه سرطان جمعيه دكتوراه زمالة (128770-بف-15-216-01-ليب]). وقد تم دعم العمل من خلال منحه من المعاهد القومية للصحة (R01-CA205398) وجائزه مؤسسه أبحاث سرطان الثدي (BCRF) إلى الصحة والسلامة.

وأجريت جميع الإجراءات المتعلقة بحصاد واستخدام الضامة murine البريتوني في جامعه نورث كارولينا في تشابل هيل (UNC) ووافقت عليها اللجنة المؤسسية للرعاية الحيوانية والاستخدام (IACUC) UNC.
1. الضامة الثقافة
ملاحظه: هذا الاجراء يمكن استخدام الضامة البريتوني الاساسيه (الموصو?...

<ol>
	<li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation.">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li><li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes.">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li><li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis:+a+potential+mechanism+of+immune+evasion.">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li><li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+(PD-L1)+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response.">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).</li><li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment.">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li><li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site.">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells.">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li><li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism.">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li><li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients:+a+mechanism+of+tumor+evasion.">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li><li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors.">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li><li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages:+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth.">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li><li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+macrophages:+from+mechanisms+to+therapy.">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).</li><li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells.">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).</li><li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response.">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li><li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells.">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).</li><li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+(Taxol)+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines.">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li></ol>

تحليل الثقافة المشتركة المقدمة هنا هو تعديل الاختبارات المحددة سابقا التي تسمح لدراسة العوامل التي تفرز الورم علي تنشيط الخلايا المناعية. في حين ان الاتصال بالخلايا الخلوية معروف للحث علي حدوث تغييرات في النشاط المناعي ، فان قدره الخلايا التي تفرز الورم لتعديل التنشيط المناعي اقل فهما. ?...

وقد ركزت الدراسات الحديثة علي قدره الخلايا السرطانية لتجنب الكشف عن طريق الخلايا المناعية ، وقمع التنشيط المناعي المحلي ، أو لإنتاج البيئة السرطانية المتسامحة التسامح في الورم المجهري. وقد وصفت فئتين واسعه من التفاعلات الورم والخلايا المناعية التي تسهل هذه الآثار: التفاعلات بوساطة الاتصال أو الأورام التي تفرز الورم. واحده من أكثر أليات المدروسة والعريكة سريريا لتثبيط المناعة بوساطة الاتصال المستخدمة من قبل الأورام هو التعبير عن pd-L1 ، الذي يتفاعل مع pd-1 علي الخلايا T لكبح تنشيطها ووظيفة1،2. ردا علي مضاد للفيروسات-غاما (IFNγ) ، الذي يعبر عنه عدد من الخلايا المناعية المنشطة ، يمكن ان تزيد الخلايا السرطانية من التعبير عن PD-L1 للحث علي استنفاد الخلايا التائية النشطة ، التالي منعها من الاستئصال الفعال للخلايا السرطانية3. استخدام الأجسام المضادة لمنع التفاعل بين PD-L1 و PD-1 يستخدم حاليا لعلاج أنواع السرطان متعددة في البشر4. وفي ضوء هذا النجاح السريري وغيرها ، حظي تحديد واستهداف أليات المناعة المستمدة من الورم باهتمام متزايد.
إلى جانب قمع المناعة التكيفيه ، ومن المعروف أيضا ان الأورام تفرز العوامل التي تقمع الاستجابات الموالية للالتهابات من الخلايا المناعية الفطرية. الخلايا السرطانية يمكن أيضا ان تفرز العوامل التي تحرف التوظيف والتمايز من الخلايا المشتقة من النخاع النخاعي في البيئة المجهرية الورم لتعزيز قمع T تنشيط الخلية8,9.
نوع واحد من الخلايا المناعية الفطرية التي لها تاثير عميق علي تقدم الورم هو الضامة. لسنوات عديده ، وقد استخدم وجود الضامة المرتبطة بالورم (TAMs) كنذير سلبيه لبقاء المريض10. وقد تم إدخال المفهوم الذي يثبط مناعة الخلايا المناعية التي تخفف من الأورام بوساطة الخلية أكثر من 40 سنه مضت11. في الاونه الاخيره, وقد ثبت ان الاستجابة الموالية للالتهابات الضامة يمكن ان تكون اقل تنظيما في حين ان النمط الظاهري الموالية للورم يمكن ان يكون مستحثا في البيئة المجهرية الورم. هذه الضامة المثبطة للمناعة يمكن ان تسهم في استجابه التحمل, القيادة الورم التقدم والمقاومة للعلاج الكيماوي-والعلاج المناعي12. النظر إلى ان الضامة هي في كثير من الأحيان واحده من الكريات البيضاء الأكثر وفره مع الورم ، واستعاده نشاطهم المناعي الخاصة الورم يمثل هدفا محتملا لعلاجات السرطان13.
في حين يمكن ان تكون علي غرار التفاعلات الاتصال بوساطة بين الخلايا السرطانية والضامة من خلال الزراعة المباشرة ، واستخدام يدعم غشاء نفاذيه يمكن توضيح العوامل التي تفرز الورم هي المناعية دون التاثير الذي يحتمل ان يكون الخلط من الخلايا المناعية الورم الخلية الاتصال. باستخدام أساليب مماثله إلى حد ما ، والبعض الآخر قد أظهرت امكانيه تحديد العوامل التي تفرز في التفاعلات العصبية/الخلايا الدقيقة14 وكذلك الأورام مع خلايا ميسوثيليال15. وقد استخدمنا أيضا بنجاح هذه التقنية المشتركة في الثقافة لتوصيف دور البروتين الذي يفرز الورم ، Pros1 ، كمثبط للتعبير الجيني الموالي للالتهابات بعد تحفيز الضامة الصفاقيه مع LPS ومضاد للفيروسات-جاما16. هنا نحن وصف منهجيه مباشره التي يمكن استخدامها لاستجواب كيفيه العوامل التي تفرز الورم يمكن ان تؤثر علي تنشيط الضامة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">B16-F10</td>
			<td style="width:244px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC CRL-6475</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774A.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5293-2ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine M-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pros1 ELISA</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS2886720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse IFN&#947;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>575302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensimix SYBR Low-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>QT625-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell permeable supports</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports

الإشارات paracrine المستمدة من الورم هو عنصر التغاضي عن كبت المناعة المحلية ويمكن ان يؤدي إلى بيئة متساهلة لاستمرار نمو السرطان والانبثاث. يمكن ان تتضمن إشارات paracrine اتصال خليه خليه بين أنواع الخلايا المختلفة ، مثل PD-L1 المعرب عنها علي سطح الأورام تتفاعل مباشره مع PD-1 علي سطح الخلايا T ، أو إفراز الليغاندس بواسطة خليه الورم للتاثير علي خليه مناعية. هنا نقوم بوصف طريقه الثقافة المشتركة للتحقيق في اثار الأورام التي يفرزها الورم علي تنشيط الخلية المناعية (الضامة). هذا الاجراء المباشر يستخدم المتاحة تجاريا 0.4 μm غشاء البولي يدعم نفاذيه ولوحات ثقافة الانسجه القياسية. في العملية الموصوفة ، يتم استزراع الضامة في الغرفة العليا والخلايا السرطانية في الغرفة السفلي. وجود حاجز 0.4 μm يسمح لدراسة الإشارات بين الخلايا دون متغير الخلط من الاتصال المادي ، وذلك لان نوعي الخلية تشترك في نفس المتوسط والتعرض للحجاب paracrine. ويمكن الجمع بين هذا النهج والآخرين ، مثل التغييرات الجينية في الضامة (علي سبيل المثال ، العزلة عن الفئران الوراثية) أو الورم (علي سبيل المثال ، التعديلات التي تتم بوساطة CRISPR) لدراسة دور العوامل والمستقبلات المحددة التي تفرزها. ويفسح النهج نفسه أيضا للتحليلات البيولوجية الجزيئية القياسية مثل النسخ العكسي الكمي لتفاعل البلمره المتسلسل (qRT-PCR) أو تحليل اللطخه الغربية ، دون الحاجة إلى الفرز الانسيابي للفصل بين الخليتين السكانيتين. المثل يمكن استخدام المقايسات المناعية المرتبطة بالانزيمات (ELISAs) لقياس الخلايا المفرزة لفهم التفاعل الديناميكي لإشارات الخلية في سياق نوع الخلية المتعددة بشكل أفضل. ويمكن أيضا ان تختلف مده الثقافة المشتركة لدراسة الاحداث المنظمة زمنيا. هذه الطريقة المشتركة للثقافة هي أداه قويه تسهل دراسة الإشارات التي تفرز الورم في السياق المناعي.

لتحديد تاثير الأورام التي يفرزها الورم علي الاستقطاب الضام ، تم استخدام الاجراء الموصوف. واستخدمت الضامة البريتوني مثقف في غياب الخلايا السرطانية السلبية (غير المعالجة = اليسار البعيد) وايجابيه (IFNγ و LPS حفزت = 2nd من اليسار) الضوابط (الشكل 2a). بدلا من ذلك ، كانت الضامة ال...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

هنا ، نقدم طريقه باستخدام يدعم غشاء نفاذيه لتسهيل دراسة عدم الاتصال الإشارات paracrine المستخدمة من قبل الخلايا السرطانية لقمع الاستجابة المناعية. النظام قابل لدراسة دور العوامل التي تفرز الورم في تنشيط الضامة الملطف.

دراسة اثار الورم الذي يفرز الأورام الليفية علي تنشيط الضامة باستخدام الثقافة المشتركة مع غشاء نفاذيه يدعم

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

يستخدم هذا الأسلوب Transwell المشتركة في الثقافة لدراسة إشارات الباراكرين المستخدمة من قبل الخلايا السرطانية لقمع الاستجابة المناعية. يمكن استخدام هذه الطريقة لاكتشاف اليغانندات المفرزة الجديدة ، وكذلك الأسس الآلية لآثارها القمعية المناعية. لقد استخدمنا هذه الطريقة سابقًا لإظهار كيف يمكن للعوامل التي يفرزها الورم أن تضعف النسخ الجيني المؤيد للالتهابات.ونحن نعتقد أن هذه الأداة لها آثار واسعة النطاق في دراسة قمع المناعة المستمدة من الورم. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يمكن استخدامها لدراسة إشارات الباراكرين بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية دون متغير يحتمل أن يكون مربكا من اتصال الخلايا إلى الخلية. هذه المنصة هي أيضا قابلة لمجموعة متنوعة من التقنيات البيولوجية الجزيئية لتحليل المصب.بعد حصاد الضامة البريتونية، لوحة لهم مباشرة في الغرف العليا من 0.4 ميكرومتر البوليستر غشاء إدراج ثقافة المشتركة ستة بئر لوحة. ثم يضاف DMEM إلى البئر بحيث تحتوي الغرفة العليا على ملليلتر واحد وتحتوي الغرفة السفلية على 1.5 ملليلتر. احتضان لمدة ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.أولاً، الخلايا السرطانية المتاحة تجارياً في الوسط الخاص بها، بعد اتباع أساليب زراعة الأنسجة الموصى بها. بعد ذلك، غسل الخلايا السرطانية المرتبطة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. إضافة 0.05٪ التربسين في EDTA واحتضان في 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا.ثم إعادة تعليق الخلايا في الوسائط التي تحتوي على FBS. استخدام عداد الهيموسيت أو عداد الخلية لكمية العدد الإجمالي للخلايا والطرد المركزي في 220 مرات G لمدة خمس دقائق إلى بيليه. أثناء الطرد المركزي، يُطرّح الوسط من الغرف العلوية والسفلى من الضامة التي تحتوي على لوحات دعم غشاء نفاذية واستبدالها بوسيلة جديدة.بالنسبة للغرف السفلية التي سيتم فيها وضع الخلايا السرطانية، املأ بميليلتر واحد من المتوسط بدلاً من 1.5 ملليلتر لترك حجم كاف لإضافة الخلايا. عندما يكون الطرد المركزي كاملاً، يُطلق التوسّط من خلايا الورم المُرَكَّب ويُعيد تعليق الخلايا في DMEM المكمَّلة بتركيز 300,000 خلية لكل ملليلتر. إضافة 0.5 ملليلتر من هذا تعليق الخلية إلى الغرفة السفلى من الآبار المطلوبة.للحث على التعبير الجيني الملتهب، علاج الضامة بشكل واحد أو مشترك في الثقافة عن طريق إضافة إنترفيرون غاما بتركيز 100 نانوغرام لكل ملليلتر و LPS بتركيز 50 نانوغرام لكل ملليلتر. تغيير مدة أوقات العلاج في الثقافة حسب الحاجة. يحدث تنشيط الضامة في غضون ساعتين ، ويحدث بعض الكبت بواسطة الورم من قبل ثماني ساعات.تنتج الثقافة المشتركة لمدة 24 ساعة قمعًا قويًا ومتسقًا مشتقًا من الورم. كتحكم سلبي، تُزرع الثقافة بشكلٍ غير مُعالج وتُترك دون علاج. وكتحكم إيجابي، تعامل الضامة ذات الثقافة الذاتية مع الانفيرون غاما و LPS بنفس التركيزات المستخدمة للعينات.بعد انقضاء وقت الحضانة المطلوب، عزل الخلية أو حالة ثقافة المتوسطة حسب الرغبة اعتماداً على احتياجات الاختبار. لعزل الخلية لتحلل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي، يُشعّر الوسيط من كلا غرف البئر ويغسل مرة واحدة بمليلترين من برنامج تلفزيوني. تطبيق RNA lysis المخزن المؤقت إلى الغرفة العلوية التي تحتوي على الضامة.بعد هذا، كشط بلطف الغشاء لإطلاق الخلية lysate ونقلها إلى أنبوب جمع لمزيد من المعالجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة RNA عزل عدة. تتضمن طريقة الثقافة المشتركة الموصوفة هنا ثقافة الضامة والخلايا السرطانية دون اتصال جسدي. وتستخدم الضامة البريتونية المستزرعة في غياب الخلايا السرطانية والضوابط السلبية والإيجابية.الضامة البريتونية المشتركة في الثقافة في وجود الخلايا السرطانية B16F10 ولكن دون تنشيط المحفزات لا تزيد من التعبير عن الجينات المرتبطة الموالية للالتهابات. وهذا يعني أن الأربطة التي تفرزها الأورام إما غير كافية للحث على التعبير الجيني المؤيد للالتهابات في حد ذاتها ، أو إذا كان هناك تنشيط مناعي عن طريق إفرازات الورم ، فإن أربطة الباراكرين كافية لقمعها إلى مستوياتها الأصلية. يوضح هذا الأسلوب المشترك في الثقافة أنه عندما يتم استزراع الضامة المستقطبة بواسطة الإنترفيرون جاما و LPS في وجود خلايا الورم ، تم تقليل قمع التعبير الجيني المرتبط بالالتهاب بنسبة تصل إلى 60 ٪ لوحظ مستوى مماثل من قمع الجينات الضامة المؤيدة للالتهابات عندما يتم استبدال خط خلية الضامة المورين J774 عن الضامة البريتونية.وقد حددت الأعمال السابقة البروتين S كعامل الورم التي يمكن أن تمنع تفعيل الضامة، لذلك يتم استخدام نموذج دعم الغشاء المشترك بالاقتران مع lysA لمقايسة تركيز البروتين S في وسائل الإعلام مكيفة بعد 24 ساعة. في وسائل الإعلام مكيفة من انترفيرون غاما وBPS المعالجة B16F10 خلايا الميلانوما، يتم التعبير عن البروتين S في تركيز ما يقرب من 475 نانوغرام لكل ملليلتر. الضامة البريتونية تعامل في نفس الظروف أعرب عن البروتين S في ما يقرب من 61 نانوغرام لكل ملليلتر.ومن المثير للاهتمام، عندما شارك في تربية، وتركيز البروتين S في غاما انترفيرون وLPS المعالجة بشكل جيد كان حوالي 86 نانوغرام لكل ملليلتر. وهذا يشير إلى أن إما الضامة استيعاب البروتين الذي يخفيه الورم S أو أن كمية البروتين S التي تفرزها خلايا B16F10 انخفضت بشكل كبير عندما يكون في وجود الضامة. هذه النتائج تسليط الضوء على التغيرات العميقة من تنشيط الضامة وإشارات الباراكرين عندما يتم زراعة الضامة مع الخلايا السرطانية.يمكن لطريقة Transwell المشتركة في الثقافة الإجابة على مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة بالإشارة الباراكرين. يمكن إجراء تحليل البقعة الغربية لتحديد كيفية تغيير البروتينات التي يتم الكشف عنها بالورم مسارات الإشارات المختلفة في الضامة.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

الاعتبارات العملية في دراسة الاستعمار الرئة المنتشر في أوستيوساركوما باستخدام مقايسة خبيث الرئوية

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

وصف ملحقات غشاء الخلية ودراسة أدوارهم في ديناميات التصاق خلايا السرطان

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

التصوير النهج لإجراء تقييمات للسمية الأكسدة باستخدام أجهزة استشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

آثار العوامل المشتقة من خلايا سرطان الجلد المزدوج على التمايز Adipocytes نخاع العظام

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة اللب والثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية لدراسة التفاعلات الخاصة بها

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

قياس إعادة عرض العظام وإعادة إنشاء بيئة الورم والعظام الدقيقة باستخدام ثقافة كالفاريا المشتركة والقياس الHISTOMORPHometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

دراسة آثار إشعاع الأنسجة الطبيعية باستخدام هيدروجيلات مصفوفة خارج الخلية

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

توصيف آثار مثبطات Migrastatic على غزو الورم 3D Spheroid من قبل عالية الدقة المجهرية البؤرية

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

الثقافة المشتركة للخلايا الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية المنقوشة لدراسة الهجرة والتفاعلات الخلوية

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...